CC BY
28УДК 616.43: 632.938
Митрейкин Владимир Филиппович
Д.м.н., профессор,
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия,
Луговая Анна Владимировна К.м.н., Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова, Санкт-Петербург, Россия, DOI: 10.24411/2520-6990-2019-10559 ОСОБЕННОСТИ ЭКСПРЕССИИ FAS-АНТИГЕНА Т-ЛИМФОЦИТАМИ ПЕРИФЕРИЧЕСКОЙ КРОВИ У БОЛЬНЫХСАХАРНЫМ ДИАБЕТОМ 1 ТИПА
Mitreikin Vladimir Phylippovich
PhD, MD (Medicine), Professor, Pavlov First Saint Petersburg State Medical University
Saint Petersburg, Russia
Lugovaya А nna Vladimirovna PhD (Medicine), Pavlov First Saint Petersburg State Medical University,
Saint Petersburg, Russia
PARTICULARITIES OF EXPRESSION OF FAS ANTIGEN BY PERIPHERAL BLOOD T-LYMPHOCYTES IN PATIENTS WITH TYPE 1 DIABETES MELLITUS
Аннотация
Несмотря на активное изучение иммунопатогенеза сахарного диабета 1 типа (СД-1) многие ключевые моменты в развитии и прогрессировании данного заболевания остаются не ясными. Известно, что нарушение активации Fas-опосредованного апоптоза в отдельных субпопуляциях Т-клеток играет важную роль в патогенезе СД-1. В связи с этим, представляется актуальным уточнение механизмов нарушения Fas-опосредованного апоптоза аутореактивных Т-лимфоцитов периферической крови больных СД-1, принимающих активное участие в патогенезе заболевания. В статье представлены результаты исследования готовности к апоптозу мононуклеаров перифеческой крови и отдельных субпопуляций Т-лимфо-цитов периферической крови у больных СД-1 и лиц с высоким риском развития СД-1. Проведена оценка поверхностной экспрессии Fas-рецептора в отдельных субпопуляциях Т-лимфоцитов. Максимальное увеличение количества CD95+-клеток выявлено при декомпенсации СД-1. В группе лиц с высоким риском развития СД-1 отмечено достоверное повышение количества CD8+CD95+-клеток по сравнению с группой контроля.
Âbstract
Despite an active study of the immunopathogenesis of type 1 diabetes mellitus (ТШМ), many key points in the development and progression of this disease remain unclear. It is known that impaired activation of Fasmediated apoptosis in individual subpopulations of T cells plays an important role in the pathogenesis of type 1 diabetes. In this regard, it seems relevant to clarify the mechanisms of violation of Fas-mediated apoptosis of autoreactive peripheral blood T-lymphocytes in patients with ТЮМ, which are actively involved in the pathogenesis of the disease. The article presents the results of a study of the readiness for apoptosis of peripheral blood mononuclear cells and individual subpopulations of peripheral blood T-lymphocytes in patients with ТЮМ and those with a high risk of ТЮМ developing. The surface expression of the Fas receptor in individual subpopulations of T lymphocytes was evaluated. The maximum increase in the number of CD95+ cells was detected during ТЮМ decompensation. In the group of individuals with a high risk of T1DM developing a significant increase in the number of CD8 + CD95 + cells was noted compared with the control group.
Ключевые слова: Fas-опосредованный апоптоз, аутореактивные Т-лимфоциты, субпопуляции Т-лимфоцитов, Fas-рецептор, Fas-лиганд, сахарный
диабет 1 типа, проточная цитометрия, лица с высоким риском развития СД-1.
Key words: Fas-mediated apoptosis, autoreactive T-lymphocytes, subpopulations of T-lymphocytes, Fas-receptor, Fas-ligand, type 1 diabetes mellitus, flow cytometry, individuals with а high risk of T1DM developing.
Введение. В настоящее время ведущая роль в разрушении р-клеток при (СД-1) отводится апоптозу - программированной гибели клеток [5, с. 635]. В патогенезе СД-1 с апоптозом связаны 2 основных механизма: 1) нарушение процессов апоптоза в тимусе, приводящее к неэффективной
селекции аутореактивных Т-лимфоцитов, повышению их устойчивости к апоптозу и, как следствие, накоплению их в циркуляции; 2) роль апоптоза как завершающего механизма аутоиммунной деструкции р-клеток. В обоих случаях речь идёт о нарушении Fas-опосредованного апоптоза, играющего главную роль в поддержании периферической
«C@yL@qyiym-J©yrMaL»#17î41),2©19 / EARTH SCIENCES
аутотолерантности [9, с. 1,2]. Рецептор Fas (APO-1, CD95) - это мембранный белок, имеющий в своей структуре внеклеточный, трансмембранный и ци-топлазматический домены. В цитоплазматическом участке имеется гомологичный домен, необходимый для передачи сигнала смерти (DD - death domen). Этот рецептор активируется соответствующим антигеном - Fas-лигандом (FasL, APO-1L, CD95L), являющимся индуктором апоптоза [1, с. 16,17]. По данным литературы, если в системе Fas-FasL имеется дефект, вероятность развития аутоиммунного заболевания повышается [6, с. 47].
