CC BY
206
MM0)0lU4TUHCKja^4IMiMyH5O3Mio-l38 Оригинальные статьи
© 2006, СПб РО РААКИ
АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ПСОРИАЗЕ
Капулер О.М., Нелюбин Е.В., Каут Д.А.*, Сибиряк С.В.*
ОАО “Медицинская косметология”МЗ РБ, Уфа;
*Лаборатория иммунофармакологии и иммунотоксикологии института иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург - Уфа
Резюме. Обследованы 42 пациента с прогрессирующим вульгарным псориазом (средняя величина PASI равна 19,7 ± 1,5) и 40 условно-здоровых доноров. Установлено, что у больных псориазом увеличено количество CD4+ CD95+ Т- лимфоцитов в периферической крови, содержание которых положительно коррелирует с величиной PASI, и повышен уровень растворимого Fas рецептора (sFas) в сыворотке (1868,1 ± 186,8 пкг/мл против 1281,4 ± 142,5 пкг/мл у здоровых доноров, PLSD = 0.019). Интенсивность спонтанного апоптоза лимфоцитов и апоптоза, индуцированного антиFas МКА у больных псориазом аналогичны таковым у здоровых доноров, однако чувствительность лимфоцитов к апоптозу, индуцированному “оксидативным стрессом” (50 мкМ Н202, 4 часа) значимо снижается. При параллельной оценке структуры клеточного цикла (метахроматическое окрашивание акридиновым оранжевым), интенсивности апоптоза и экспрессии Fas-рецептора (двухпараметрическое окрашивание AnnV-FITC/антиFas МКА-PE) после кратковременной стимуляции митогеном (PHA-P, 5 мкг/мл, 24 часа) выявлено, что лимфоциты здоровых лиц и больных псориазом существенно не отличаются по митотической активности, интенсивности активационного апоптоза и величине активационно-индуцированной экспрессии Fas-рецептора. В то же время, соотношение между содержанием AnnV+CD95+ лимфоцитов и суммарным содержанием AnnV+ ФГА-активированных лимфоцитов при псориазе значимо снижалось, что свидетельствует об уменьшение “доли” Fas-зависимых механизмов апоптоза при активации клеток. Полученные данные подтверждают точку зрения, что в патогенезе псориатического процесса, как и в развитии других аутоиммунных заболеваний, важная роль принадлежит нарушениям “апоптотической реактивности” лимфоцитов.
Ключевые слова: спонтанный и индуцированный апоптоз лимфоцитов, растворимый Fas рецептор, псориаз.
Kapuler О.М., Nelyubin E.V., Kaut D.A., Sibiryak S.V.
LYMPHOCYTE APOPTOSIS IN PSORIASIS
Abstract. Forty-two patients with progressive vulgar psoriasis (PASI = 19.7 ± 1.5) and 40 healthy volunteers were under investigation. Psoriatic patients were characterized by increased number of CD4+ CD95+ peripheral blood T lymphocytes, which correlates with clinical psoriatic score, and by increased levels of soluble Fas (sFas) in serum, as compared to controls (resp., 1868.1 ± 186.8 pg/ml vs. 1281.4 ± 142.5 pg/ml, PLSD = 0.019). The levels of spontaneous lymphocyte apoptosis and anti-Fas (Mab)-induced apoptosis in psoriatic patients did not differ from the controls. However, apoptosis induced by “oxidative stress” (50 цМ Н202, 4 hrs) was depressed in the patients. Moreover, a simultaneous assessment of cell cycle structure (metachromatic staining with Acridine Orange), apoptosis and Fas receptor expression (AnnV-FITC/antiFas mAbs-PE staining) following a short-term mitogenic stimulation (PHA-P, 5 |Jg/ml, 24 hrs) were
performed. We found no marked differences in mitogenic reactivity, activation-induced apoptosis, and activation-in-
Adpec fan n.epenucKu: duced Fas receptor expression when studying lymphocytes
Cu6upHK Cepieu BjiadUMupo6'UH, Bmm., np<°<p., me. from healthy donors and psoriatic patients. However, PHA-
na6opamopueu UMMyH0^apMaK0n0iuu u activated lymphocytes from psoriatic patients displayed a
uMMyHomoKcuKrnrnuu MHO yp0 pAH,3ae omden°M significantly decreased ratio of AnnV+CD95+ to the total UMMyH0Ji0iuu Ory BcepoccuucKuu ^Hmp iJia3Hou u AnnV+ subpopulation, thus suggesting a decreased role of
