Научная статья на тему 'Аналитические методы определения аминокислоты l-селеноцистина'

Аналитические методы определения аминокислоты l-селеноцистина Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
461
62
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
СЕЛЕНОЦИСТИН / ТОНКОСЛОЙНАЯ ХРОМАТОГРАФИЯ / ТСХ / КАПИЛЛЯРНЫЙ ЭЛЕКТРОФОРЕЗ / L-SELENOCYSTINE / THIN LAYER CHROMATOGRAPHY (TLC) / CAPILLARY ELECTROPHORESIS

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Полубояринов Павел Аркадьевич, Моисеева Инесса Яковлевна, Глебова Наталья Николаевна, Чумакова Ольга Александровна

Актуальность и цели. L-cеленоцистеин (окисленная форма l-селеноцистин) 21-я протеиногенная аминокислота, самое значимое природное соединение селена и перспективное вещество для коррекции его дефицита в питании человека. Важным этапом работы над l-селеноцистином является разработка аналитических методов идентификации и количественного определения аминокислоты. Материалы и методы. Для аналитического детектирования l-селеноцистина использовался метод восходящей ТСХ и метод капиллярного электрофореза на приборе Капель 105М. Элементный анализ проводился методом высокотемпературного сжигания на приборе vario El cube производства Еlementаr Аnаlysensysteme (Германия). Спектры ЯМР 1Н и 13С аминокислоты записаны на спектрометре Vаriаn 400, с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно. Результаты. Разработаны методы аналитического детектирования аминокислоты l-селеноцистина. Также исследована идентичность l-селеноцистина методами элементного анализа и 1Н, 13С ЯМР-спектроскопией. Выводы. В результате проведенных исследований разработаны методики аналитического определения аминокислоты l-селеноцистина методами восходящей ТСХ и капиллярного электрофореза. Определена идентичность аминокислоты элементным анализом и 1Н, 13С ЯМР-спектроскопией.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Полубояринов Павел Аркадьевич, Моисеева Инесса Яковлевна, Глебова Наталья Николаевна, Чумакова Ольга Александровна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Background. L-selenocystein (oxidized form of selenocystine) the 21st proteinogenic aminoacid, the most significant natural selenium compound and a promising substance for correction of human selenium deficiency. An important stage of operations with l-selenocystine is the development of analytical methods of l-selenocystine identification and quantitative determination. Materials and methods. TLC, capillary electrophoresis (Kapel 105 M) were used for detection of l-selenocystine. An elemental analysis was carried out on a vatio El cube Elementar Analysensysteme (Germany). NMR1H and 13C spectra were obtained on a Varian 400 spectrophotometer with operating frequencies of 400 and 100 MHz accordingly. Results. The purity of l-selenocystine was evaluated using thin layer chromatography (TLC) and capillary electrophoresis. The structure of l-selenocystine was proved via the elemental analysis and 1H and 13C NMR methods. Conclusions. As a result of the research carried out there have been developed analytical methods of l-selenocystine determination using TLC and capillary electrophoresis. The chemical structure of l-selenocystibe has proved via the elemental analysis and 1Н, 13С NMR spectrometry.

Текст научной работы на тему «Аналитические методы определения аминокислоты l-селеноцистина»

УДК 543.61, 543.64

DOI: 10.21685/2307-9150-2017-2-4

П. А. Полубояринов, И. Я. Моисеева, Н. Н. Глебова, О. А. Чумакова

АНАЛИТИЧЕСКИЕ МЕТОДЫ ОПРЕДЕЛЕНИЯ АМИНОКИСЛОТЫ l-СЕЛЕНОЦИСТИНА

Аннотация.

Актуальность и цели. L-селеноцистеин (окисленная форма - l-селеноцис-тин) - 21-я протеиногенная аминокислота, самое значимое природное соединение селена и перспективное вещество для коррекции его дефицита в питании человека. Важным этапом работы над l-селеноцистином является разработка аналитических методов идентификации и количественного определения аминокислоты.