Активированные аутореактивные лимфоциты, устойчивые к Fas-опосредованному апоптозу, мигрируют из кровяного русла в поджелудочную железу и образуют воспалительные инфильтраты -инсулиты. Иммунокомпетентные клетки секрети-руют провоспалительные цитокины, которые усиливают экспрессию Fas-рецептора на р-клетках [8, с. 226]. Это приводит к апоптотической гибели последних в результате взаимодействия с аутореак-тивными Т-лимфоцитами, экспрессирующими Fas-лиганд. Значительное усиление экспрессии мембранных форм Fas-рецептора и Fas-лиганда на лимфоцитах периферической крови выявлено у больных с диабетическими макроангиопатиями, такими, как острый коронарный синдром [7, с. 887]. К настоящему моменту большинство результатов по изучению Fas-опосредованного апоптоза при СД-1 получено в экспериментах in vitro. В связи с этим представляется актуальным изучение особенностей Fas-опосредованного апоптоза Т-лимфоци-тов периферической крови у больных СД-1 в зависимости от состояния компенсации углеводного обмена и длительности течения заболевания, а также у лиц с высоким риском развития СД-1.
Цель исследования: изучить готовность к апоптозу иммунокомпетентных клеток и отдельных субпопуляций Т-лимфоцитов путём определения количества CD95+-, CD3+CD95+-, CD4+CD95+- и CD8+CD95+-лимфоцитов в периферической крови больных СД-1 в зависимости от состояния компенсации и длительности течения заболевания, а также у лиц с высоким риском развития СД-1.
Материалы и методы. Было обследовано 63 больных с достоверно установленным диагнозом СД-1. Контрольную группу (I группа) составили 30 здоровых лиц, по полу и возрасту сравнимых с больными СД-1. Распределение больных по группам проводилось в зависимости от фазы компенсации и длительности течения заболевания. II группу (декомпенсированный СД-1) составили 17 больных с впервые выявленным СД-1 (11а группа) и 19 пациентов (11б группа) с длительностью течения СД-1 в среднем 15,3±5,1 года. В III группу (состояние компенсации СД-1) были включены 13 больных с длительностью заболевания до 1 года (IIIa группа) и 14 человек с продолжительностью СД-1 в среднем 15,1±5,4 года (Шб группа). IV группу составили 15 человек с повышенным риском развития СД-1, являющиеся лицами первой степени родства обследованных больных СД-1. У всех пациентов IV группы
37_
было выявлено повышение титра аутоантител к ци-топлазматическим антигенам островковых клеток -ICA (Islet Cell Autoantibodies) в сыворотке (>1/20) и нарушение толерантности к глюкозе. ICA могут служить важным предиктором заболевания для родственников первой степени родства больных СД-1 [4, с. 129]. Они появляются за 1-8 лет до клинической манифестации сахарного диабета [3, с. 785]. Фенотипирование мононуклеаров периферической крови осуществляли методом проточной ци-тометрии с использованием моноклональных антител производства «Immunotech» (Coulter Corporation, USA). Для определения количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, использовали двойную флуоресцентную метку -FITC (флюоресцеинизотиоционат) и PE (фико-эритрин). Исследование проводили с применением следующих сочетаний антител: anti-CD3-FITC/anti-CD95-PE, anti-CD4-FITC/anti-CD95-PE, anti-CD8-FITC/anti-CD95-PE и их изотипических контролей (mouse IgG1, конъюгированный с FITC, и mouse IgG1, конъюгированный с РЕ). Для каждой пробы использовали выделенные мононуклеары периферической крови в концентрации 2х106 клеток/мл. Цитометрический анализ лимфоцитов проводили на проточном цитофлуориметре EPICS XL (Coulter Corporation, USA). Для статистической обработки полученных данных использовали непараметрический критерий Вилкоксона-Манна-Уитни для сравнения средних. Обработка материала проведена с использованием пакета программ «Statistica 10.0» (StatSoft, USA, Windous XP). Критический уровень достоверности нулевой гипотезы (об отсутствии значимых различий) принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение. Как следует из данных, представленных в таблице 1, во всех группах больных СД-1 по сравнению с группой контроля было выявлено достоверное повышение относительного и абсолютного количества лимфоцитов с маркером апоптоза CD95. Это свидетельствует о повышенной готовности имму-нокомпетентных клеток к апоптозу при СД-1. Максимальное увеличение относительного и абсолютного содержания CD95+-клеток и количества Т-лимфоцитов, экспрессирующих Fas-рецептор, было выявлено при декомпенсации СД-1 независимо от продолжительности заболевания (На и Пб группы). Полученные данные указывают на то, что при СД-1 повышение готовности иммунокомпе-тентных клеток к апоптозу не зависит от длительности заболевания, а чётко ассоциировано с декомпенсацией процесса и уровнем гликемии. Это подтверждается данными, полученными в обеих группах больных СД-1 в фазе компенсации (Ша и Шб группы). Здесь также было отмечено достоверное повышение относительного и абсолютного количества CD95+-клеток по сравнению с контрольной группой (p<0,05), но менее выраженное, чем в фазе декомпенсации заболевания (p<0,01).
