CC BY
33
Раздел 02.00.10 Биоорганическая химия
УДК 543.641 DOI: 10.17122/bcj-2019-1-78-84
П. А. Полубояринов (к. с.-х. н., доц.) 1а, С. Ю. Андреев (д.т.н., проф.) 1б, В. И. Швец (д.х .н., проф.)
МЕХАНИЗМ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ АМИНОКИСЛОТЫ
L-СЕЛЕНОЦИСТЕИНА С СЕЛЕНСОДЕРЖАЩИМ КСЕНОБИОТИКОМ ДИАЦЕТОФЕНОНИЛСЕЛЕНИДОМ
1 Пензенский государственный университет архитектуры и строительства, а кафедра «Инженерная экология», б кафедра «Водоснабжение, водоотведение и гидротехника» 440028, г. Пенза, ул. Германа Титова, 28, тел. (8412) 497277, e-mail: poluboyarinovpavel@yandex.ru, andreev3007@rambler.ru
2 Московский технологический университет (Институт тонких химических технологий имени М.В. Ломоносова), кафедра биотехнологии и промышленной фармации 119571, г. Москва, пр. Вернадского, д. 86, тел. (495)9368897, e-mail: shvez@mitht.ru
P. A. Poluboyarinov 1, S. Yu. Andreev 1, V. I. Shvets 2
MECHANISM OF INTERACTION BETWEEN L-SELENOCYSTEINE AND SELENIUM CONTAINING XENOBIOTIC DIACETOPHENONYLSELENIDE
1 Penza State University of Architecture and Construction 28, Titova Str, 440028, Penza, Russia, ph. (8412) 497277, e-mail: poluboyarinovpavel@yandex.ru, andreev3007@rambler.ru 2 Lomonosov Moscow State University of Fine Chemical Technologies 78, Vernadsky Avenue, Moscow, Russia, ph. (495)9368897, e-mail: shvez@mitht.ru
Механизмы трансформации широко применяв- Mechanisms of selenium containing xenobiotics
мых в настоящее время для коррекции дефицита widely used for human and domestic animals
микроэлемента селена в пище человека и рацио- selenium deficiency correction (such as
нах животных селенсодержащих ксенобиотиков, diacetophenonylselenide, 1,5-diphenyl-3-seleno-
таких как диацетофенонилселенид(1,5-дифенил- pentadion-1,5) are studied insufficiently.
3-селенапентадион-1,5) изучены недостаточно. Selenocysteine is a natural selenol may deactivate
Селеноцистеин — 21-я протеиногенная аминокис- xenobiotics similar to thiols (reduced glutathione,
лота, как и восстановленный глутатион, может ре- cystein). Different selenocysteine derivatives may
агировать с ксенобиотиками, инактивируя их. be considered as precursors in production of
Производные селеноцистеина рассматриваются pharmacologically active selenoles. HPLC and
как потенциальные пролекарства для получения TLC methods were used for investigation of
фармакологически активных селенолов. Метода- products of the reaction between L-selenocysteine
ми ВЭЖХ и ТСХ изучены продукты реакции and selenium containing xenobiotic diacetopheno-
аминокислоты L-селеноцистеина с селеноргани- nylselenide using different molar ratios and pH.
ческим ксенобиотиком диацетофенонилселенидом Producion of an intermediate — 5-(acetophenyl-
при различных молярных соотношениях и значе- selenyl)selenocysteine was detected using
ниях рН. Выявлено образование промежуточного qualitative reaction of elemental selenium
продукта реакции — 5-(ацетофенилселенил)селено- formation at TLC plates, and also the terminated
цистеина, который определяется нингидрином и ка- production: acetophenone, L-selenocystine,
чественной реакцией с выделением элементного се- proving the existence of the proposed mechanism. лена на пластинах ТСХ, а также конечных —
ацетофенона, L-селеноцистин, и подтверждена Key words: acetophenone; 5-(acetophenyl-
предложенная схема реакции. selenyl)selenocysteine; diacetophenonylselenide;
HPLC; L-selenocystine; L-selenocysteine; TLC.
