CC BY
42ФИЗИОЛОГИЯ
УДК 612.1
А. И. Володченко, В. И. Циркин, А. А. Костяев
Механизм влияния адреналина на скорость агглютинации эритроцитов человека
В опытах с адреналином, фенилэфрином, гинипралом, ницерголином, йохимбином, обзиданом и атенололом показано, что скорость агглютинации эритроцитов человека возрастает при активации альфа1-адренорецепторов (АР) и снижается при активации бета2-АР. Опыты с индометацином, трифлуоперазином и ВаС12 указывают на то, что активация альфа1-АР повышает активность фосфоли-пазы А2, кальмодулина и вход Са2+.
Ключевые слова: эритроциты, агглютинация, адреналин, адренорецепторы, кальмодулин, фосфолипаза А2.
А. I. Volodchenko, V. I. Tsirkin, А. А. Kostyaev
The Mechanism of Adrenaline Influence on Speed of Agglutination of the Person's Erythrocytes
In experiments with adrenaline, phenylephrine, ginipral, nicergoline, yohimbine, obzidan, atenolol it is shown that the rate of agglutination of human erythrocytes is increased with alpharadrenergic receptor (AR) activation and reduced activation of beta2-AR. Experiments with indo-metacin, trifluoperazine and BaCl2 indicate that activation of alpharAR increases the activity of phospholipase A2, calmodulin, and Ca2+ entry.
Keywords: erythrocytes, agglutination, adrenaline, an adrenergic receptor, calmodulin, phospholipase A2.
Агглютинация эритроцитов, как известно [3], представляет собой склеивание антигеннесущих эритроцитов с помощью молекул специфических антител или агглютининов, относящихся к классам ^О и ^М, в присутствии электролитов, которое заканчивается образованием видимых невооруженным глазом хлопьев или осадка (агглю-тината). Агглютинация протекает в две фазы [4]. В первой, или латентной, фазе происходит специфическое взаимодействие активного центра антител с детерминантами антигенов. Эта стадия не сопровождается видимыми изменениями реагирующей системы и может происходить в отсутствие электролитов. Во второй фазе происходит образование агглютината. Для нее обязательно наличие электролитов, которые снижают электрический заряд комплексов антиген-антитело и ускоряют процесс склеивания эритроцитов.
Было установлено, что адреналин влияет на скорость агглютинации [1, 6, 10]. Исходя из данных о существовании в эритроцитах популяций альфа1-, альфа2-, бета1- и бета2-адренорецепторов (АР) [11], В. И. Циркин и соавт. [10] высказали
предположение о том, что увеличение скорости агглютинации под влиянием адреналина связано с активацией альфа-АР и, частично, бета2-АР, а снижение - с активацией бета1-АР [10]. Однако убедительных доказательств этого предположения до настоящего времени не было.
С учетом всего сказанного целью нашей работы являлось изучение механизма, лежащего в основе способности адреналина изменять скорость агглютинации эритроцитов человека.
Материалы и методы
В исследовании использовали венозную кровь, полученную в объеме 2-4 мл от 80 мужчин-доноров станции Кировского НИИ гематологии и переливания крови в возрасте от 18 до 30 лет, имеющих II, III или IV группу крови. При заборе крови она смешивалась с гепарином (50 Ед/мл) в соотношении 4:1.
Всего проведено 250 опытов, условно разделенных на 15 серий (табл.), в которых оценивалось влияние на агглютинацию адреналина и ад-реномиметиков (фенилэфрина, гинипрала), адре-ноблокаторов (ницерголина, йохимбина, обзида-
© Володченко А. И., Циркин В. И., Костяев А. А., 2012
на, атенолола), а также блокатора фосфолипазы трифлуоперазина [8] и блокатора Са2+-зависимых А2 индометацина [5], антагониста кальмодулина К+-каналов ВаС12 [12].