nnacmmecKoU xupypiuu poc3dpaea. Fas-dependent mechanisms of apoptosis during the cell ac-
y<pa, 450075,yj. p. 3opie 67/1, Ory BU,rnx tivation. The data obtained confirm a view, that an abnor-
Poc3dpaea, omdej UMMymjoiuu, mal lymphocyte “apoptotic reactivity”, which plays a cru-
Tej.: 3472 - 329-942,3472 - 517-193, cial role in the mechanisms of autoimmunity, may also of
M.m. 891734904", 89019524623. importance in the pathogenesis of psoriasis. (Med. Immu-
E-maiU srgsib@mail.ru no(, 2006, vol.8, № 4, pp 531-538)
Введение
Иммунопатогенезу псориаза посвящено множество работ. Это неудивительно, поскольку псориаз, описанный впервые более 2000 лет тому назад, является самым распространенным хроническим дерматозом, - этим заболеванием страдают 2-3 % населения земного шара, а существующие методы терапии не всегда приводят к желаемому эффекту. Псориаз очень часто сопровождается не только поражением кожи, но и артритом, очень сходным по проявлениям с серонегативным ревматоидным артритом (10-30% больных), синдромом Крона [12]. Не случайно поэтому, что ряд авторов считает более правильным характеризовать этот дерматоз, как псори-атическую болезнь [4]. В течение многих лет псориаз рассматривали исключительно как патологию кожи, сопутствующие иммунологические нарушения считались вторичными. Сегодня точка зрения изменилась, псориаз рассматривается как ТЬ1-зави-симое аутоиммунное заболевание, а иммунологическим нарушениям отводится приоритетная роль в его патогенезе [20].
Программированная смерть клеток путем апоп-тоза является одним из основных механизмов регуляции клеточного гомеостаза. Множество исследований свидетельствуют о нарушении терминальной дифференцировки и снижении апоптоза кератино-цитов при псориазе, - в кератиноцитах псориатичес-кой бляшки увеличивается экспрессия антиапопто-генных белков, снижается экспрессия проапоптоген-ных белков и чувствительность кератиноцитов к апоптогенным сигналам [1, 5, 20, 26]. Адекватный баланс между позитивной активацией лимфоцитов (пролиферацией, клональной экспансией) и их “негативной” активацией (апоптозом) является основным принципом функционирования иммунной системы [3, 6, 16]. Нарушения апоптотической регуляции выявляются при многих аутоиммунных заболеваниях, - системной волчанке, ревматоидном артрите, рассеянном склерозе и пр., однако исследования, посвященные нарушениям апоптоза лимфоцитов при псориазе, довольно малочисленны [4,
7, 23].
В настоящей работе представлены результаты оценки экспрессии Fas-рецептора на СЭ4+ Т-лим-фоцитах периферической крови, уровень сывороточного Fas-рецептора (sFas), спонтанный апоптоз и чувствительность лимфоцитов периферической крови к индуцированному апоптозу, характер активационного апоптоза у пациентов с прогрессирующим вульгарным псориазом.
Материалы и методы
Иммунологическое исследование проведено у 42 больных вульгарным псориазом (прогрессирующая стадия, среднетяжелое течение) и 40 условно-здо-
ровых доноров. Группа больных псориазом состояла из 70% мужчин и 30% женщин, средний возраст 41,2 ± 2,3 года. У 12 пациентов (28,5%) диагностирован псориатический артрит. Средняя величина псориатического индекса (PASI -psoriasis aeria and severity index) составила 19,7 ± 1,5. Группа условно-здоровых доноров (контрольная группа) состояла из 60% мужчин и 40% женщин, средний возраст
- 40,1 ± 1,8 лет. Группа включала лиц, которые на момент обследования не страдали острыми инфекционными заболеваниями и у которых, судя по анамнестическим данным, не выявлялись инфекционный, аутоиммунный и лимфопролиферативный синдромы. 14% доноров отмечали в анамнезе аллергические реакции на пищевые продукты и лекарства.