Ключевые слова: 5-(ацетофенилселенил)селе-ноцистеин; ацетофенон; ВЭЖХ; диацетофенонил-селенид; L-селеноцистеин; L-селеноцистин; ТСХ.
Дата поступления 06.02.19
Микроэлемент селен обладает ярко выраженными каталитическими свойствами и формирует активные селенольные центры антиок-сидантных ферментов живых организмов. Основными антиоксидантными ферментами являются четыре селензависимые глутатион-пероксидазы, которые, кроме сульфгидриль-ных групп (-БЫ) — остатков аминокислоты ци-стеина, содержат разное количество селеноль-ных групп (-БеЫ) — остатков аминокислоты селеноцистеина, а также отличаются первичной структурой и, соответственно, специфичностью функций 1.
Высокая биологическая активность органических форм селена, в первую очередь аминокислот, их уникальная антиоксидантная, противопухолевая активность 2, способность защиты от онкологических, кардиологических и нейрогенных заболеваний (болезнь Альцгей-мера, болезнь Паркинсона), определяют важ-
« 3
ность исследования данных соединений .
Селеноцистеин (окисленная форма селе-ноцистин) — 21-я протеиногенная аминокислота, которую на матричной РНК кодирует терминирующий кодон ИОА при условии, что за ним следует особая стимулирующая последовательность нуклеотидов 4. Это самое значимое природное соединение селена, а все остальные (найденные в природных источниках) либо лежат на пути его биосинтеза (интерме-диаты), либо являются его метаболитами.
Производные селеноцистеина рассматриваются как потенциальные пролекарства, используемые для получения фармакологически активных селенолов 5.
Однако механизмы трансформации широко применяемых в настоящее время для коррекции дефицита микроэлемента селена в пище человека и рационах животных селенсо-держащих ксенобиотиков, таких как селенопи-ран ( 9-фенил-сим-нона-гидро-10-сел енаантра-цен) 6 и диацетофенонилселенид (препарат ДАФС-25, 1,5-дифенил-3-селенапентадион-1,5) 7, изучены недостаточно.
Известно несколько схем реакций селе-норганических соединений с тиолами. Так, а-(фенилселенил)кетоны реагируют с восстановленным глутатионом, образуя ацето-фенон 8. Реакция между а-(фенилселенил)аце-тофеноном и восстановленным глутатионом ускоряется по мере повышения рН и сопровождается образованием дифенилдиселенида, а не элементного селена.
В работах 9-11 нами показан механизм взаимодействия диацетофенонилселенида с восстановленным глутатионом и цистеином с об-
разованием элементного селена (идентифицирован с помощью реакции Файглея-Веста 12) и ацетофенона (идентифицирован методом ГЖХ и ВЭЖХ).
Цель данной работы заключалась в изучении промежуточных и конечных продуктов реакции Ь-селеноцистеина с диацетофенонил-селенидом методами ВЭЖХ и ТСХ для подтверждения предложенной схемы реакции, а также для прогноза пути метаболизма диацето-фенонилселенида и Ь-селеноцистеина в биологических средах.
Материалы и методы исследования
Для идентификации пиков в качестве веществ-стандартов использовали ацетофенон, боргидрид натрия (ЗАО «Вектон»), диацетофенонилселенид (ЗАО «Сульфат»).
Селеноцистин синтезировали по методике 13. Аналитический контроль синтезированного Ь-селеноцистина и его сравнение с образцами аминокислоты фирмы «Сигма Элдридж» (Sigma-Aldгich) проводились в соответствии с методикой 14.
Использовали микроколоночный жидкостной хроматограф Милихром А-02 (ЗАО «ЭкоНова»), хроматографическую колонку 2.0 х 75 мм, заполненную сорбентом Ргоп1оБП-120-5С18АО зернением 5.0 мкм. Элюировали в градиентном режиме при концентрации аце-тонитрила 2—90 % (по объему). Подвижная фаза А: 0.2 М раствор ЫС104 и 0.005 М НС104 (ЗАО «ЭкоНова»), подвижная фаза Б: ацетонитрил (НПК «Криохром»).