Таблица
Время начала агглютинации эритроцитов у мужчин (M±m) в изогемагглютинизирующей сыворотке 0aß (I) группы крови в присутствии раствора Кребса (контроль, секунды), адренергических и других веществ (опыт, % от контроля)
Вещества и их концентрация (г/мл) n Контроль Концентрация вещества, г/мл
10 10-9 10-8 10-7 10-6
с % % % % %
Адреналин и адреноблокато ры (серии 1, 2, 3, 4)
Адреналин 10 16±2 87±4* 80±5* 81±5* 74±6* 80±5*
А+ницерголин,10-6 10 16±2 104±5А 108±5А 98±5 А 107±5А 102±6А
Адреналин 10 11±1 93±2 85±2* 79±2* 76±3* 75±2*
А+йохимбина,10-6 10 11±1 90±3 84±3* 80±2* 76±2* 76±3*
Адреналин 10 16±2 87±4* 80±5* 81±5* 74±6* 80±5*
А+обзидан,10-6 10 16±2 71±5* 60±5*А 67±4*А 56±5*А 63±5*А
Адреналин 10 15±2 86±4* 72±3* 83±5* 76±6* 77±7*
А+атенолол,10-6 10 14±2 84±8 79±6* 84±8* 77±8* 81±7*
Адреноблокаторы (серии 5, 6, 7)
Ницерголин 10 23±4 98±3 97±4 99±3 93±2 97±3
Обзидан 10 22±4 91±3 89±4 94±5 93±2 92±5
Атенолол 10 21±4 99±4 84±4* 94±4 90±5 92±2
Фенилэфрин и адреноблокаторы (серии 8, 9)
Фенилэфрин 10 11±1 91±2 83±1* 81±2* 75±2* 70±3*
Ф+ницерголин,10-6 10 11±1 102±1Ф 99±2 Ф 101±1Ф 103±1Ф 101±2Ф
Ф+обзидан,10-6 10 11±1 89±2* 83±2* 83±2* 79±2* 75±2*
Гинипрал и адреноблокаторы (серии 10, 11)
Гинипрал 10 10±1 105±1 105±2 103±2 96±2 Z
Г+ницерголин,10-6 10 11±1 99±3 100±2 99±2 96±2 Z
Г+обзидан,10-6 10 11±1 100±1 100±1 102±1 97±2 Z
Фенилэфрин и индометацин (серия 12)
Фенилэфрин 10 12±2 89±2* 77±2* 75±2 72±4* 69±4*
Ф+индометацин,10-6 10 12±2 100±1Ф 102±3Ф 98±3Ф 98±2Ф 99±1Ф
Адреналин и другие вещества (серии 13, 14, 15)
Адреналин 10 13±1 95±2 91±2* 85±3* 86±3* 82±2*
А+индометацин,10-6 10 13±2 101±1А 103±3А 99±1 А 99±2 А 99±2 А
Адреналин 10 12±1 94±2 89±2* 86±2* 83±3* 78±3*
А+трифлуоперазин,10-6 10 12±1 103±2А 103±2А 96±2 А 98±2 А 101±1А
Адреналин 10 12±2 94±2 85±2* 83±3* 77±1* 74±3*
А+ВаС12,10-6 10 12±1 102±1А 100±3А 98±2 А 98±2 А 98±2 А
Примечание: *,Ф,А - различия с контролем (*), группами «Адреналин» (А) и «Фенилэфрин» (Ф) статистически значимы (р<0,01) по критерию Манна - Уитни; п - количество наблюдений; Ф - фенилэфрин, Г - гинипрал, А - адреналин; Ъ - не исследовано.
Оценку влияния веществ на агглютинацию эритроцитов производили по методу В. И. Циркина и соавт. [10]. С этой целью (рис.1, панель Б) на плоскость наносили каплю гепари-низированной крови (а), каплю раствора Кребса (контроль, б) или каплю адренергического вещества в одной из исследуемых концентраций (опыт, б) и каплю изогемагглютинирующей сы-
воротки 0ар(1) группы (в). Затем смешивали стеклянной палочкой первую и вторую капли (рис.1, панель В), а через 10 секунд к ним примешивали каплю сыворотки (в) и с этого момента определяли время начала агглютинации (ВНА) эритроцитов по появлению ее первых визуальных признаков (рис. 1, панель Г).
Рис. 1. Время начала агглютинации (% от контроля) эритроцитов у мужчин в изогемагглютинизирующей сыворотке 0ар (I) группы крови в присутствии адреналина (10-10-10-6 г/мл, п=60; 1-е столбцы); фенилэфрина (10-10-10-6 г/мл, п=20; 2-е столбцы) и гинипрала (10-10-10-7 г/мл, п=20; 3-и столбцы). Цифры 10, 9, 8, 7, 6 - отрицательный логарифм кон-
центрации веществ (г/мл).
