Научная статья на тему 'Апоптоз лимфоцитов при псориазе'

Апоптоз лимфоцитов при псориазе Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
1182
207
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
СПОНТАННЫЙ И ИНДУЦИРОВАННЫЙ АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ / РАСТВОРИМЫЙ FAS РЕЦЕПТОР / ПСОРИАЗ

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Капулер О. М., Нелюбин Е. В., Каут Д. А., Сибиряк Сергей Владимирович

Обследованы 42 пациента с прогрессирующим вульгарным псориазом (средняя величина PASI рав на 19,7 ± 1,5) и 40 условноздоровых доноров. Установлено, что у больных псориазом увеличено количество CD4+ CD95+ Т лимфоцитов в периферической крови, содержание которых положительно коррелирует с вели чиной PASI, и повышен уровень растворимого Fas рецептора (sFas) в сыворотке (1868,1 ± 186,8 пкг/мл против 1281,4 ± 142,5 пкг/мл у здоровых доноров, PLSD = 0.019). Интенсивность спонтанного апоптоза лимфоцитов и апоптоза, индуцированного антиFas МКА у больных псориазом аналогичны таковым у здоровых доноров, одна ко чувствительность лимфоцитов к апоптозу, индуцированному оксидативным стрессом (50 мкМ Н202, 4 часа) значимо снижается. При параллельной оценке структуры клеточного цикла (метахроматическое окрашивание акридиновым оранжевым), интенсивности апоптоза и экспрессии Fasрецептора (двухпараметрическое окраши вание AnnVFITC/антиFas МКАPE) после кратковременной стимуляции митогеном (PHAP, 5 мкг/мл, 24 часа) выявлено, что лимфоциты здоровых лиц и больных псориазом существенно не отличаются по митотической активности, интенсивности активационного апоптоза и величине активационноиндуцированной экспрессии Fas рецептора. В то же время, соотношение между содержанием AnnV+CD95+ лимфоцитов и суммарным содержани ем AnnV+ ФГАактивированных лимфоцитов при псориазе значимо снижалось, что свидетельствует об умень шение доли Fasзависимых механизмов апоптоза при активации клеток. Полученные данные подтверждают точку зрения, что в патогенезе псориатического процесса, как и в развитии других аутоиммунных заболеваний, важная роль принадлежит нарушениям апоптотической реактивности лимфоцитов.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Капулер О. М., Нелюбин Е. В., Каут Д. А., Сибиряк Сергей Владимирович

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

LYMPHOCYTE APOPTOSIS IN PSORIASIS

Fortytwo patients with progressive vulgar psoriasis (PASI = 19.7 ± 1.5) and 40 healthy volunteers were under investigation. Psoriatic patients were characterized by increased number of CD4+ CD95+ peripheral blood T lymphocytes, which correlates with clinical psoriatic score, and by increased levels of soluble Fas (sFas) in serum, as compared to controls (resp., 1868.1 ± 186.8 pg/ml vs. 1281.4 ± 142.5 pg/ml, PLSD = 0.019). The levels of spontaneous lymphocyte apoptosis and antiFas (Mab)induced apoptosis in psoriatic patients did not differ from the controls. How ever, apoptosis induced by "oxidative stress" (50 µM Н202, 4 hrs) was depressed in the patients. Moreover, a simultaneous assessment of cell cycle structure (metachromatic staining with Acridine Orange), apoptosis and Fas receptor expression (AnnVFITC/antiFas mAbsPE staining) following a shortterm mitogenic stimulation (PHAP, 5 µg/ml, 24 hrs) were performed. We found no marked differences in mitogenic reactivity, activationinduced apoptosis, and activationin duced Fas receptor expression when studying lymphocytes from healthy donors and psoriatic patients. However, PHA activated lymphocytes from psoriatic patients displayed a significantly decreased ratio of AnnV+CD95+ to the total AnnV+ subpopulation, thus suggesting a decreased role of Fasdependent mechanisms of apoptosis during the cell ac tivation. The data obtained confirm a view, that an abnor mal lymphocyte apoptotic reactivity, which plays a cru cial role in the mechanisms of autoimmunity, may also of importance in the pathogenesis of psoriasis.

Текст научной работы на тему «Апоптоз лимфоцитов при псориазе»

MM0)0lU4TUHCKja^4IMiMyH5O3Mio-l38 Оригинальные статьи

© 2006, СПб РО РААКИ

АПОПТОЗ ЛИМФОЦИТОВ ПРИ ПСОРИАЗЕ

Капулер О.М., Нелюбин Е.В., Каут Д.А.*, Сибиряк С.В.*

ОАО “Медицинская косметология”МЗ РБ, Уфа;

*Лаборатория иммунофармакологии и иммунотоксикологии института иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург - Уфа