Материалы и методы. Для аналитического детектирования l-селеноцисти-на использовался метод восходящей ТСХ и метод капиллярного электрофореза на приборе Капель 105М. Элементный анализ проводился методом высокотемпературного сжигания на приборе vario El cube производства Elementar Analysensysteme (Германия). Спектры ЯМР 1Н и 13С аминокислоты записаны на спектрометре Varian 400, с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно.

Результаты. Разработаны методы аналитического детектирования аминокислоты l-селеноцистина. Также исследована идентичность l-селеноцистина методами элементного анализа и 1Н, 13С ЯМР-спектроскопией.

Выводы. В результате проведенных исследований разработаны методики аналитического определения аминокислоты l-селеноцистина методами восходящей ТСХ и капиллярного электрофореза. Определена идентичность аминокислоты элементным анализом и 1Н, С ЯМР-спектроскопией.

Ключевые слова: селеноцистин, тонкослойная хроматография, ТСХ, капиллярный электрофорез.

P. A. Poluboyarinov, I. Ya. Moiseeva, N. N. Glebova, O. A. Chymakova

ANALYTICAL METHODS OF l-SELENOCYSTINE DETERMINATION

Abstract.

Background. L-selenocystein (oxidized form of selenocystine) - the 21st protei-nogenic aminoacid, the most significant natural selenium compound and a promising substance for correction of human selenium deficiency. An important stage of operations with l-selenocystine is the development of analytical methods of l-selenocystine identification and quantitative determination.

Materials and methods. TLC, capillary electrophoresis (Kapel 105 M) were used for detection of l-selenocystine. An elemental analysis was carried out on a vatio El cube Elementar Analysensysteme (Germany). NMR1H and 13C spectra were obtained on a Varian 400 spectrophotometer with operating frequencies of 400 and 100 MHz accordingly.

Results. The purity of l-selenocystine was evaluated using thin layer chromato-graphy (TLC) and capillary electrophoresis. The structure of l-selenocystine was proved via the elemental analysis and 1H and 13C NMR methods.

Conclusions. As a result of the research carried out there have been developed analytical methods of l-selenocystine determination using TLC and capillary elect-rophoresis. The chemical structure of l-selenocystibe has proved via the elemental analysis and 1Н, 13С NMR spectrometry.

Key words: l-selenocystine, thin layer chromatography (TLC), capillary electrophoresis.

Селеноцистеин (Sec) (окисленная форма - селеноцистин (Sec-Sec)) -21-я протеиногенная аминокислота, которую на матричной РНК кодирует терминирующий кодон UGA при условии, что за ним следует особая стимулирующая последовательность нуклеотидов [1]. Это самое значимое природное соединение селена, а все остальные, найденные в природных источниках, либо лежат на пути его биосинтеза (интермедиаты), либо являются его метаболитами [2].

На кафедре «Физики и химии» Пензенского государственного университета архитектуры и строительства (автор - П. А. Полубояринов) был разработан и проведен синтез селенсодержащей аминокислоты l-селеноцистина и получен патент № 2537166 (РФ).

По совокупности таких признаков, как доступность, стабильность, широкий ассортимент исходных соединений и низкая стоимость реагентов; простота выделения (фильтрация), высокие выходы, стабильность и низкая токсичность целевого продукта (l-селеноцистин), несложное аппаратное оформление процесса, позволяют оценить разработанный метод как отвечающий требованиям промышленного производства.

Целью данной работы является разработка аналитического контроля l-селеноцистина методом тонкослойной хроматографии и капиллярного электрофореза, а также определение идентичности аминокислоты методом элементного анализа и 1Н, 13С ЯМР-спектроскопией.

Материалы и методы

Для анализов использовались образцы l-селеноцистина фирмы «Сигма Элдридж» (Sigma-Aldrich) и l-селеноцистин, синтезированный на кафедре «Физики и химии» ПГУАС.