Взятие крови для иммунологического обследования (пункция локтевой вены) осуществляли в утренние часы строго натощак, - 2 мл крови помещали в пробирку VACUTAINER, содержащую ди-натриевую соль ЭДТА (BD) для иммунофенотипи-рования, 5 мл крови помещали в пробирку VACUTAINER, содержащую литиевую соль гепарина, для последующего выделения мононуклеаров и оценки апоптоза в краткосрочных культурах. Иммунологическое обследование проводилось незамедлительно после поступления пациента в стационар, до начала терапии.
Оценку содержания CD4+CD95+ лимфоцитов в периферической крови осуществляли стандартным методом прямого двухпараметрического иммуно-флюоресцентного окрашивания. Использовали FITC-меченные МКА против CD4 (анти CD4-FITC, IgG2a, Caltag Lbs.) и меченные PE антитела против CD95, (анти CD95-PE, IgG1, Caltag Lbs.). Контрольные пробы инкубировали с FITC- или PE-ме-ченными иммуноглобулинами соответствующего изотипа (мышиные IgG2a - FITC и мышиные IgG1-PE, Caltag Lbs.). Цитофлюориметрию осуществляли на проточном цитометре FACSCalibur (BD), при этом регистрировали суммарно не менее 10.000 событий. Полученные данные анализировали в рамках программы CellQuest.
Мононуклеары периферической крови выделяли стандартным методом градиентного центрифугирования (HIST0PAQUE-1077, Sigma, St. Louis).
Для оценки спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови, выделенные мононуклеары ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma, St. Louis) без добавления сыворотки и инкубировали 4 часа (37°C, 5% CO2) с антиFas МКА (мышиные IgM МКА против Fas-рецептора человека, 500 нг/106 кл, BD) или перекисью водорода (конечная концентрация 50 мкМ). Инкубацию осуществляли в пробирках для проточной цитометрии (Falcon). Через 4 часа оценивали апоп-тоз лимфоцитов с помощью стандартного метода окрашивания FITC-меченным Аннексином
contr.Ofrl
чг -j
<=> -d
“■ п
concr.OO^
■
■ ramlcL
Я. >>'■.#
1 2:
101 10£
Ann V-FI ТС
10'
10
h202.005
FSC-Heipht
h202.005
10 10 10 AnnY-FITC
fas .006
fas 006
rn—| i i i i—| i i i i—| i i i i—| i i i—q
200 400 600 800 1000
FSC-Height
10' 10" io-
AnnV-FITC
Рис. 1. Цитофлюорограммы, иллюстрирующие апоптоз лимфоцитов периферической крови донора, индуцированного пероксидом (конечная концентрация 50 цМ) (средний ряд) и мышиными 1дМ-МКА против Fas-рецептора человека (нижний ряд). Верхний ряд - контрольные культуры.
V (FITC-AnnV, Caltag Lbs.) и йодистым пропиди-ем (PI, Applechem) [15]. При установке калибровочных параметров и величин компенсации осуществляли цитометрию неокрашенных клеток, клеток, окрашенных только Ann V и клеток, окрашенных только йодистым пропидием. Полученные данные анализировали в рамках программы CellQuest. Типичную цитофлюорограмму иллюстрирует рисунок 1.