Резюме. Обследованы 42 пациента с прогрессирующим вульгарным псориазом (средняя величина PASI равна 19,7 ± 1,5) и 40 условно-здоровых доноров. Установлено, что у больных псориазом увеличено количество CD4+ CD95+ Т- лимфоцитов в периферической крови, содержание которых положительно коррелирует с величиной PASI, и повышен уровень растворимого Fas рецептора (sFas) в сыворотке (1868,1 ± 186,8 пкг/мл против 1281,4 ± 142,5 пкг/мл у здоровых доноров, PLSD = 0.019). Интенсивность спонтанного апоптоза лимфоцитов и апоптоза, индуцированного антиFas МКА у больных псориазом аналогичны таковым у здоровых доноров, однако чувствительность лимфоцитов к апоптозу, индуцированному “оксидативным стрессом” (50 мкМ Н202, 4 часа) значимо снижается. При параллельной оценке структуры клеточного цикла (метахроматическое окрашивание акридиновым оранжевым), интенсивности апоптоза и экспрессии Fas-рецептора (двухпараметрическое окрашивание AnnV-FITC/антиFas МКА-PE) после кратковременной стимуляции митогеном (PHA-P, 5 мкг/мл, 24 часа) выявлено, что лимфоциты здоровых лиц и больных псориазом существенно не отличаются по митотической активности, интенсивности активационного апоптоза и величине активационно-индуцированной экспрессии Fas-рецептора. В то же время, соотношение между содержанием AnnV+CD95+ лимфоцитов и суммарным содержанием AnnV+ ФГА-активированных лимфоцитов при псориазе значимо снижалось, что свидетельствует об уменьшение “доли” Fas-зависимых механизмов апоптоза при активации клеток. Полученные данные подтверждают точку зрения, что в патогенезе псориатического процесса, как и в развитии других аутоиммунных заболеваний, важная роль принадлежит нарушениям “апоптотической реактивности” лимфоцитов.

Ключевые слова: спонтанный и индуцированный апоптоз лимфоцитов, растворимый Fas рецептор, псориаз.

Kapuler О.М., Nelyubin E.V., Kaut D.A., Sibiryak S.V.

LYMPHOCYTE APOPTOSIS IN PSORIASIS

Abstract. Forty-two patients with progressive vulgar psoriasis (PASI = 19.7 ± 1.5) and 40 healthy volunteers were under investigation. Psoriatic patients were characterized by increased number of CD4+ CD95+ peripheral blood T lymphocytes, which correlates with clinical psoriatic score, and by increased levels of soluble Fas (sFas) in serum, as compared to controls (resp., 1868.1 ± 186.8 pg/ml vs. 1281.4 ± 142.5 pg/ml, PLSD = 0.019). The levels of spontaneous lymphocyte apoptosis and anti-Fas (Mab)-induced apoptosis in psoriatic patients did not differ from the controls. However, apoptosis induced by “oxidative stress” (50 цМ Н202, 4 hrs) was depressed in the patients. Moreover, a simultaneous assessment of cell cycle structure (metachromatic staining with Acridine Orange), apoptosis and Fas receptor expression (AnnV-FITC/antiFas mAbs-PE staining) following a short-term mitogenic stimulation (PHA-P, 5 |Jg/ml, 24 hrs) were

performed. We found no marked differences in mitogenic reactivity, activation-induced apoptosis, and activation-in-

Adpec fan n.epenucKu: duced Fas receptor expression when studying lymphocytes

Cu6upHK Cepieu BjiadUMupo6'UH, Bmm., np<°<p., me. from healthy donors and psoriatic patients. However, PHA-

na6opamopueu UMMyH0^apMaK0n0iuu u activated lymphocytes from psoriatic patients displayed a

uMMyHomoKcuKrnrnuu MHO yp0 pAH,3ae omden°M significantly decreased ratio of AnnV+CD95+ to the total UMMyH0Ji0iuu Ory BcepoccuucKuu ^Hmp iJia3Hou u AnnV+ subpopulation, thus suggesting a decreased role of

nnacmmecKoU xupypiuu poc3dpaea. Fas-dependent mechanisms of apoptosis during the cell ac-

y<pa, 450075,yj. p. 3opie 67/1, Ory BU,rnx tivation. The data obtained confirm a view, that an abnor-

Poc3dpaea, omdej UMMymjoiuu, mal lymphocyte “apoptotic reactivity”, which plays a cru-

Tej.: 3472 - 329-942,3472 - 517-193, cial role in the mechanisms of autoimmunity, may also of

M.m. 891734904", 89019524623. importance in the pathogenesis of psoriasis. (Med. Immu-

E-maiU [email protected] no(, 2006, vol.8, № 4, pp 531-538)

Введение

Иммунопатогенезу псориаза посвящено множество работ. Это неудивительно, поскольку псориаз, описанный впервые более 2000 лет тому назад, является самым распространенным хроническим дерматозом, - этим заболеванием страдают 2-3 % населения земного шара, а существующие методы терапии не всегда приводят к желаемому эффекту. Псориаз очень часто сопровождается не только поражением кожи, но и артритом, очень сходным по проявлениям с серонегативным ревматоидным артритом (10-30% больных), синдромом Крона [12]. Не случайно поэтому, что ряд авторов считает более правильным характеризовать этот дерматоз, как псори-атическую болезнь [4]. В течение многих лет псориаз рассматривали исключительно как патологию кожи, сопутствующие иммунологические нарушения считались вторичными. Сегодня точка зрения изменилась, псориаз рассматривается как ТЬ1-зави-симое аутоиммунное заболевание, а иммунологическим нарушениям отводится приоритетная роль в его патогенезе [20].