Особый интерес вызывает неравномерность увеличения количества клеток, несущих маркер апоптоза CD95, среди субпопуляций Т-лимфоци-тов. Так, в группе декомпенсации с длительностью заболевания более 15 лет (группа Пб)
Таблица 1
Содержание CD95+-клеток и Т-лимфоцитов, эспрессирующих Fas-рецептор, _в периферической крови больных СД-1 и лиц группы риска_
ГРУППЫ CD95+ CD3+CD95+ CD4+CD95+ CD8+CD95+
Относительное содержание, % Абсолютное содержание, мм3 Относительное содержание, %
I 4,2 80 3,0 2,3 0,9
IIa 12,4** 260** 10,8** 7 3** 6 0***
II6 13,2** 222** 11,1** 8,1** 6 7***
IIIa 8,6* 212* 7,3* 5,1* 3 9**
III6 8,2* 152* 6,9* 4,8* 3 7**
IV 4,9 90 3,5 3,0 2,1*
*-р <0,05, **- р <0,01, ***- р <0,001 - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой.
Количество CD4+CD95+-лимфоцитов увеличивалось в 3,5 раза по сравнению с контрольной группой (I группа), в то время как число СБ8+СБ95+- клеток возрастало в 7,4 раза (табл. 1). При этом, увеличение количества СЭ3+СЭ95+-клеток только в 3,7 раза позволяет предположить в популяции зрелых Т-лимфоцитов, экспрессирую-щих рецептор CD95, наличие клеток с фенотипом CD4+CD8+ (около 4%), которые, являются ауто-агрессивными клонами и подтверждают аутоиммунный характер заболевания. Согласно данным литературы, появление в периферической крови «двойных позитивов» CD4+CD8+ свидетельствует
о наличии аутоиммунного компонента в заболевании [2, с. 117].
Как следует из данных, приведённых в таблице 2, в контрольной группе (I) количество аутоагрес-сивных клонов Т-клеток с фенотипом CD4+CD8+CD95+ составило 0,2%, в группе декомпенсации с впервые выявленным СД-1 (11а) - 2,5%, а с продолжительностью заболевания более 15 лет (Пб) - 3,7%, при компенсации с длительностью заболевания до 1 года (Ша) - 1,7%, а с длительностью СД-1 более 15 лет (Шб) - 1,6%. У лиц группы риска (IV) данный показатель соответствовал 1,6% (табл. 2).
Таблица 2
Аутореактивные Т-клетки с фенотипом CD4+CD8+CD95+
Группы обследуемых лиц Относительное содержание CD4+CD8+CD95+-клеток, %
I 0,2
IIa 2 5***
II6 3 7***
IIIa 1 7**
III6 1,6**
IV 1,6**
**- р <0,01, ***- р <0,001 - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой
Полученные данные свидетельствуют о том, что повышенное содержание аутореактивных Т-лимфоцитов не только указывает на наличие аутоиммунного процесса, но и коррелирует с тяжестью течения заболевания, в частности, с состоянием декомпенсации углеводного обмена при СД-1. В нашем исследовании об этом свидетельствует самый высокий процент СВ4+СБ8+СБ95+-клеток в обеих группах декомпенсации (11а и Пб).