Дополнительно ход реакций и индивидуальность полученных соединений контролировали методом восходящей ТСХ на пластинах Сорбфил. После элюирования в системе растворителей и-бутанол-уксусная кислота-вода (4 : 1 : 1) и высушивания пластины пятна проявляли: 1) опрыскиванием 0.5%-ным раствором нингидрина в изопропаноле; 2) опрыскиванием 0.5%-ным раствором гидрохлорида цистеина в диметилформамиде с последующим выдерживанием в парах аммиака до образования окрашенных в красный цвет зон. Для обнаружения пятен диацетофенонилселе-нида и продуктов реакции до проявления использовали облучатель УФС-254/365 с длиной волны 254 нм.
Для исследования взаимодействия диаце-тофенонилселенида с Ь-селеноцистеином стабильный при хранении Ь-селеноцистин I растворяли в 0.1М Ка2С03 и восстанавливали
боргидридом натрия, затем раствор подкисляли до рН 2.0 раствором HCl (1:1) (схема 1).
Диацетофенонилселенид II растворяли в нескольких каплях ацетона, добавляли метанол, смешивали оба раствора и использовали водно-метанольные смеси этих соединений при различных концентрациях и рН растворов. Для обнаружения полупродуктов реакции использовали молярные соотношения диацето-фенонилселенида и L-селеноцистина 1 : 1, а для изучения продуктов реакции — 1 : 4.
Результаты и обсуждение
L-селеноцистеин взаимодействует с соединениями, содержащими сульфгидрильные группы, в целом аналогично предложенной в наших
HOOC—CH—CH2 I
NH2
-Se
работах 9-11 схеме взаимодействия диацетофено-нилселенида, На первом этапе образуются полупродукт — 5-(ацетофенилселенил)селеноцисте-ин III и ацетофенон IV (схема 2).
В работе 11 показано, что в сильнокислом растворе (рН 1.8) данная реакция между диаце-тофенонилселенидом и восстановленным глута-тионом практически не идет, по-видимому, из-за подавления диссоциации SH-группы и нуклео-фильных свойств атома серы восстановленного глутатиона. Однако селеноцистеин более активен и реакция идет и в кислом растворе (рН 2.0), так как величина его рКа равна 5.2, что намного меньше рКа цистеина (8.3) 15 (рис.1,2).
В сильнокислом (рН 2.0) или слабокислом (рН 4.0) растворах на хроматограмме кроме диацетофенонилселенида II появляется пик
NaBH4
Схема 1.
HOOC—CH—CH2—Se I 2
NH2
Z-селеноцистин (I)
-»► 2HSe—CH2—CH—COOH
I
NH2
Z-селеноцистеин
Схема 2.
O
O
/ y—C— CH2—Se—CH2—C—/ 4 + HSe—CH2—CH—COOH-
NH2
Диацетофенонилселенид (II)
O
O
0 ^—C— CH2—Se—Se—CH2—CH—COOH + H3C—C—# ^
NH2
5"-(ацетофенилселенил)селеноцистеин (III)
Ацетофенон (IV)
Рис. 1. Хроматограмма реакционной смеси, полученной при взаимодействии диацетофенонилселенида и Ь-селеноцистеина (молярное соотношение 1 : 1, рН 2.0).
Рис.2. Хроматограмма реакционной смеси, полученной при взаимодействии диацетофенонилселенида и Ь-селеноцистеина (молярное соотношение 1 : 1, рН 4.0).
ацетофенона IV с объемом удерживания 1322 мкл (рис. 1,2), пик 5-(ацетофенилселенил)се-леноцистеина III с объемом удерживания 1066 мкл, и пик с объемом удерживания 175 мкл, соответствующий L-селеноцистину I.
В спектре поглощения 5-(ацетофенилсе-ленил)селеноцистеина в остановленном потоке имеется максимум при 254 нм, характерный для веществ с бензольным кольцом в молекуле (рис. 3).
С увеличением соотношения L-селеноцис-теин-диацетофенонилселенид до 4 : 1 и повышением рН с 4 до 7 образуются конечные про-
дукты реакции: Ь-селеноцистин, ацетофенон, элементный селен (схема 3).