Хроматографические тесты проводили на пластинах Сорбфил методом восходящей ТСХ.

Пробы наносили на пластины с помощью микрошприца вместимостью 10 мкл.

После элюирования в системе растворителей изопропиловый спирт-раствор аммиака 25 % (7 : 3) и высушивания пластины пятна l-селеноцистина проявляли опрыскиванием 0,5 %-м раствором нингидрина в изопропиловом спирте.

Также анализ l-селеноцистина проводили методом капиллярного электрофореза на приборе Капель 105М фирмы «Люмекс». Пробоподготовку и анализ проводили по методике [3]. Для приготовления запасного раствора селеноцистина, массовой концентрации 2 г/дм в стеклянный бюкс помещали навеску 0,020 (± 0,001) г селеноцистина, приливали 0,5 мл 1М соляной кислоты, тщательно перемешивали и добавляли 4,5 мл дистиллированной воды. Для приготовления рабочего раствора в стеклянную емкость вводили 0,15 см3 раствора селеноцистина и 1,85 дистиллированной воды. Увеличение массовой концентрации селеноцистина в рабочем растворе в 3 раза по сравнению со стандартной методикой связано с его высокой молекулярной массой, превосходящей большинство аминокислот в 2-3 раза, по этой причине при одной и той же концентрации уровень аналитического сигнала l-селеноцистина существенно ниже (табл. 1).

Таблица 1

Рабочие градуировочные и контрольные растворы 1-селеноцистина

Обозначение раствора Объем смеси 3 аминокислоты, см Массовая концентрация аминокислоты в растворе, мг/дм3

№ 1 0,1 60

№ 2 0,2 120

№ 3 0,3 180

Контрольный раствор 0,15 90

Для получения фенилтиокарбамильного производного (ФТК-производ-ное) аминокислоты 0,1-0,3 см3 раствора l-селеноцистина выпаривали досуха в струе горячего воздуха, затем добавляли 0,15 мл 0,1 молярного раствора карбоната натрия и 0,3 мл раствора фенилизотиоционата (ФИТЦ). Тщательно перемешивали и оставляли на 35 мин. Затем растворы выпаривали и сухой остаток растворяли в 0,5 мл дистиллированной воды. Пробу центрифугировали (5000 об. мин). Анализ проводили на приборе Капель 105 М в стандартном фосфатном буфере (pH = 7,8, фосфат-ионов 30 ммоль/дм3) с ß-цикло-декстрином (4 ммоль/л) при длине волны 254 нм и напряжении 25 кВ.

Элементный анализ l-селеноцистина проводился на приборе vario El cube производства Elementar Analysensysteme (Германия).

Спектры ЯМР 'Н и С l-селеноцистина записаны на спектрометре Varian 400, с рабочими частотами 400 и 100 МГц соответственно. L-селено-цистин растворяли в D2O + 60 мкл 50 % ортофосфорной кислоты.

Результаты и обсуждение

Анализ методом тонкослойной хроматографии l-селеноцистина фирмы «Сигма Элдридж» как визуально, так и на денситометре «Сорбфил» показал наличие двух нингидрин-положительных пиков: l-селеноцистин (Rf = 0,27) и примесь (Rf = 0,21) (рис. 1).

ft¡ )

И

ь

i

1

h : J

\ !\

i - Г\ ¡¿т.

Rf

Рис. 1. Денситограмма l-селеноцистина (I) фирмы «Сигма Элдридж» (Sigma-Aldrich)

Анализ хроматограммы синтезированного 1-селеноцистина показал наличие одного пика (^ = 0,25), соответствующего данной аминокислоте (рис. 2). Это говорит о большей химической чистоте 1-селеноцистина, синтезированного в ПГУАС.