Программированная смерть клеток путем апоп-тоза является одним из основных механизмов регуляции клеточного гомеостаза. Множество исследований свидетельствуют о нарушении терминальной дифференцировки и снижении апоптоза кератино-цитов при псориазе, - в кератиноцитах псориатичес-кой бляшки увеличивается экспрессия антиапопто-генных белков, снижается экспрессия проапоптоген-ных белков и чувствительность кератиноцитов к апоптогенным сигналам [1, 5, 20, 26]. Адекватный баланс между позитивной активацией лимфоцитов (пролиферацией, клональной экспансией) и их “негативной” активацией (апоптозом) является основным принципом функционирования иммунной системы [3, 6, 16]. Нарушения апоптотической регуляции выявляются при многих аутоиммунных заболеваниях, - системной волчанке, ревматоидном артрите, рассеянном склерозе и пр., однако исследования, посвященные нарушениям апоптоза лимфоцитов при псориазе, довольно малочисленны [4,

7, 23].

В настоящей работе представлены результаты оценки экспрессии Fas-рецептора на СЭ4+ Т-лим-фоцитах периферической крови, уровень сывороточного Fas-рецептора (sFas), спонтанный апоптоз и чувствительность лимфоцитов периферической крови к индуцированному апоптозу, характер активационного апоптоза у пациентов с прогрессирующим вульгарным псориазом.

Материалы и методы

Иммунологическое исследование проведено у 42 больных вульгарным псориазом (прогрессирующая стадия, среднетяжелое течение) и 40 условно-здо-

ровых доноров. Группа больных псориазом состояла из 70% мужчин и 30% женщин, средний возраст 41,2 ± 2,3 года. У 12 пациентов (28,5%) диагностирован псориатический артрит. Средняя величина псориатического индекса (PASI -psoriasis aeria and severity index) составила 19,7 ± 1,5. Группа условно-здоровых доноров (контрольная группа) состояла из 60% мужчин и 40% женщин, средний возраст

- 40,1 ± 1,8 лет. Группа включала лиц, которые на момент обследования не страдали острыми инфекционными заболеваниями и у которых, судя по анамнестическим данным, не выявлялись инфекционный, аутоиммунный и лимфопролиферативный синдромы. 14% доноров отмечали в анамнезе аллергические реакции на пищевые продукты и лекарства.

Взятие крови для иммунологического обследования (пункция локтевой вены) осуществляли в утренние часы строго натощак, - 2 мл крови помещали в пробирку VACUTAINER, содержащую ди-натриевую соль ЭДТА (BD) для иммунофенотипи-рования, 5 мл крови помещали в пробирку VACUTAINER, содержащую литиевую соль гепарина, для последующего выделения мононуклеаров и оценки апоптоза в краткосрочных культурах. Иммунологическое обследование проводилось незамедлительно после поступления пациента в стационар, до начала терапии.

Оценку содержания CD4+CD95+ лимфоцитов в периферической крови осуществляли стандартным методом прямого двухпараметрического иммуно-флюоресцентного окрашивания. Использовали FITC-меченные МКА против CD4 (анти CD4-FITC, IgG2a, Caltag Lbs.) и меченные PE антитела против CD95, (анти CD95-PE, IgG1, Caltag Lbs.). Контрольные пробы инкубировали с FITC- или PE-ме-ченными иммуноглобулинами соответствующего изотипа (мышиные IgG2a - FITC и мышиные IgG1-PE, Caltag Lbs.). Цитофлюориметрию осуществляли на проточном цитометре FACSCalibur (BD), при этом регистрировали суммарно не менее 10.000 событий. Полученные данные анализировали в рамках программы CellQuest.

Мононуклеары периферической крови выделяли стандартным методом градиентного центрифугирования (HIST0PAQUE-1077, Sigma, St. Louis).