Как показано на рис. 1, во всех обследуемых группах отмечалось увеличение процента CD8+CD95+ клеток от общего количества цитоток-сических Т-лимфоцитов по сравнению с контрольной группой (I), более выраженное при декомпенсации заболевания (Па и Пб группы). Увеличение в периферической крови больных СД-1 количества СБ8+-лимфоцитов, несущих рецептор СЭ95, является компенсаторным механизмом, направленным
на элиминацию путём апоптоза аутореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов, принимающих активное участие в деструкции р-клеток поджелудочной железы [6, с. 47]. В то же время, достоверное повышение количества клеток с фенотипом CD8+CD95+ в крови у лиц с высоким риском развития СД-1 по сравнению с группой контроля (р<0,05) является неблагоприятным прогностическим фактором, указывающим на то, что уже в латентной стадии СД-1 происходит экспансия ауторе-активных клонов цитотоксических Т-лимфоцитов в периферической крови с последующей их миграций в орган-мишень (поджелудочную железу), что приводит к прогрессированию аутоиммунного процесса [9, с. 226, 231].
«C@yL@qyiym-J©yrMaL»#17i41),2©19 / EARTH SCIENCES
39
Рис.1. Процент CD8+CD95+клеток от общего числа цитотоксических Т-лимфоцитов. *-р<0,05, **-p<0, 01, ***- p< 0,001 - достоверные отличия по сравнению с контрольной группой.
Выводы. Исследованием установлено, что:
1. при СД-1 отмечается повышенная готовность иммунокомпетентных клеток к апоптозу, о чём свидетельствует достоверное повышение количества СЭ95+-клеток во всех обследуемых группах больных СД-1 по сравнению с группой контроля. Максимальное увеличение количества СЭ95+-клеток выявлено при декомпенсации СД-1, что указывает на связь между повышенной готовностью иммунокомпетентных клеток к апоптозу и декомпенсацией углеводного обмена;
2. во всех группах обследуемых пациентов наблюдалось увеличение процента CD8+CD95+ клеток от общего количества цитотоксических Т-лимфоцитов по сравнению с группой контроля, более выраженное при декомпенсации заболевания (рис. 1.). Это указывает на стремление иммунной системы ограничить активность аутореактивных цитотоксических Т-лимфоцитов, принимающих участие в деструкции инсулярного аппарата поджелудочной железы. Преимущественная экспрессия РаБ-рецептора на CD8+-лимфоцитах свидетельствует о включении механизмов элиминации ауто-реактивных цитотоксических Т-клеток;
3. в группе лиц с высоким риском развития СД-1 было отмечено достоверное повышение количества СЭ8+СБ95+-клеток по сравнению с контрольной группой (р<0,05). Это является неблагоприятным прогностическим фактором и свидетельствует о прогрессировании аутоиммунного процесса.
Список литературы
1. Барышников А.Ю., Шишкин Ю.В. Иммунологические проблемы апоптоза. - М.: Эдиториал УРСС, 2002. - 320с.
2. Кетлинский С.А., Калинина Н.М. Иммунология для врача. СПб: ТОО. - Изд-во «Гиппократ». - 1998. - 156с.
3. Кишкун А.А. Клиническая лабораторная диагностика: учеб, пособие / А.А. Кишкун. - М.: ГОЭТАР-Медиа, 2015. - 976 с.
4. Клиническая лабораторная диагностика: национальное руководство: в 2 т. Т II / под ред. проф. В.В.Долгова, проф. В.В.Меньшикова. - М.: ГЭОТАР - Медиа, 2013. - 808 с.
5. Овсепян Л.М., Казарян Г.С., Зангинян А.В., Акопджанян А.А., Захарян Г.В., Петрек М. Изучение апоптоза иммунных клеток при сахарном диабете 1 типа // Медицинская иммунология. - 2017.-Т.19, №5.- С.635-640.
6. Пекарева Е.В. Роль апоптоза в патогенезе сахарного диабета 1 типа / Е.В. Пекарева, Т.В. Ни-конова, О.М. Смирнова // Сахарный диабет. - 2010.-№ 1. - С. 45-49.
7. Bossowska A., Bossowski A., Galar A. Analysis of apoptotic markers Fas/FasL (CD95/Cd95L) expression on the lymphocytes in patients with acute coronary syndrome // Kardiologia Polska. - 2007. -Vol.65, - pр.883-889.
8. Tchorzewski H., Glowacka M., Banasik P., Lewkowicz M., Salapska-Zawodniak M. Activated T lymphocytes from patients with high risk of type I diabetes mellitus have different ability to produce interferon^, interleukin-6 and interleukin-10 and undergo anti-CD95 induced apoptosis after insulin stimulation // Immunology Letter. - 2001.- Vol.75, ^р.225-234.
9. Mauricio D., Mandrup-Poulsen T. Apoptosis and the pathogenesis of IDDM: a question of life and death // Diabetes. - 1998.- Vol.47, №.10, - pр.1537-1543.