Рис. 2. Денситограмма l-селеноцистина (I), синтезированного на кафедре «Физики и химии» ПГУАС

Дальнейшее исследование аминокислоты l-селеноцистина проводили методом капиллярного электрофореза. Время выхода пиков l-селеноцистина обоих образцов аминокислоты совпадали и проходили на 16,577 и 16,770 мин, что говорит об их полной идентичности.

Добавление l-селеноцистина в различных концентрациях к стандартному раствору из 14 аминокислот, используемых в методике [3], показало возможность определения l-селеноцистина в данной смеси, так как выход пика аминокислоты проходил на 16 мин и не мешал определению остальных аминокислот (рис. 3).

При анализе биологических объектов серосодержащую аминокислоту цистин из-за слабой устойчивости при кислотном гидролизе окисляют окислительной смесью до цистеиновой кислоты и анализируют в такой форме. По литературным данным [4] и нашим исследованиям [5], l-селеноцистин в результате такой обработки разрушается полностью и для его анализа в биологических объектах требуется его перевод в другие производные, что требует дальнейших исследований.

Элементный анализ проводился на приборе vario El cube производства Elementar Analysensysteme (Германия) (табл. 2).

Элементный анализ показал соответствие содержания азота, водорода и углерода в молекуле l-селеноцистина, синтезированного на кафедре «Физики и химии» ПГУАС, расчетным данным и данным более ранних исследований.

Спектр ЯМР 1H l-селеноцистина: группы СН2 3.18 м.д., 2Н д.д. J=14 Гц, 8 Гц и 3.32 м.д., д.д., J=14 Гц, 5 Гц; CH группы 4.18 м.д., 1Н, д.д., J=8 Гц, 5 Гц. Из-за дейтерообмена сигналы карбоксильной и аминогрупп не различимы. Спектр ЯМР 13С l-селеноцистина: 26.6 (СН2), 52.9 (СН), 170.5 (СООН).

uoißaj oßjo/\ sßujpaaDOjd Ä;isj3Aiup

PS

Homad ппяэжиоэоц 'ппнаравое хпндэиА хптэпа нпшэээеи

Таблица 2

Данные элементного анализа l-селеноцистина

Название/формула вещества

l-селеноцистин/ Mr (C6Hi2N2Se2O4) = 334,09 г/моль

Определяемый элемент С Н N

Вычислено, % 21,58 3,59 8,38

Найдено (данная работа), % 22,29 3,61 8,63

Данные фирмы «Сигма-Элдриж», % 20,30-22,70 - 7,90-8,80

Данные работы [6],% 21,19 3,70 8,37

Таким образом, в результате проведенных исследований разработаны

методы аналитического контроля аминокислоты l-селеноцистина - восходящей ТСХ и капиллярным электрофорезом. Определена идентичность аминокислоты элементным анализом и :Н, 13С ЯМР-спектроскопией.

Библиографический список

1. Berry, M. J. Functional characterization of the eukaryotic secis elements which direct selenocysteine insertion at UGA codons / M. J. Berry, L. Banu, J. W. Harney, P. R. Larsen // The EMBO Journal. - 1993. - Vol. 12 (8). - P. 3315-3322.

2. Селен в организме человека: метаболизм, антиоксидантные свойства, роль в канцерогенезе / В. А. Тутельян, В. А. Княжев, Н. А. Голубкина, Н. Е. Кушлинский, С. А. Хотимченко, Я. А. Соколов. - М. : Изд-во РАМН, 2002. - 224 с.

3. Методика измерений массовой доли аминокислот методом капиллярного электрофореза с использованием системы капиллярного электрофореза «Капель» / ООО «Люмэкс-маркетинг». - СПб., 2014. - 49 с. - (Корма, комбикорма и сырье для их производства).

4. Turlo, J. Relationship between the selenium, selenomethionine, and selenocysteine content of submerged cultivated mycelium of Lentinula edodes (Berk.) / J. Turlo, B. Gutkowska, E. Malinowska // Acta chromatographica. - 2007. - № 18. - P. 36-48.