Для оценки спонтанного и индуцированного апоптоза лимфоцитов периферической крови, выделенные мононуклеары ресуспендировали в среде RPMI-1640 (Sigma, St. Louis) без добавления сыворотки и инкубировали 4 часа (37°C, 5% CO2) с антиFas МКА (мышиные IgM МКА против Fas-рецептора человека, 500 нг/106 кл, BD) или перекисью водорода (конечная концентрация 50 мкМ). Инкубацию осуществляли в пробирках для проточной цитометрии (Falcon). Через 4 часа оценивали апоп-тоз лимфоцитов с помощью стандартного метода окрашивания FITC-меченным Аннексином

contr.Ofrl

чг -j

<=> -d

“■ п

concr.OO^

■ ramlcL

Я. >>'■.#

1 2:

101 10£

Ann V-FI ТС

10'

10

h202.005

FSC-Heipht

h202.005

10 10 10 AnnY-FITC

fas .006

fas 006

rn—| i i i i—| i i i i—| i i i i—| i i i—q

200 400 600 800 1000

FSC-Height

10' 10" io-

AnnV-FITC

Рис. 1. Цитофлюорограммы, иллюстрирующие апоптоз лимфоцитов периферической крови донора, индуцированного пероксидом (конечная концентрация 50 цМ) (средний ряд) и мышиными 1дМ-МКА против Fas-рецептора человека (нижний ряд). Верхний ряд - контрольные культуры.

V (FITC-AnnV, Caltag Lbs.) и йодистым пропиди-ем (PI, Applechem) [15]. При установке калибровочных параметров и величин компенсации осуществляли цитометрию неокрашенных клеток, клеток, окрашенных только Ann V и клеток, окрашенных только йодистым пропидием. Полученные данные анализировали в рамках программы CellQuest. Типичную цитофлюорограмму иллюстрирует рисунок 1.

Митогенез и активационный апоптоз оценивали в краткосрочных 24-часовых культурах лимфоцитов. Культивирование клеток осуществляли в плоскодонных 24-луночных планшетах (Costar) при следующих условиях - среда RPMI-1640 (Sigma St.Louis), ЭТС - 5% (Sigma St.Louis), 37°C, 5% CO2,

1,0 - 1,5 х 106 кл/мл, общий объем 1 мл. В качестве митогена использован ФГА (PHA-P, Difco, 5 мкг/ мл). После культивирования часть клеток (0,5 мл) использовали для оценки митогенеза клеток методом метахроматического окрашивания акридиновым оранжевым [11]. Другую часть клеток однократно отмывали раствором CellWash с добавлением 2% бычьего сывороточного альбумина (Sigma) и затем ресуспендировали в 200 мкл этого же раствора. Клетки окрашивали PE меченными МКА против CD95 в течение 15 мин, однократно отмывали раствором CellWash, затем ресуспендировали в “связывающем” буфере (10 mM HEPES-Na, 140 mM NaCl, 2,5 mM CaCl2, pH=7,4), содержащим FITC-

Контрольные культуры

Клеточный цикл

CGntr.fl 01

“I—I I I | I I I I—| I I—I I | I I I I—|—I I I—гр

0 200 4Й0 600 S00 1000

RNA content

ФГА-Р 5 мкг/мл

Апоптоз/ экспрессия CD95

согИг.ООЗ

■п.......1 ....■' 2....''3.....4 4

10и 101 1<Г Ж 10ч

AnnV-FITC

Клеточный цикл

Апоптоз/ экспрессия CD95

PH А.ОМ

РИА сошегк

Рис.2. Типичная цитофлюорограмма (здоровый донор), иллюстрирующая митогенез лимфоцитов периферической крови в краткосрочной культуре (метахроматическое окрашивание акридиновым оранжевым, по оси ординат - относительное содержание ДНК, по оси абсцисс - относительное содержание РНК), апоптоз и экспрессию Fas-рецептора. Верхний ряд - контрольные культуры; нижний ряд - ФГА-Р, 5 мкг/мл.

Ann V (1 мкг/мл), и через 5 мин осуществляли ци-тофлюорометрию. Контролем служили клетки, инкубированные с мечеными изотипическими мышиными иммуноглобулинами (IgG1- PE, Caltag Lbs.) и клетки, инкубированные с иммуноглобулинами и FITC- Ann V. Типичные цитофлюорограммы, полученные при оценке клеточного цикла, активационного апоптоза и экспрессии CD95, иллюстрирует рисунок 2.

Оценку содержания сывороточного растворимого Fas-рецептора (sFas) проводили иммунофермен-тным методом с использованием стандартной тест-системы human sAPO-1/Fas ELISA BMS245 (Bender MedSystems). При проведении ИФА руководствовались рекомендациями фирмы-производителя.

ИФА осуществляли на анализаторе Multiscan Plus (Labsystems).

Поставка реактивов, моноклональных антител и тест-систем осуществлялась ЗАО “БиоХимМак” (Москва), ООО “БиоЛайн” (Санкт-Петербург), ООО “Диаэм”(Москва).

Статистическая обработка результатов произведена в рамках программного обеспечения Statistica для Windows (версия 6.0). Различия считали статистически значимыми при P < 0,05. В процессе статистической обработки использовали однофакторный дисперсионный анализ (ANOVA), для сравнения значимости различий между группами применяли LSD-критерий (PLSD), а для сравнения внутригрупповых различий -непараметрический критерий Вилкоксона (PW).