Митогенез и активационный апоптоз оценивали в краткосрочных 24-часовых культурах лимфоцитов. Культивирование клеток осуществляли в плоскодонных 24-луночных планшетах (Costar) при следующих условиях - среда RPMI-1640 (Sigma St.Louis), ЭТС - 5% (Sigma St.Louis), 37°C, 5% CO2,
1,0 - 1,5 х 106 кл/мл, общий объем 1 мл. В качестве митогена использован ФГА (PHA-P, Difco, 5 мкг/ мл). После культивирования часть клеток (0,5 мл) использовали для оценки митогенеза клеток методом метахроматического окрашивания акридиновым оранжевым [11]. Другую часть клеток однократно отмывали раствором CellWash с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) и затем ресуспендировали в 200 мкл этого же раствора. Клетки окрашивали PE меченными МКА против CD95 в течение 15 мин, однократно отмывали раствором CellWash, затем ресуспендировали в “связывающем” буфере (10 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH=7,4), содержащим FITC-
Контрольные культуры
Клеточный цикл
CGntr.fl 01
“I—I I I | I I I I—| I I—I I | I I I I—|—I I I—гр
0 200 4Й0 600 S00 1000
RNA content
ФГА-Р 5 мкг/мл
Апоптоз/ экспрессия CD95
согИг.ООЗ
■п.......1 ....■' 2....''3.....4 4
10и 101 1<Г Ж 10ч
AnnV-FITC
Клеточный цикл
Апоптоз/ экспрессия CD95
PH А.ОМ
РИА сошегк
Рис.2. Типичная цитофлюорограмма (здоровый донор), иллюстрирующая митогенез лимфоцитов периферической крови в краткосрочной культуре (метахроматическое окрашивание акридиновым оранжевым, по оси ординат - относительное содержание ДНК, по оси абсцисс - относительное содержание РНК), апоптоз и экспрессию Fas-рецептора. Верхний ряд - контрольные культуры; нижний ряд - ФГА-Р, 5 мкг/мл.
Ann V (1 мкг/мл), и через 5 мин осуществляли ци-тофлюорометрию. Контролем служили клетки, инкубированные с мечеными изотипическими мышиными иммуноглобулинами (IgG1- PE, Caltag Lbs.) и клетки, инкубированные с иммуноглобулинами и FITC- Ann V. Типичные цитофлюорограммы, полученные при оценке клеточного цикла, активационного апоптоза и экспрессии CD95, иллюстрирует рисунок 2.
Оценку содержания сывороточного растворимого Fas-рецептора (sFas) проводили иммунофермен-тным методом с использованием стандартной тест-системы human sAPO-1/Fas ELISA BMS245 (Bender MedSystems). При проведении ИФА руководствовались рекомендациями фирмы-производителя.
ИФА осуществляли на анализаторе Multiscan Plus (Labsystems).
Поставка реактивов, моноклональных антител и тест-систем осуществлялась ЗАО “БиоХимМак” (Москва), ООО “БиоЛайн” (Санкт-Петербург), ООО “Диаэм”(Москва).
Статистическая обработка результатов произведена в рамках программного обеспечения Statistica для Windows (версия 6.0). Различия считали статистически значимыми при P < 0,05. В процессе статистической обработки использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), для сравнения значимости различий между группами применяли LSD-критерий (PLSD), а для сравнения внутригрупповых различий -непараметрический критерий Вилкоксона (PW).
Рис. 3. Спонтанный уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови, апоптоз лимфоцитов индуцированный пероксидом (Н202, конечная концентрация 50 цМ) и мышиными 1дМ-МКА против Fas-рецептора человека у здоровых доноров и больных псориазом. Данные представлены, как М ± доверительный интервал для в = 0,95
Результаты
Экспрессия Fas-рецептора на лимфоцитах периферической крови и уровень sFas рецептора в сыворотке крови у больных псориазом
Содержание СЭ4+ лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор (СВ4+СЭ95+) в периферической крови и содержание растворимого Fas-рецептора в сыворотке у пациентов с псориазом и у здоровых доноров иллюстрирует таблица 1. В группе пациентов с псориазом среди СЭ4+ Т лимфоцитов, статистически значимо возрастала доля лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор - содержание СВ4+СЭ95+ лимфоцитов на 19% превышало таковое в донорской группе. Была установлена слабая, но статистически значимая (КСпирмана = + 0,22, Р =
0,044) непараметрическая корреляция между величиной РАБ1 и содержанием СВ4+СЭ95+ лимфоцитов.
Уровень sFas в группе больных псориазом был значимо выше, нежели в группе доноров; корреляции между этим показателем и величиной псориа-тического индекса установлено не было.