Ф А - различия с контролем (*), группами «Адреналин» (А) и «Фенилэфрин» (*) статистически значимы (р<0,01) по критерию Манна - Уитни
Для определения влияния на эффект адреналина адреноблокаторов, индометацина, триф-луоперазина и хлорида бария (все - в концентрации 10-6 г/мл), предварительно в течение 5 минут при комнатной температуре гепаринизирован-ную кровь в объеме 0,75 мл инкубировали с 0,25 мл раствора одного из указанных веществ, то есть в соотношении 3:1 (рис. 1, панель А). Затем проводили все указанные выше процедуры с неинкубированной кровью (опыт 1) и с инкубированной кровью (опыт 2). Во всех исследованиях ВНА оценивали в секундах, при этом ВНА опыта выражали в процентах к контролю (раствор Кребса).
В работе использовали адреналина гидрохлорид (Московский эндокринный завод, Россия), альфа1-адреномиметик фенилэфрин (10-10-10-6 г/мл, «Дальхимфарм», Россия), бета-адреномиметик гинипрал (10-10-10-7 г/мл, «Ни-комед», Австрия), неселективный блокатор альфа-АР ницерголин (10-10-10-6г/мл, ФП «Оболен-ское», Россия), селективный блокатор альфа2-АР йохимбина гидрохлорид (10-6 г/мл, «Здоровье», Россия), неселективный блокатор бета-АР обзи-дан (10_1°-10"6г/мл, «Шварц Фарма АГ», Германия) и селективный блокатор бета^АР атенолол (10_1°-10"6г/мл, «Канофарма Продакшн», Россия).
Для уточнения вероятных механизмов внутриклеточной передачи использовали блокатор
фосфолипазы А2 индометацин (10-6 г/мл, «Фар-махим-Софарма», Болгария), антагонист кальмо-дулина трифлуоперазин (10-6 г/мл, «Здоровье», Украина) и блокатор Гардош-эффекта ВаС12 (10-6 г/мл, «Синтез», Россия).
В опытах использовали изогемагглютини-рующую сыворотку группы 0aß(I), а также, для определения группы крови, сыворотки группы Aß (II) и группы Ва (III), произведенные на Кировской областной станции переливания крови (титр 1:32).
Во всех сериях эксперимента использовался раствор Кребса (рН=7,4), содержащий (мМ): NaCl - 136; KCl - 4,7; CaCh - 2,52; MgCh - 1,2; KH2PO4 - 0,6; NaHCÜ3 - 4,7; C6H12Ü6 - 11.
Результаты исследования подвергнуты статистическому анализу с использованием программы BioStat2009 Professional. 5.8.4. (M±m). Различия оценивали по критерию Манна - Уитни, считая их статистически значимыми при р<0,01 [2].
Результаты исследования
Установлено, что в присутствии раствора Кребса время начала агглютинации (ВНА) в различных сериях варьировалось от 10 до 23 с (табл.), а в среднем оно составило 14±1 с.
Показано, что адреналин в концентрациях 10-1010-6 г/мл, как правило, дозозависимо снижает ВНА (табл., серии 1-4, 13-15). Это отражает и рис. 2, на
котором представлены результаты всех 60 опытов с адреналином, который снижал ВНА соответственно до 91 %, 84 %*, 83 %*, 79 %* и 78 %* от
контроля (* - различие с контролем статистически значимо, р<0,01 по критерию Манна - Уитни).
А
5 минут
Опыт 2
Опыт 1
Б
о-о
о
В 10 секунд
а+б
\
О
Г
агглютинат
в
Рис. 2. Схема эксперимента. Объяснения в тексте Примечание: а - кровь, б - вещество в исследуемой концентрации, в - изогемагглютинирующая сыворотка группы 0ар(1); панели А, Б, В, Г - последовательность этапов эксперимента
Неселективный блокатор альфа-АР ницерголин, неселективный блокатор бета-АР обзидан и селективный блокатор бета1-АР атенолол (все 10 -10"6 г/мл, серии 5, 6 и 7), а также селективный блокатор альфа2-АР йохимбин в концентрации 10-6 г/мл (серия 2) сами по себе не влияли на ВНА, что позволяло использовать их в концентрации 10-6 г/мл при анализе механизма действия адреномиметиков.
Показано, что ницерголин (10-6 г/мл) полностью блокировал способность адреналина снижать ВНА (табл., серия 1), йохимбин (10-6 г/мл, серия 2) и атенолол (10-6 г/мл, серия 4) не влияли, а обзидан (10-6 г/мл, серия 3) усиливал ее.
Все это означает, что активация альфа1-АР повышает скорость агглютинации, а активация бета2-АР снижает ее; активация альфа2-АР и бе-та1-АР, скорее всего, не имеет отношения к изменению скорости агглютинации под влиянием адреналина.