Рис. 3. Спонтанный уровень апоптоза лимфоцитов периферической крови, апоптоз лимфоцитов индуцированный пероксидом (Н202, конечная концентрация 50 цМ) и мышиными 1дМ-МКА против Fas-рецептора человека у здоровых доноров и больных псориазом. Данные представлены, как М ± доверительный интервал для в = 0,95

Результаты

Экспрессия Fas-рецептора на лимфоцитах периферической крови и уровень sFas рецептора в сыворотке крови у больных псориазом

Содержание СЭ4+ лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор (СВ4+СЭ95+) в периферической крови и содержание растворимого Fas-рецептора в сыворотке у пациентов с псориазом и у здоровых доноров иллюстрирует таблица 1. В группе пациентов с псориазом среди СЭ4+ Т лимфоцитов, статистически значимо возрастала доля лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор - содержание СВ4+СЭ95+ лимфоцитов на 19% превышало таковое в донорской группе. Была установлена слабая, но статистически значимая (КСпирмана = + 0,22, Р =

0,044) непараметрическая корреляция между величиной РАБ1 и содержанием СВ4+СЭ95+ лимфоцитов.

Уровень sFas в группе больных псориазом был значимо выше, нежели в группе доноров; корреляции между этим показателем и величиной псориа-тического индекса установлено не было.

Спонтанный апоптоз лимфоцитов периферической крови и их чувствительность к апоптозу, индуцированному антиFas МКА и пероксидом у больных псориазом

Интенсивность спонтанного апоптоза лимфоцитов периферической крови у пациентов с прогрес-

сирующим псориазом и у здоровых доноров значимо не различалась (рис. 3). 4-часовая инкубация лимфоцитов периферической крови доноров с аFas МКА практически не изменяла содержания апото-тирующих клеток, - индекс индукции апоптоза (отношение числа апоптотирующих лимфоцитов в культурах с индуктором, к таковому в контрольных культурах) составил 1,36 ± 0,80. Аналогичная картина наблюдалась и в группе пациентов с псориазом, - после добавления аFas МКА значимого возрастания числа апоптотирующих лимфоцитов не было. Добавление пероксида приводило к индукции апоптоза лимфоцитов; в культурах лимфоцитов здоровых доноров в среде, содержащей 50 |j,M Н202, содержание Ann V+ клеток возрастало практически в 2 раза, в сравнении с контрольными культурами (PW= 0,0002), индекс апоптоза составил 2,10 ± 0,30. У больных псориазом пероксид также индуцировал апоптоз (PW = 0,011), однако чувствительность клеток к апоптозу, индуцированному оксидативным стрессом, и величина индекса апоптоза были статистически значимо ниже, чем у доноров (PLSD = 0,01).

Активационный апоптоз лимфоцитов периферической крови у больных псориазом

Стимуляция клеток ФГА вызывала активацию митогенеза лимфоцитов, причем статистически значимых межгрупповых различий в показателях ми-тогенеза выявлено не было (табл. 2). Следует отметить, однако, тенденцию к снижению доли покоя-

Табл.1. СОДЕРЖАНИЕ CD4+CD95+ ЛИМФОЦИТОВ В ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ И УРОВЕНЬ РАСТВОРИМОГО Fas РЕЦЕПТОРА У ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И ПАЦИЕНТОВ С ПРОГРЕССИРУЮЩЕЙ СТАДИЕЙ ВУЛЬГАРНОГО ПСОРИАЗА

Группа Содержание CD4+CD95+ лимфоцитов, % Уровень sFas, пкг / мл

Здоровые доноры 24,5 ± 0,9 1281,4 ± 142,5

29,1 + 1,4 1868,1 ± 186,8

Псориаз Plsd = 0,007 Plsd = 0,019

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

Показатели представлены, как M ± m

Табл. 2. ФГА-ИНДУЦИРОВАННЫЙ МИТОГЕНЕЗ, АКТИВАЦИОННО-ИНДУЦИРОВАННАЯ ЭКСПРЕССИЯ Fas (CD95) РЕЦЕПТОРА И Fas-ЗАВИСИМЫЙ АПОПТОЗ В 24-ЧАСОВОЙ КУЛЬТУРЕ ЛИМФОЦИТОВ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ ЗДОРОВЫХ ДОНОРОВ И БОЛЬНЫХ ПСОРИАЗОМ

Группа Митогенез (относительное содержание клеток, %) Экспрессия Fas (CD95+) лимфоциты, % Апоптоз

Спонт. ФГА-индуц. ь і о п О ФГА-индуц. Ann V+ лимфоциты, % Ann V+СD95+ лимфоциты, %

i- н о с О ФГА-индуц. 1- н о с О ФГА-индуц.