Анализ результатов, представленных на рис. 4 и 5, показал, что именно увеличение соотношения Ь-селеноцистеин — диацетофенонилсе-ленид до 4 : 1 в нейтральной среде (в соответствии со стехиометрией реакции) приводит к образованию только продуктов реакции в отличие от реакций с избытком диацетофенонилселени-да. Идентификация методом ВЭЖХ продуктов реакции между диацетофенонилселенидом и Ь-селеноцистеином в целом подтверждает приведенную выше схему реакции.
O
С \—С— CH2—S^Se—CH2—CH—COOH + HSe—CH2—CH—COOH
nh2 nh2
5-(ацетофенилселенил)селеноцистеин (III)
O
HOOC—HC—H2C—S^S^Se—CH2—CH—COOH + H3C—C—" ^
nh2 nh2
Триселеноцистин Ацетофенон (IV)
HOOC—HC—H2C—Se—Se—Se—CH2—CH—COOH +2HSe—CH2—CH—COOH-I 2 2 I I
NH2 NH2 NH2
HOOC—CH—CH2—Se
I
NH2
O2
+ H2Se -H2O + Set
HOOC—CH—CH2—Se ~ „
I z Элементный
Nh2 селен
Z-селеноцистин (I)
Схема 3.
Рис. 3. Спектр поглощения ^-(ацетофенилселенил)селеноцистеина в остановленном потоке.
Рис.4. Хроматограмма реакционной смеси, полученной при взаимодействии диацетофенонилселенида и Ь-селеноцистеина (молярное соотношение 4 : 1, рН 2.0).
Рис.5. Хроматограмма реакционной смеси, полученной при взаимодействии диацетофенонилселенида и Ь-селеноцистеина (молярное соотношение 4 : 1, рН 7.0).
Применение восходящей ТСХ также подтверждает образование основного полупродукта реакции — 5-(ацетофенилселенил)селеноци-стеина III. При УФ-облучении на пластине можно выделить диацетофенонилселенид I и 5-(ацетофенилселенил)селеноцистеина III, так как для них, как и для большинства ароматических соединений характерно поглощение света в области 254 нм, Однако при соотношении реагентов 1 : 4 ни диацетофенонилселенид, ни 5-(ацетофенилселенил)селеноцистеин не обнаруживаются. Ацетофенон IV в данных условиях определить сложно, так как он частично улетучивается при сушке пластины, частично поднимается с фронтом растворителя подвижной фазы.
На дублирующей пластине пятна, соответствующее 5-(ацетофенилселенил)селеноцисте-ину, вырезали с подложкой, элюировали смесью вода-ацетонитрил (1 : 1) и анализировали методом ВЭЖХ. Время удерживания и спектр вещества в остановленном потоке полностью идентичны приведенным выше данным. S-(ацетофенилселенил) селеноцистеин III содержит остаток аминокислоты и его можно идентифицировать раствором нингидрина (Rf =
0.57.. В варианте с соотношением реагентов 1 : 4 S-(ацетофенилселенил)селеноцистеин отсутствует. Кроме того, для обнаружения диацето-фенонилселенида и S-(ацетофенилселенил)се-леноцистеина использовали качественную реакцию с цистеином, в результате которой выделяется элементный селен (рис. 6) 10.
Литература
1. Bebne D., Weiss-Nowak C., Kalckloscb M., Westphal C., Gessner H., Kyriakopoulos A. Studies in distribution and characteristics of new mammalian selenium-containing proteins // Analyst.- 1995.- V.120.- Pp.823-825.
2. Полубояринов П. А., Дерягина В. П., Глебова Н.Н., Моисеева И.Я., Швец В.И. Токсичность L-селеноцистина и его влияние на рост перевиваемой метастазирующей карциномы легких Льюиса // Биофармацевтический журнал.-2018.- Т.10, №3.- С.76-81.
3. Fairweather-Tait S.J., Bao Y., Broadley M.R., Collings R., Ford D., Hesketh J.E. Hurst R. Selenium in Human Health and Disease // Antioxidants & Redox Signaling.- 2011.- V.14, №7.- Pp.1337-1383.
4. Berry M.J., Banu L., Harney J.W., Larsen P.R. Functional characterization of the eukaryotic secis elements which direct selenocysteine insertion at UGA codons // The EMBO Journal.- 1993.- V.12, №8.- Pp.3315-3322.