5. Poluboyarinov, P. A. Selenocystine synthesis and prospects of its utilization in correction of selenium deficiency / P. A. Poluboyarinov // Микроэлементы в медицине. - 2015. - Т. 16 (4). - С. 45-50.

6. Chocat, P. Synthesis of l-selenodjenkolate and its degradation with methionine y-lyas / P. Chocat, N. Esaki, H. Tanaka, K. Soda // Analytical Biochemistry. - 1985. - № 148. -P. 485-489.

References

1. Berry M. J., Banu L., Harney J. W., Larsen P. R. The EMBO Journal. 1993, vol. 12 (8), pp. 3315-3322.

2. Tutel'yan V. A., Knyazhev V. A., Golubkina N. A., Kushlinskiy N. E., Khotimchen-ko S. A., Sokolov Ya. A. Selen v organizme cheloveka: metabolizm, antioksidantnye svoystva, rol' v kantserogeneze [Selenium in human organism: metabolism, antioxidant properties, the role in carcinogenesis]. Moscow: Izd-vo RAMN, 2002, 224 p.

3. Metodika izmereniy massovoy doli aminokislot metodom kapillyarnogo elektroforeza s ispol'zovaniem sistemy kapillyarnogo elektroforeza «Kapel'» [The technique of measuring amino acid mass fractions by means of capillary electrophoresis using the "Kapel" capillary electrophoresis system]. OOO «Lyumeks-marketing». Saint-Petersburg, 2014, 49 p.

4. Turlo J., Gutkowska B., Malinowska E. Acta chromatographica. 2007, no. 18, pp. 36-48.

5. Poluboyarinov P. A. Mikroelementy v meditsine [Microelements in medicine]. 2015, vol. 16 (4), pp. 45-50.

6. Chocat P., Esaki N., Tanaka H., Soda K. Analytical Biochemistry. 1985, no. 148, pp. 485-489.

Полубояринов Павел Аркадьевич

кандидат сельскохозяйственных наук, доцент, и. о. заведующего кафедрой инженерной экологии, Пензенский государственный университет архитектуры и строительства (Россия, г. Пенза, ул. Г. Титова, 28)

E-mail: [email protected]

Моисеева Инесса Яковлевна доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой общей и клинической фармакологии, декан лечебного факультета, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)

E-mail: [email protected]

Глебова Наталья Николаевна старший преподаватель, кафедра общей и клинической фармакологии, Пензенский государственный университет (Россия, г. Пенза, ул. Красная, 40)

E-mail: [email protected]

Чумакова Ольга Александровна старший преподаватель, кафедра инженерной экологии, Пензенский государственный университет архитектуры и строительства (Россия, г. Пенза, ул. Г. Титова, 28)

E-mail: [email protected]

Poluboyarinov Pavel Arkadyevich Candidate of agricultural sciences, associate professor, acting head of sub-department of engineering ecology, Penza State University of Architecture and Construction (28 G. Titova street, Penza, Russia)

Moiseeva Inessa Yakovlevna

Doctor of medical scienses, professor, head

of sub-department of general and clinical

pharmacology, dean of the faculty

of general medicine, Penza State

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.

University (40 Krasnaya street,

Penza, Russia)

Glebova Natali Nikolaevna Senior lecturer, sub-department of general and clinical pharmacology, Penza State University (40 Krasnaya street, Penza, Russia)

Chymakova Olga Aleksandrovna Senior lecturer, sub-department of engineering ecology, Penza State University of Architecture and Construction (28 G. Titova street, Penza, Russia)

УДК 543.61, 543.64 Полубояринов, П. А.

Аналитические методы определения аминокислоты 1-селеноцисти-

на / П. А. Полубояринов, И. Я. Моисеева, Н. Н. Глебова, О. А. Чумакова // Известия высших учебных заведений. Поволжский регион. Естественные науки. - 2017. - № 2 (18). - С. 30-36. БОТ: 10.21685/2307-9150-2017-2-4

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.