Спонтанный апоптоз лимфоцитов периферической крови и их чувствительность к апоптозу, индуцированному антиFas МКА и пероксидом у больных псориазом
Интенсивность спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов с прогрес-
сирующим псориазом и у здоровых доноров значимо не различалась (рис. 3). 4-часовая инкубация лимфоцитов периферической крови доноров с аFas МКА практически не изменяла содержания апото-тирующих клеток, - индекс индукции апоптоза (отношение числа апоптотирующих лимфоцитов в культурах с индуктором, к таковому в контрольных культурах) составил 1,36 ± 0,80. Аналогичная картина наблюдалась и в группе пациентов с псориазом, - после добавления аFas МКА значимого возрастания числа апоптотирующих лимфоцитов не было. Добавление пероксида приводило к индукции апоптоза лимфоцитов; в культурах лимфоцитов здоровых доноров в среде, содержащей 50 |j,M Н202, содержание Ann V+ клеток возрастало практически в 2 раза, в сравнении с контрольными культурами (PW= 0,0002), индекс апоптоза составил 2,10 ± 0,30. У больных псориазом пероксид также индуцировал апоптоз (PW = 0,011), однако чувствительность клеток к апоптозу, индуцированному оксидативным стрессом, и величина индекса апоптоза были статистически значимо ниже, чем у доноров (PLSD = 0,01).
Активационный апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных псориазом
Стимуляция клеток ФГА вызывала активацию митогенеза лимфоцитов, причем статистически значимых межгрупповых различий в показателях ми-тогенеза выявлено не было (табл. 2). Следует отметить, однако, тенденцию к снижению доли покоя-
Табл.1. СОДЕРЖАНИЕ CD4+CD95+ ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И УРОВЕНЬ РАСТВОРИМОГО Fas РЕЦЕПТОРА У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И ПАЦИЕНТОВ С ПРОГРЕССИРУЮЩЕЙ СТАДИЕЙ ВУЛЬГАРНОГО ПСОРИАЗА
Группа Содержание CD4+CD95+ лимфоцитов, % Уровень sFas, пкг / мл
Здоровые доноры 24,5 ± 0,9 1281,4 ± 142,5
29,1 + 1,4 1868,1 ± 186,8
Псориаз Plsd = 0,007 Plsd = 0,019
Показатели представлены, как M ± m
Табл. 2. ФГА-ИНДУЦИРОВАННЫЙ МИТОГЕНЕЗ, АКТИВАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ Fas (CD95) РЕЦЕПТОРА И Fas-ЗАВИСИМЫЙ АПОПТОЗ В 24-ЧАСОВОЙ КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ
Группа Митогенез (относительное содержание клеток, %) Экспрессия Fas (CD95+) лимфоциты, % Апоптоз
Спонт. ФГА-индуц. ь і о п О ФГА-индуц. Ann V+ лимфоциты, % Ann V+СD95+ лимфоциты, %
i- н о с О ФГА-индуц. 1- н о с О ФГА-индуц.
Go G1 SG2 M Go G1 SG2 M
Здоровые доноры <N -н со ,3 8 4, ,0 -н со 3, 0 0, -н 4 9, 0, -н ,8 5 -н сп ,8 3 3, 0, -н 5 8, 3, 3, -н о ,2 2 44,9 ± 5,5 Pw = 0,001 О, -н Ю ,0 37,3 ± 4,8 Pw = 0,001 0, -н со 5, 22,8 ± 3,7 Pw = 0,001
Псориаз со -н (N ,9 4, ,0 -н (N 3, 0, -н 0, со -н к 5 со -н к 0 3, 0, -н 6 5, 3, со 3, -н со ,5 30,8 ± 5,3 Pw = 0,006 Plsd=0,07 -н ,0 36,6 ± 3,5 Pw = 0,001 ,0 -н со 3, 16,6 ± 3,1 Pw = 0,001
PW - в сравнении с показателями в нестимулированных культурах; PLSD - межгрупповые различия
щихся GO-лимфоцитов в культурах лимфоцитов больных псориазом и, как следствие, тенденцию к снижению митотического потенциала клеток. Активация лимфоцитов доноров ФГА закономерно усиливала экспрессию CD95 - содержание Fas-экс-прессирующих лимфоцитов в культуре возрастало в 2 раза (PW = 0,001). Более чем трехкратно нарастало и содержание клеток, находящихся в ранней фазе апоптоза (PW = 0,001), причем большая часть апоп-тотирующих клеток экспрессировали Fas-рецептор,
- отношение числа Ann V+CD95+ лимфоцитов ко всем апоптотирующим клеткам составило в группе доноров 0,62 ± 0,05 (более 60%), а отношение числа Ann V+CD95+ лимфоцитов ко всем Fas-позитивным лимфоцитам составило 0,55 ± 0,06 (55%). У пациентов с псориазом спонтанная и индуцированная ФГА экспрессия Fas была несколько ниже, чем у здоровых лиц, однако статистически значимых различий выявлено не было. Спонтанное и индуцированное активацией содержание апоптотирующих лимфоцитов было аналогично таковым у здоровых лиц. Содержание AnnV+CD95+ лимфоцитов, как в неинду-цированных ФГА, так и в индуцированных ФГА культурах было несколько снижено и поэтому отношение числа этих клеток к общему числу Fas-эксп-
рессирующих клеток было таким же, как у доноров
- 0,59 ± 0,05. В то же время, отношение содержания AnnV+CD95+ лимфоцитов ко всем апоптотирую-щим клеткам было статистически значимо ниже, нежели в донорской группе и составило 0,42 ± 0,05 (Plsd = 0,02).