Go G1 SG2 M Go G1 SG2 M

Здоровые доноры <N -н со ,3 8 4, ,0 -н со 3, 0 0, -н 4 9, 0, -н ,8 5 -н сп ,8 3 3, 0, -н 5 8, 3, 3, -н о ,2 2 44,9 ± 5,5 Pw = 0,001 О, -н Ю ,0 37,3 ± 4,8 Pw = 0,001 0, -н со 5, 22,8 ± 3,7 Pw = 0,001

Псориаз со -н (N ,9 4, ,0 -н (N 3, 0, -н 0, со -н к 5 со -н к 0 3, 0, -н 6 5, 3, со 3, -н со ,5 30,8 ± 5,3 Pw = 0,006 Plsd=0,07 -н ,0 36,6 ± 3,5 Pw = 0,001 ,0 -н со 3, 16,6 ± 3,1 Pw = 0,001

PW - в сравнении с показателями в нестимулированных культурах; PLSD - межгрупповые различия

щихся GO-лимфоцитов в культурах лимфоцитов больных псориазом и, как следствие, тенденцию к снижению митотического потенциала клеток. Активация лимфоцитов доноров ФГА закономерно усиливала экспрессию CD95 - содержание Fas-экс-прессирующих лимфоцитов в культуре возрастало в 2 раза (PW = 0,001). Более чем трехкратно нарастало и содержание клеток, находящихся в ранней фазе апоптоза (PW = 0,001), причем большая часть апоп-тотирующих клеток экспрессировали Fas-рецептор,

- отношение числа Ann V+CD95+ лимфоцитов ко всем апоптотирующим клеткам составило в группе доноров 0,62 ± 0,05 (более 60%), а отношение числа Ann V+CD95+ лимфоцитов ко всем Fas-позитивным лимфоцитам составило 0,55 ± 0,06 (55%). У пациентов с псориазом спонтанная и индуцированная ФГА экспрессия Fas была несколько ниже, чем у здоровых лиц, однако статистически значимых различий выявлено не было. Спонтанное и индуцированное активацией содержание апоптотирующих лимфоцитов было аналогично таковым у здоровых лиц. Содержание AnnV+CD95+ лимфоцитов, как в неинду-цированных ФГА, так и в индуцированных ФГА культурах было несколько снижено и поэтому отношение числа этих клеток к общему числу Fas-эксп-

рессирующих клеток было таким же, как у доноров

- 0,59 ± 0,05. В то же время, отношение содержания AnnV+CD95+ лимфоцитов ко всем апоптотирую-щим клеткам было статистически значимо ниже, нежели в донорской группе и составило 0,42 ± 0,05 (Plsd = 0,02).

Обсуждение

В настоящее время патогенез большинства аутоиммунных расстройств интерпретируется в контексте нарушений апоптотической регуляции. Программированная клеточная смерть путем апоптоза играет ключевую роль как в элиминации аутореактивных клонов в процессе онтогенеза, так и обеспечении периферической толерантности. Дефекты апоптоза активированных лимфоцитов, в основном, Fas-зависимых механизмов выявлены при многих аутоиммунных заболеваниях. Эти нарушения могут быть сопряжены с генетическим дефектом Fas и FasL, ингибиторов апоптоза (с-FLIP), повышением уровня sFas, нарушением элиминации апоптоз-ных телец (дефект C1q) с последующей презентацией аутоантигенов дендритными клетками и пр. Во всех случаях неконтролируемая активация и

элиминация лимфоцитов приводит к аутоагрессии. Можно ли рассматривать псориаз в числе других аутоиммунных заболеваний как “патологию апоп-тоза лимфоцитов”? Обнаруженное повышение содержания в CD4+ Т-хелперов, экспрессирующих CD95, в периферической крови больных псориазом, описано неоднократно и другими исследователями [4], является закономерным проявлением активации иммунной системы и характерно для многих имму-новоспалительных процессов. Fas рецептор, который, безусловно, является основным “апоптоген-ным” рецептором, появляется на мембране лимфоцитов на ранних этапах их активации и необходим как для реализации программы рецепторного апоп-тоза, так и для митогенеза клеток [8]. Дальнейшая судьба Fas-экспрессирующих клеток зависит от многих факторов (цитокинового микроокружения, наличия ко-стимулирующих сигналов, экспрессии внутриклеточных про - и антиапоптогенных белков и т.д.) [16]. Именно поэтому, несмотря на количественное увеличение содержания CD4+CD95+ лимфоцитов у пациентов с псориазом, мы не обнаружили ни усиления спонтанного апоптоза лимфоцитов, ни повышения их чувствительности к Fas-индуци-рованному апоптозу в системе in vitro. В то же время в группе больных наблюдалось отчетливое повышение уровня сывороточного растворимого Fas-рецептора. Этот результат согласуется с данными Seshima и соавторов [23], которые обнаружили повышение уровня sFas у пациентов с пустулезным псориазом, однако в этой работе отмечалась корреляция уровня sFas с тяжесть процесса. sFas является продуктом альтернативного сплайсинга mRNA Fas рецептор и протеолитического отщепления трансмембранного Fas рецептора [9]. Повышение уровня sFas обнаружено и при других аутоиммунных заболеваниях: СКВ, ревматоидном артрите, дерматомиозите, системном склерозе, синдроме Сьег-рена, ANCA-позитивном системном васкулите, гломерулонефрите [10, 19, 21, 24]. Существует точка зрения, что sFas ингибирует апоптоз и элиминацию активированных лимфоцитов, что способствует формированию аутоагрессивных клонов [22]. Есть, однако, мнение, отрицающее патогенетическую роль sFas при аутоиммунных процессах [14]. Как бы то ни было, нарушение механизмов Fas-зависимого апоптоза при псориазе, скорее всего, присутствует. В модельной системе in vitro, при активации ФГА, у больных псориазом не было значимых изменений структуры клеточного цикла и суммарной интенсивности активационного апоптоза, но “доля” Fas-зависимого апоптоза лимфоцитов значимо снижалась. Есть данные, что в псориатической бляшке снижается интенсивность Fas-зависимой апоптотической гибели мигрирующих в кожу активированных СD95+ лимфоцитов, что, однако, связывается с гипоэкспрессией Fas лиганда кератиноцитами [7].