Установлено, что агонист альфа1-АР фени-
лэфрин в концентрациях 10-10-10-6 г/мл во всех сериях (табл., серии 8, 9 и 12) дозозависимо снижает ВНА (р<0,01). Судя по суммарным результатам, рассчитанным для 20 опытов с фенилэф-рином (рис. 2), ВНА уменьшалось соответственно до 90 %, 80 %*, 78 %*, 73 %* и 69 %* от контроля. Этот эффект фенилэфрина статистически значимо не отличался от эффекта адреналина. Показано, что ницерголин (10-6 г/мл, серия 8) полностью снимал способность фенилэфрина уменьшать ВНА (р<0,01), а обзидан (10-6 г/мл, серия 9) не влиял на нее.
В целом результаты опытов с фенилэфрином подтверждают наш вывод о том, что активация альфа1-АР ускоряет агглютинацию.
При действии бета2-адреномиметика гинипра-ла (10-10-10-7 г/мл, серии 10 и 11) ВНА составило соответственно 105 %, 105 %, 103 % и 96 % от контроля, то есть ожидаемого увеличения ВНА не наблюдалось (табл. и рис. 2). Оно не проявилось и при действии ницерголина (10-6 г/мл, серия 10), то есть при блокаде альфа-АР. Обзидан (10-6 г/мл, серия 11) не изменял эффект гинипрала.
Таким образом, в этих опытах нам не удалось убедительно показать, что активация бета2-АР снижает скорость агглютинации.
Показано (табл.), что ингибитор фосфолипазы А2 индометацин (10-6 г/мл, серия 13), антагонист кальмодулина трифлуоперазин (10-6 г/мл, серия 14) и блокатор Са2-зависимых К-каналов хлорид бария (10-6 г/мл, серия 15) полностью блокируют способность адреналина снижать ВНА (р<0,01). Аналогичные данные получены при исследовании влияния индометацина (10-6 г/мл, серия 12) на эффект фенилэфрина.
Все это означает, что для того, чтобы адреналин, взаимодействуя с альфа^АР, повысил скорость агглютинации эритроцитов, должны активироваться фосфолипаза А2 и кальмодулин и повыситься проницаемость мембраны для Са2+.
Обсуждение
На основании результатов наших исследований можно утверждать, что способность адрена-
лина повышать скорость агглютинации эритроцитов в условиях in vitro обусловлена активацией альфа1-АР, и этому в определенной степени препятствует активация бета2-АР. Наиболее вероятно, что при активации альфа1-АР в эритроцитах происходят 4 основных процесса, связанные с активацией 4 белков (фосфолипазы С, кальмоду-лина, протеинкиназы С и фосфолипазы А2):
1) Активация фосфолипазы С. Приводит к образованию диацилглицерола и инозитолтрифос-фата (ИФ3), под влиянием которого открываются ИФ3-зависимые Са2-каналы, что повышает вход Са2+ в эритроцит и компенсаторно увеличивает выход К+ через Са2-зависимые калиевые каналы (Гардош-эффект). Это снижает число отрицательных зарядов на поверхности эритроцитов (дзета-потенциал), что способствует их сближению и тем самым ускоряет процесс агглютинации.
2) Активация кальмодулина за счет увеличения концентрации Са2+ в эритроците. Комплекс «Са2+-кальмодулин» активирует Са2-кальмодулин-зависимую протеинкиназу. Она расщепляет белки цитоскелета и тем самым уменьшает площадь бел-ково-липидных контактов. Это, помимо увеличения микровязкости липидного слоя эритроцитар-ной мембраны, снижает отрицательный заряд мембраны, что способствует сближению эритроцитов и повышению скорости агглютинации.
3) Активация протеинкиназы С под влиянием образовавшегося ранее диацилглицерола и повышенного содержания Са2+ в эритроците. Приводит к тем же последствиям, что и активация Са2-кальмодулин-зависимой протеинкиназы.
4) Активация фосфолипазы А2 за счет увеличения концентрации Са2+ в эритроците. Приводит к разрушению фосфолипидов мембраны эритроцитов, в результате чего они утрачивают связь с белками цитоскелета, что увеличивает микровязкость мембраны, снижает ее отрицательный заряд, тем самым способствует сближе-
нию эритроцитов и повышению скорости агглютинации.
Выявленная нами способность адреналина повышать скорость агглютинации может быть использована для оценки адренореактивности эритроцитов. Как известно [1, 7, 9, 10,], сегодня считается, что эритроциты являются индикаторами, или маркерами, адренореактивности внутренних органов. Поэтому в настоящее время идет активный поиск способов оценки адреноре-активности эритроцитов.