Обсуждение
В настоящее время патогенез большинства аутоиммунных расстройств интерпретируется в контексте нарушений апоптотической регуляции. Программированная клеточная смерть путем апоптоза играет ключевую роль как в элиминации аутореактивных клонов в процессе онтогенеза, так и обеспечении периферической толерантности. Дефекты апоптоза активированных лимфоцитов, в основном, Fas-зависимых механизмов выявлены при многих аутоиммунных заболеваниях. Эти нарушения могут быть сопряжены с генетическим дефектом Fas и FasL, ингибиторов апоптоза (с-FLIP), повышением уровня sFas, нарушением элиминации апоптоз-ных телец (дефект C1q) с последующей презентацией аутоантигенов дендритными клетками и пр. Во всех случаях неконтролируемая активация и
элиминация лимфоцитов приводит к аутоагрессии. Можно ли рассматривать псориаз в числе других аутоиммунных заболеваний как “патологию апоп-тоза лимфоцитов”? Обнаруженное повышение содержания в CD4+ Т-хелперов, экспрессирующих CD95, в периферической крови больных псориазом, описано неоднократно и другими исследователями [4], является закономерным проявлением активации иммунной системы и характерно для многих имму-новоспалительных процессов. Fas рецептор, который, безусловно, является основным “апоптоген-ным” рецептором, появляется на мембране лимфоцитов на ранних этапах их активации и необходим как для реализации программы рецепторного апоп-тоза, так и для митогенеза клеток [8]. Дальнейшая судьба Fas-экспрессирующих клеток зависит от многих факторов (цитокинового микроокружения, наличия ко-стимулирующих сигналов, экспрессии внутриклеточных про - и антиапоптогенных белков и т.д.) [16]. Именно поэтому, несмотря на количественное увеличение содержания CD4+CD95+ лимфоцитов у пациентов с псориазом, мы не обнаружили ни усиления спонтанного апоптоза лимфоцитов, ни повышения их чувствительности к Fas-индуци-рованному апоптозу в системе in vitro. В то же время в группе больных наблюдалось отчетливое повышение уровня сывороточного растворимого Fas-рецептора. Этот результат согласуется с данными Seshima и соавторов [23], которые обнаружили повышение уровня sFas у пациентов с пустулезным псориазом, однако в этой работе отмечалась корреляция уровня sFas с тяжесть процесса. sFas является продуктом альтернативного сплайсинга mRNA Fas рецептор и протеолитического отщепления трансмембранного Fas рецептора [9]. Повышение уровня sFas обнаружено и при других аутоиммунных заболеваниях: СКВ, ревматоидном артрите, дерматомиозите, системном склерозе, синдроме Сьег-рена, ANCA-позитивном системном васкулите, гломерулонефрите [10, 19, 21, 24]. Существует точка зрения, что sFas ингибирует апоптоз и элиминацию активированных лимфоцитов, что способствует формированию аутоагрессивных клонов [22]. Есть, однако, мнение, отрицающее патогенетическую роль sFas при аутоиммунных процессах [14]. Как бы то ни было, нарушение механизмов Fas-зависимого апоптоза при псориазе, скорее всего, присутствует. В модельной системе in vitro, при активации ФГА, у больных псориазом не было значимых изменений структуры клеточного цикла и суммарной интенсивности активационного апоптоза, но “доля” Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов значимо снижалась. Есть данные, что в псориатической бляшке снижается интенсивность Fas-зависимой апоптотической гибели мигрирующих в кожу активированных СD95+ лимфоцитов, что, однако, связывается с гипоэкспрессией Fas лиганда кератиноцитами [7].