Об измененной апоптотической реактивности лимфоцитов при псориазе свидетельствует и увеличение резистентности лимфоцитов к апоптозу, индуцированному Н202, в реализации которого, как известно, принимают участие редокс-чувствительные регуляторные белки и мембранные стресс-киназы [13, 27]. Интересно, что в последние годы важная роль в формировании псориатической бляшки отводится мигрирующим в кожу CD4+CD45RO+ CXR3+ Т лимфоцитам, содержание которых в периферической крови больных псориазом, как по нашим данным [2], так и по данным других исследователей [18, 25], существенно возрастает. Известно, что CD45RO+ Т лимфоциты характеризуются высокой внутриклеточной экспрессией у-глютамилт-ранспептидазы и поэтому малочувствительны к ок-сидативному стрессу и Н202- [17].

В конце 90-х годов прошлого века была сформулирована концепция “апоптотического иммунодефицита” [3], в которой впервые иммунопатологические состояния рассматривались с позиций нарушения баланса между “позитивной” и “негативной” активацией. В контексте этой концепции любые проявления аутоагрессии рассматривались как дефицит “негативной активации”. Проведенное исследование свидетельствует, что псориаз не является исключением из правила и подтверждает наличие неких универсальных, типовых механизмов формирования аутоагрессии.

Выводы

1. Прогрессирующая стадия вульгарного псориаза сопровождается увеличением количества CD4+ CD95+ Т лимфоцитов в периферической крови, содержание которых коррелирует с тяжестью процесса, но не сопровождается увеличением интенсивности спонтанного апоптоза и апоптоза, индуцированного анти Fas МКА.

2. В прогрессирующей стадии вульгарного псориаза выявляется повышение уровня продукта альтернативного сплайсинга mRNA Fas рецептора - растворимого Fas рецептора (sFas) в сыворотке крови, содержание которого не зависит от тяжести процесса.

3. При вульгарном псориазе выявляются нарушения “апоптотической реактивности” лимфоцитов периферической крови, которые выражаются в снижении чувствительности лимфоцитов к апоптозу, индуцированному оксидативным стрессом и снижением “доли” Fas-опосредованных механизмов апоп-тоза при активации лимфоцитов.

Благодарности

Авторы статьи выражают благодарность канд. биол. наук Н.Н. Курчатовой и канд. биол. наук

Р.Ш. Юсуповой за помощь при выполнении исследования.

Список литературы

1. Казанцева И. А. Апоптоз и его роль в патологии кожи // Российский журнал кожных и венерических болезней - 2000. - №4. - С. 17-22.

2. Капулер О.М., Каут Д.А., Сибиряк С.В. Суб-популяционная структура лимфоцитов при псориазе // Иммунология Урала (Материалы IV конф. Иммунологов Урала). - 2005. - № 1(4) - С. 61-62.

3. Ковальчук Л.В., Чередеев А.Н. Новые иммуно-патогенетические взгляды: апоптотические иммунодефициты // Иммунология. - 1998. - № 6. - С. 17-18.

4. Кунгуров Н.В., Филимонкова Н.Н., Тузанки-на И.А. Псориатическая болезнь. - Екатеринбург: Изд-во Урал. Ун-та, 2002. - 200 с.

5. Новиков А.И., Кононов А.В., Охлопков В.А., Правдина О.В. и др. Иммунохимические исследования при псориазе // Вестн. дерматол. венерол. -2003. - № 3. - C. 26-28.

6. Ярилин А.А. Апоптоз и его место в иммунных процессах // Иммунология. - 1996. - № 6. - С. 10 - 23.

7. Arnold R., Seifert M., Asadullah Kh., Dieter H. et al. Crosstalk between keratinocytes and T lymphocytes via Fas/Fas ligand Interaction: Modulation by Cytokines processes //J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P.7140 - 7147.