Выводы:
1. Адреналин снижает ВНА эритроцитов человека (то есть повышает скорость агглютинации). Этот эффект блокируется ницерголином, индометацином, трифлуоперазином и хлоридом бария, усиливается обзиданом и не изменяется под действием йохимбина и атенолола.
2. Гинипрал не изменяет скорость агглютинации эритроцитов, в то время как фенилэфрин, подобно адреналину, повышает ее. Эффект фе-нилэфрина блокируется ницерголином и индо-метацином, но не изменяется при воздействии обзиданом.
3. Результаты исследования позволяют заключить, что скорость агглютинации эритроцитов возрастает при активации альфа1-АР и снижается при активации бета2-АР. Активация альфа2- и бе-та1-АР не влияет на скорость агглютинации.
4. Повышение скорости агглютинации эритроцитов, вызванное активацией альфа1-АР, объясняется снижением числа отрицательных зарядов на поверхности эритроцитов, вызванным выходом К+ через Са2-зависимые К+-каналы (за счет активации фосфолипазы С), и изменениями структуры мембраны (в результате активации фосфолипазы А2, кальмодулина, Са2-кальмодулин-зависимой протеинкиназы и проте-инкиназы С).
Библиографический список
1. Володченко, А. И. Адренореактивность эритроцитов женщин на различных этапах репродуктивного процесса, определяемая по адренозависимой агглютинации [Текст] / А. И. Володченко, Е. А. Колокольцева, В. И. Циркин, А. А. Костяев // Системное кровообращение, микроциркуляция и гемореология (от ангиоге-неза до центрального кровообращения) : Материалы международной научной конференции. - Ярославль : изд-во ЯГПУ им. К. Д. Ушинского. - С. 6-7.
2. Гланц, С. Медико-биологическая статистика [Текст] / С. Гланц. - М. : Практика, 1999. - 459 с.
3. Жибурт, Е. Б. Трансфузиология [Текст] : учеб-
ник / Е. Б. Жибурт. - СПб. : Питер, 2002. - 736 с.
4. Коротяев, А. И., Бабич, С. А. Медицинская микробиология, иммунология и вирусология [Текст] : учебник / А. И. Коротяев, С. А. Бабич. - СПб. : «Специальная Литература», 1998. - 592 с.
5. Крутецкая, З. И. Механизмы внутриклеточной сигнализации [Текст] / З. И. Крутецкая, О. Е. Лебедев, Л. С. Курилова. - СПб. : Изд-во СПб. ун-та, 2003. -208 с.
6. Мищенко, Н. В. Особенности агглютинации эритроцитов в зависимости от места проживания доноров / Н. В. Мищенко, С. Н. Родыгина, Е. Н. Сизова,
О. В. Тулякова // Вестник Новосибирского государственного университета. - 2010. - Т. 8, № 1. - С. 142146.
7. Стаселович, Л. Ю. Роль некоторых иммунологических и гуморальных факторов в прогнозировании перенашивания беременности [Текст] / Л. Ю. Стаселович, В. В. Лазуренко, О. В. Мерцалова // Международный медицинский журнал. - 2008. -№ 2. - С. 65-69.
8. Сторожок, С. А. Зависимость стабильности де-формабельности мембран эритроцитов от межмолекулярных взаимодействий белков цитоскелета [Текст] / С. А. Сторожок, А. Г. Санников, А. В. Белкин. - Тюмень : «Изд-во ТюмГУ», 1997. - Т. 3. - С. 140
9. Стрюк, Р. И. Адренореактивность и сердечнососудистая система [Текст] / Р. И. Стрюк, И. Г. Длус-ская. - М. : Медицина, 2003. - 160 с.
10. Циркин, В. И. Оценка адренореактивности эритроцитов, основанная на способности адреналина повышать скорость агглютинации эритроцитов [Текст] / В. И. Циркин, М. А. Громова, Д. А. Колчина, В. И. Михайлова, Я. К. Плясунова // Фундаментальные исследования. - 2008. - № 7. - С. 59-60.
11. Horga J. A beta-2-adrenergic receptor activates adenylate cyclase in human erythrocyte membranes at physiological calcium plasma concentrations / J. Horga, J. Gisbert, J. De Agustin, M. Herrandez, P. Zapater // Blood Cells Mol Dis. - 2000. -Vol. 26, № 3. - Р. 223-228.
12. Kaestner L. Ion channels in the human red blood cell membrane: Their further investigation and physiological relevance / L. Kaestner, I. Bernhardt // Bioelectro-chemistry. - 2002. - 55 - Р. 71-74.