Об измененной апоптотической реактивности лимфоцитов при псориазе свидетельствует и увеличение резистентности лимфоцитов к апоптозу, индуцированному Н202, в реализации которого, как известно, принимают участие редокс-чувствительные регуляторные белки и мембранные стресс-киназы [13, 27]. Интересно, что в последние годы важная роль в формировании псориатической бляшки отводится мигрирующим в кожу CD4+CD45RO+ CXR3+ Т лимфоцитам, содержание которых в периферической крови больных псориазом, как по нашим данным [2], так и по данным других исследователей [18, 25], существенно возрастает. Известно, что CD45RO+ Т лимфоциты характеризуются высокой внутриклеточной экспрессией у-глютамилт-ранспептидазы и поэтому малочувствительны к ок-сидативному стрессу и Н202- [17].
В конце 90-х годов прошлого века была сформулирована концепция “апоптотического иммунодефицита” [3], в которой впервые иммунопатологические состояния рассматривались с позиций нарушения баланса между “позитивной” и “негативной” активацией. В контексте этой концепции любые проявления аутоагрессии рассматривались как дефицит “негативной активации”. Проведенное исследование свидетельствует, что псориаз не является исключением из правила и подтверждает наличие неких универсальных, типовых механизмов формирования аутоагрессии.
Выводы
1. Прогрессирующая стадия вульгарного псориаза сопровождается увеличением количества CD4+ CD95+ Т лимфоцитов в периферической крови, содержание которых коррелирует с тяжестью процесса, но не сопровождается увеличением интенсивности спонтанного апоптоза и апоптоза, индуцированного анти Fas МКА.
2. В прогрессирующей стадии вульгарного псориаза выявляется повышение уровня продукта альтернативного сплайсинга mRNA Fas рецептора - растворимого Fas рецептора (sFas) в сыворотке крови, содержание которого не зависит от тяжести процесса.
3. При вульгарном псориазе выявляются нарушения “апоптотической реактивности” лимфоцитов периферической крови, которые выражаются в снижении чувствительности лимфоцитов к апоптозу, индуцированному оксидативным стрессом и снижением “доли” Fas-опосредованных механизмов апоп-тоза при активации лимфоцитов.
Благодарности
Авторы статьи выражают благодарность канд. биол. наук Н.Н. Курчатовой и канд. биол. наук
Р.Ш. Юсуповой за помощь при выполнении исследования.
Список литературы
1. Казанцева И. А. Апоптоз и его роль в патологии кожи // Российский журнал кожных и венерических болезней - 2000. - №4. - С. 17-22.
2. Капулер О.М., Каут Д.А., Сибиряк С.В. Суб-популяционная структура лимфоцитов при псориазе // Иммунология Урала (Материалы IV конф. Иммунологов Урала). - 2005. - № 1(4) - С. 61-62.
3. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Новые иммуно-патогенетические взгляды: апоптотические иммунодефициты // Иммунология. - 1998. - № 6. - С. 17-18.
4. Кунгуров Н.В., Филимонкова Н.Н., Тузанки-на И.А. Псориатическая болезнь. - Екатеринбург: Изд-во Урал. Ун-та, 2002. - 200 с.
5. Новиков А.И., Кононов А.В., Охлопков В.А., Правдина О.В. и др. Иммунохимические исследования при псориазе // Вестн. дерматол. венерол. -2003. - № 3. - C. 26-28.
6. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. - 1996. - № 6. - С. 10 - 23.
7. Arnold R., Seifert M., Asadullah Kh., Dieter H. et al. Crosstalk between keratinocytes and T lymphocytes via Fas/Fas ligand Interaction: Modulation by Cytokines processes //J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P.7140 - 7147.
8. Budd R. Death receptors couple both cell proliferation and apoptosis // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 109. - P.437-450.
9. Cheng J., Zhou T., Liu C., Shapiro J. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule // Science - 1994. - Vol. 263. - P. 1759-1762.