8. Budd R. Death receptors couple both cell proliferation and apoptosis // J. Clin. Invest. - 2002. - Vol. 109. - P.437-450.

9. Cheng J., Zhou T., Liu C., Shapiro J. et al. Protection from Fas-mediated apoptosis by a soluble form of the Fas molecule // Science - 1994. - Vol. 263. - P. 1759-1762.

10. Christensson M., Pettersson E., Eneslatt K. et al. Serum sFAS levels are elevated in ANCA-positive vasculitis compared with other autoimmune diseases // J. Clin Immunol. - 2002.- Vol. 22. - P. 220-227.

11. Darzynkiewicz Z. Simultaneous analysis of cellular RNA and DNA content // Meth. Cell Biol. - 1994.

- Vol. 41. - P. 401-420.

12. Gladman D. Discussion: Clinical features, epidemiology, classification criteria, and quality of life in psoriasis and psoriatic arthritis // Ann. Rheum. Dis. -2005. - Vol.64. - P.24-25.

13. Hildeman D., Mitchell Th., Kappler J., Marrack Ph. T cell apoptosis and reactive oxygen species // J. Clin. Invest. - 2003. - Vol. 111. - P. 575-581.

14. Knipping E., Krammer P., Onel K. et al. Levels of soluble Fas/APO-1/CD95 in systemic lupus erythematosus and juvenile rheumatoid arthritis // Arthritis Rheum. - 1995. - Vol. 38. - P. 1735-1737.

15. Koopman G., Reuterlingsperger C., Kiijten G., Keehnen R. et al. Annexin V for flow cytometric detec-

tion of phosphatidylserine expression of B cells undergoing apoptosis // Blood. - 1994. - Vol. 84. - P. 1415 - 1420.

16. Krammer P. CD95’s deadly mission in the immune system // Nature. - 2000. - Vol. 407. - P. 789 - 795.

17. Lahdenpohja N., Naive H. (CD45RA+) T lymphocytes are more sensitive to oxidative stress-induced signals than memory (CD45RO+) cells // Cell Immunol. - 1996. - Vol. 173. - P. 282-286.

18. Lecewicz-Torun B., Pietrzak A., Rolinski J., Brzozowski W. The peripheral blood lymphocyte pattern in psoriasis proceeded by an infection // Med. Sci. Monit. - 2001. - Vol.7. - P. 889-893.

19. Lorenz H., Grunke M., Hieronymus T. et al. In vitro apoptosis and expression of apoptosis-related molecules in lymphocytes from patients with systemic lupus erythematosus and other autoimmune diseases // Arthritis Rheum. - 1997 . - Vol. 40. - P. 306-317.

20. Nickoloff B., Nestle O. Recent insights into the immunopathogenesis of psoriasis provide new therapeutic opportunities // J. Clin. Invest. - 2004. - Vol. 113. -P.1664-1675.

21. Nozawa K., Kayagaki N., Tokano Y. Et al. Soluble Fas (APO-1, CD95) and soluble Fas ligand in rheumatic diseases // Arthritis Rheum. - 1997. - Vol. 40. -P. 1126-1129.

22. Papoff G., Cascino I., Eramo A. et al. An N-ter-minal domain shared by Fas/Apo-1 (CD95) soluble variants prevents cell death in vitro // J. Immunol. -1996. - Vol. 156. - P. 4622-4630.

23. Seishima M., Seishima M., Takemura M., Saito K. et al. Increased serum soluble Fas, tumor necrosis factor alpha and interleukin 6 concentrations in generalized pustular psoriasis // Dermatology.- 1998. - Vol. 196. - P.371-372.

24. Van der Linden M., T Van Lopik T., L A Aarden L. et al. Soluble CD95 concentrations are increased in patients with severe systemic lupus erythematosus, but not in their first degree relatives //Ann. Rheum. Dis. -Vol. 2001. - Vol. 60. - P. 237-241.

25. Vissers W., Arndtz C., Muys L., Van Erp P. et al. Memory effector (CD45RO+) and cytotoxic (CD8+) T cells appear early in the margin zone of spreading psoriatic lesions in contrast to cells expressing natural killer receptors, which appear late // Br. J. Dermatol. - 2004.

- Vol. 150. - P. 852-859.

26. Wrone-Smith T., Johnson T., Nelson B., Boise L. et al. Discordant expression of Bcl-x and Bcl-2 by kera-tinocytes in vitro and psoriatic keratinocytes in vivo // Amer. J. Pathol. - 1995. - Vol. 146. - P.1079 -1088.

27. Zhuang Sh, Demirs J., Kochevar I. p38 Mitogen-activated Protein Kinase Mediates Bid Cleavage, Mitochondrial Dysfunction, and Caspase-3 Activation during Apop-tosis Induced by Singlet Oxygen but Not by Hydrogen Peroxide // J. Biol. Chem. - 2000. - Vol. 275. - P. 25939-25948.

поступила в редакцию 20.01.2006 принята к печати 02.02.2006

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.