5. Rooseboom M., Vermeulen N.P., Andreadou I., Commandeur J.N. Evaluation of the Kinetics of
IJ
I II gg
t| ♦
III HI
III
1 I
Рис.6. Хроматограмма, обработанная 0.1%-ным раствором цистеина.
L-селеноцистин I практически не сдвигался с места старта, а проявление хроматограм-мы цистеином показало наличие селена в молекуле S-(ацетофенилселенил)селеноцистеина III. Образование элементного селена подтвердили с помощью реакции Файглея-Веста 12. В общем, хроматографический анализ методом восходящей ТСХ позволяет подтвердить наличие основного полупродукта реакции - S-^це-тофенилселенил)селеноцистеина III, в состав молекулы которого входят бензольное кольцо, остаток селеноцистеина и селен, определяемый качественной реакцией.
References
1. Bebne D., Weiss-Nowak C., Kalckloscb M., Westphal C., Gessner H., Kyriakopoulos A. [Studies in distribution and characteristics of new mammalian selenium-containing proteins]. Analyst, 1995, vol.120, pp.823-825.
2. Poluboyarinov P.A., Deryagina V.P., Glebova N.N., Moiseeva I.Y., Schvets V.I. [L-selenocystine toxicity and its effect on growth of transplanted metastasizing Lewis carcinoma of lung]. Russian Journal of Biopharmaceuticals, 2018, vol.10, no.3, pp.76-81.
3. Fairweather-Tait S.J., Bao Y., Broadley M.R., Collings R., Ford D., Hesketh J.E. Hurst R. Selenium in Human Health and Disease. // Antioxidants & Redox Signaling, 2011, vol.14, no.7, pp.1337-1383.
4. Berry M.J., Banu L., Harney J.W., Larsen P.R. [Functional characterization of the eukaryotic secis elements which direct selenocysteine insertion at UGA codons]. The EMBO Journal, 1993, vol.12, no.8, pp.3315-3322.
5. Rooseboom M., Vermeulen N.P., Andreadou I., Commandeur J.N. [Evaluation of the Kinetics of
^-Elimination Reactions of Selenocysteine Se-Conjugates in Human Renal Cytosol: Possible Implications for the Use as Kidney Selective Prodrugs // J. Pharmacol. Exp Ther.— 2000.— V.294, №2.- Pp.762-769.
6. Blinokhvatov A.F., Ivanova N.N., Klimenko S.K. H/D isotope exchange in 9-_R-sym-octahydro-10-oxonia(chalcogenonia)anthracene perchlorates // Chemistry of Heterocyclic Compounds.- 1993.- V.29, №4.- C.390-394.
7. Пат. №2051681 РФ Средство для лечения и профилактики болезней, вызываемых недостаточностью селена в организме животных и птицы / Древко Б.И., Антипов В.А., Жуков О.И. // Б.И.-1996.- №1.
8. Engman L., Andersson C., Morgenstern R., Cotgreave I.A., Andersson C.M., Hallberg A. Evidence for a common selenolate intermediate in the glutathione peroxidase-like catalysis of a-(phenylselenenyl) ketones and diphenyl diselenide // Tetrahedron.- 1994.- V.50, №9.-Pp.2929-2938.
9. Полубояринов П. А., Вихрева В. А., Лещенко П.П., Ариповский А.В., Лихачев А.Н. Образование элементарного селена при распаде молекулы селенорганического препарата ДАФС-25 под влиянием растущего мицелия грибов // Вестник МГУ им. М. В. Ломоносова. Серия 16. Биология.- 2009.- №4.- С.33-37.
10. Полубояринов П.А., Лещенко П.П. Качественная реакция на цистеин, восстановленный глу-татион и диацетофенонилселенид // Журнал аналитической химии.- 2013.- Т.68, №11.-С.1063-1069.
11. Полубояринов П.А., Лещенко П.П., Моисеева И.Я., Колесникова С.Г., Эпштейн Н.Б. Механизм реакции элиминирования селена в диаце-тофенонилселениде под действием восстановленного глутатиона // Журнал аналитической химии.- 2017.- Т.72, №7.- С.633-638.