10. Christensson M., Pettersson E., Eneslatt K. et al. Serum sFAS levels are elevated in ANCA-positive vasculitis compared with other autoimmune diseases // J. Clin Immunol. - 2002.- Vol. 22. - P. 220-227.
11. Darzynkiewicz Z. Simultaneous analysis of cellular RNA and DNA content // Meth. Cell Biol. - 1994.
- Vol. 41. - P. 401-420.
12. Gladman D. Discussion: Clinical features, epidemiology, classification criteria, and quality of life in psoriasis and psoriatic arthritis // Ann. Rheum. Dis. -2005. - Vol.64. - P.24-25.
13. Hildeman D., Mitchell Th., Kappler J., Marrack Ph. T cell apoptosis and reactive oxygen species // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol. 111. - P. 575-581.
14. Knipping E., Krammer P., Onel K. et al. Levels of soluble Fas/APO-1/CD95 in systemic lupus erythematosus and juvenile rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. - 1995. - Vol. 38. - P. 1735-1737.
15. Koopman G., Reuterlingsperger C., Kiijten G., Keehnen R. et al. Annexin V for flow cytometric detec-
tion of phosphatidylserine expression of B cells undergoing apoptosis // Blood. - 1994. - Vol. 84. - P. 1415 - 1420.
16. Krammer P. CD95’s deadly mission in the immune system // Nature. - 2000. - Vol. 407. - P. 789 - 795.
17. Lahdenpohja N., Naive H. (CD45RA+) T lymphocytes are more sensitive to oxidative stress-induced signals than memory (CD45RO+) cells // Cell Immunol. - 1996. - Vol. 173. - P. 282-286.
18. Lecewicz-Torun B., Pietrzak A., Rolinski J., Brzozowski W. The peripheral blood lymphocyte pattern in psoriasis proceeded by an infection // Med. Sci. Monit. - 2001. - Vol.7. - P. 889-893.
19. Lorenz H., Grunke M., Hieronymus T. et al. In vitro apoptosis and expression of apoptosis-related molecules in lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases // Arthritis Rheum. - 1997 . - Vol. 40. - P. 306-317.
20. Nickoloff B., Nestle O. Recent insights into the immunopathogenesis of psoriasis provide new therapeutic opportunities // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol. 113. -P.1664-1675.
21. Nozawa K., Kayagaki N., Tokano Y. Et al. Soluble Fas (APO-1, CD95) and soluble Fas ligand in rheumatic diseases // Arthritis Rheum. - 1997. - Vol. 40. -P. 1126-1129.
22. Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-ter-minal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. -1996. - Vol. 156. - P. 4622-4630.
23. Seishima M., Seishima M., Takemura M., Saito K. et al. Increased serum soluble Fas, tumor necrosis factor alpha and interleukin 6 concentrations in generalized pustular psoriasis // Dermatology.- 1998. - Vol. 196. - P.371-372.
24. Van der Linden M., T Van Lopik T., L A Aarden L. et al. Soluble CD95 concentrations are increased in patients with severe systemic lupus erythematosus, but not in their first degree relatives //Ann. Rheum. Dis. -Vol. 2001. - Vol. 60. - P. 237-241.
25. Vissers W., Arndtz C., Muys L., Van Erp P. et al. Memory effector (CD45RO+) and cytotoxic (CD8+) T cells appear early in the margin zone of spreading psoriatic lesions in contrast to cells expressing natural killer receptors, which appear late // Br. J. Dermatol. - 2004.
- Vol. 150. - P. 852-859.
26. Wrone-Smith T., Johnson T., Nelson B., Boise L. et al. Discordant expression of Bcl-x and Bcl-2 by kera-tinocytes in vitro and psoriatic keratinocytes in vivo // Amer. J. Pathol. - 1995. - Vol. 146. - P.1079 -1088.
27. Zhuang Sh, Demirs J., Kochevar I. p38 Mitogen-activated Protein Kinase Mediates Bid Cleavage, Mitochondrial Dysfunction, and Caspase-3 Activation during Apop-tosis Induced by Singlet Oxygen but Not by Hydrogen Peroxide // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 25939-25948.
поступила в редакцию 20.01.2006 принята к печати 02.02.2006