12. Назаренко И.И., Ермаков А.Н. Аналитическая химия селена и теллура.- М.: Наука, 1971.248 с.
13. Патент № 2537166 РФ Способ получения биологически активного вещества - селеноцистина / Полубояринов П.А., Шаронов Г.И., Лещенко П.П. // Б.И.- 2014.- № 36.
14. Полубояринов П. А., Моисеева И.Я., Глебова Н.Н., Чумакова О. А. Аналитические методы определения аминокислоты L-селеноцистина // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки.- 2017.-Т.18, №2.- С.30-36.
15. Huber R.E., Criddle R.S. Comparison of the chemical properties of selenocysteine and selenocystine with their sulfur analogs // Arch. Biochem. Biophys.- 1967.- V.122.- Pp.164-173.
¿6-Elimination Reactions of Selenocysteine Se-Conjugates in Human Renal Cytosol: Possible Implications for the Use as Kidney Selective Prodrugs]. J. Pharmacol. Exp Ther., 2000, vol.294, no.2, pp.762-769.
6. Blinokhvatov A.F., Ivanova N.N., Klimenko S.K. [H/D isotope exchange in 9-_R-sym-octahydro-10-oxonia(chalcogenonia)anthracene perchlorates]. Chemistry of Heterocyclic Compounds, 1993, vol.29, no.4, pp.390-394.
7. Drevko B.I., Antipov V.A., Zhukov O.I.
Sredstvo dlya lecheniya i profilaktiki bolezney, vyzyvayemykh nedostatochnost'yu selena v organizme zhivotnykh i ptitsy [Means for the treatment and prevention of diseases caused by selenium deficiency in animals and poultry] Patent RF, no.2051681, 1996.
8. Engman L., Andersson C., Morgenstern R., Cotgreave I. A., Andersson C.M., Hallberg A. [Evidence for a common selenolate intermediate in the glutathione peroxidase-like catalysis of a-(phenylselenenyl) ketones and diphenyl diselenide]. Tetrahedron, 1994, vol.50, no.9, pp.2929-2938.
9. Poluboyarinov P.A., Vikhreva V.A., Leshchenko P.P., Aripovskii A.V., Likhachev A.N. [Elemental selenium formation upon destruction of the organoselenium compound DAFS-25 molecule by growing fungal mycelium] Moscow University Biological Sciences Bulletin, 2009, vol.64, no.4, pp.164-168.
10. Poluboyarinov P. A., Leshchenko P.P. [A qualitative reaction for cysteine, reduced glutathione, and diacetophenonyl selenide]. Journal of Analytical Chemistry, 2013, vol.68, no.11, pp.949-952.
11. Poluboyarinov P.A., Leshchenko P.P., Moiseeva I.Y., Kolesnikova S.G., Epshtein N.B. [Mechanism of reaction of selenium elimination in diacetophenonyl selenide under the action of reduced glutathione]. Journal of Analytical Chemistry, 2017, vol.72, no.7, pp.739-744.
12. Nazarenko I.I., Ermakov A.N. Analiticheskaya khimiya selena i tellura [Analytical chemistry of selenium and tellurium]. Moscow, Nauka Publ., 1971, 248 p.
13. Poluboyarinov P.A., Sharonov G.I., Leshchenko P.P. Sposob polucheniya biologicheski aktivnogo veshchestva — selenotsistina [A method for obtaining a biologically active substance — selenocistin]. Patent RF, no.2537166, 2014.
14. Poluboyarinov PA, Moiseeva I.Ya., Glebova N.N., Chumakova O.A. Analiticheskiye metody opredeleniya aminokisloty L-selenotsistina [Analytical methods for determining the amino acid L-selenocystin]. Izvestiya vysshikh uchebnykh zavedeniy. Povolzhskiy region. Yestestvennyye nauki [News of higher educational institutions. Volga region. Natural Sciences], 2017, vol.18, no.2, pp.30-36.
15. Huber R.E., Criddle R.S. [Comparison of the chemical properties of selenocysteine and selenocystine with their sulfur analogs]. Arch. Biochem. Biophys., 1967, vol.122, pp.164-173.
