CC BY
59
IVh
МЕДИЦИНСКИЙ
АЛЬМАНАХ
УДК Б1Б.Б1-074:Б15.25
МЕХАНИЗМ ДЕЙСТВИЯ ГУМАТА МАГНИЯ НА ПОЧЕЧНУЮ ЭКСКРЕТОРНУЮ ФУНКЦИЮ В НОРМЕ И ПРИ ГЕНТАМИЦИНОВОЙ НЕФРОПАТИИ
Л.Е. Меньших, А.В. Дубишев, Н.А. Додонова, ГБОУ ВПО «Самарский государственный медицинский университет»
Меньших Людмила Евгеньевна - e-mail: [email protected]
В работе изучено действие гумата магния на почечную экскрецию воды, электролитов, креатинина в норме и гентамициновой нефропатии. Препарат может быть перспективным для дальнейшей разработки в качестве мочегонного средства с калийсберегаюшими свойствами, обладающего нефропротекторным действием при токсическом поражении почек.
Ключевые слова: гумат магния, гентамициновая нефропатия, диуретическое действие.
In work it is studied the influences of magnesium humate of a sulphidic dirt, on the excretion of the water, sodium, creatinin in norm and a nephropathy of gentamicin. Preparation can be perspective for the further working out as diuretic with the delay of potassium in a organism, possessing nephroprotecting action at toxic defeat of kidneys.
Key words: magnesium humate, nephropathy of gentamicin, diuretic action.
Введение
Гуминовые вещества - органические соединения сложной физико-химической структуры, широко распространенные в природе. Гуминовые соединения обладают большим спектром биологического действия и низкой токсичностью. Многочисленные исследования последних лет позволяют считать гуминовые вещества ценным лекарственным сырьем.
Объектом нашего исследования явились гуминовые кислоты, выделенные из низкоминерализованных иловых сульфидных грязей санатория «Сергиевские минеральные воды» Самарской области. Установлено, что препараты гуминовых кислот низкоминерализованных иловых сульфидных грязей относятся к IV классу токсичности, обладают противовоспалительной, антиоксидантной активностью [1].
Учитывая, что магний обладает высокой биологической активностью, можно ожидать значительное усиление действия гуминовых кислот в комплексном соединении с магнием. Этот элемент, участвуя в обеспечении важнейших биохимических и физиологических процессов в организме, влияя на энергетический, пластический, электролитный обмен, в
настоящее время рассматривается как один из важнейших внутриклеточных макроэлементов [2]. Так как в предыдущих
опытах, проведенных нами, установлена выраженная диуретическая активность гуминовых кислот, то магниевый комплекс гуминовых кислот (гумат магния) предположительно должен обладать большим почечным экскреторным эффектом. Известно, что соли магния увеличивают почечный кровоток, тормозят активность ренин-ангиотензиновой системы [2].
Цель исследования - исследование диуретической активности, механизма нефропротекторного действия гума-та магния при гентамициновом поражении почек.
Материалы и методы
В хронических опытах на крысах изучен дозозависимый эффект гумата магния на экскрецию воды, натрия, калия, креатинина. Контрольным животным в желудок вводилась водопроводная вода из расчета 3% от массы тела. Опытным крысам подкожно назначался гумат магния в дозах 5,0 и 7,5 мг/кг. Данные препараты были получены по авторским методикам, разработанным на кафедре общей бионеорганиче-ской и биоорганической химии Самарского государственного
медицинского университета под руководством заведующей кафедрой профессора Н.П. Аввакумовой. Кроме препаратов, этим крысам внутрь вводилась вода в суммарном количестве, равном объему жидкости контрольных животных. Крысы помещались в обменные клетки на сутки для сбора мочи. Регистрировался суточный объем мочи. Экскреция натрия и калия определялась методом пламенной фотометрии, креатинина - фотоэлектроколориметрически.
Возможный нефропротекторный эффект гумата магния был изучен в хронических экспериментах с моделированием гентамициновой нефропатии. Острая токсическая почечная недостаточность моделировалась семидневным внутрибрю-шинным введением крысам гентамицина в дозе 50 мг/кг [3]. Опытным животным одновременно с антибиотиком вводились ежедневно гуминовые кислоты в дозе 7,5 мг/кг. После введения препаратов животные получали водную нагрузку в количестве 3% от массы тела и помещались в обменные клетки на сутки для сбора мочи. Ежедневно определялась экскреция воды, натрия, калия. Для оценки тяжести почечной недостаточности за 1-, 3-, 5- и 7-е сутки экспериментального периода в моче регистрировалось содержание креатинина, мочевины уреазно-глутаматдегидрогеназным методом с фотометрией при длине волны возбуждения 340 нм, общего белка методом окрашивания его при взаимодействии с бромфеноловым синим с последующей фотометрией при длине волны возбуждения 620 нм.
Для изучения механизма действия гумата магния на клеточном уровне были использованы модельные опыты на биологических мембранах, осуществляющих направленный транспорт электролитов, аналогично переносу их в почечных канальцах. Подходящим объектом стали отрезки тонкой кишки, из которых формировались замкнутые сегменты [5]. Внутрь этих сегментов вводился раствор Рингера, сами они помещались в среду инкубации - раствор Рингера, содержащий вместо ионов натрия ионы лития. Количество натрия, перенесенного со стороны слизистой оболочки к серозной при инкубации в течение 4 часов, явилось показателем транспортных процессов [6]. Изучался эффект на транспорт натрия гентамицина (в концентрации 10 ммоль/л) и комбинации гумата магния (в концентрации 0,05%) с гентамици-ном (в концентрации 10 ммоль/л).
Мембранный эффект препаратов был исследован на отмытых эритроцитах с маркером мембранного транспорта флуоресцентным зондом АНС (1-анилино-8-нафталин-сульфонат). Суть метода: при инкубации эритроцитов в среде АНС одна часть зонда фиксируется на стенке эритроцитов, другая переносится через мембрану с наружной стороны внутрь клеток. Кинетика выбирания нативными эритроцитами АНС из раствора имеет быструю фазу (меньше 1 мин.), определяемую адсорбцией зонда на наружной стороне мембраны, и медленную фазу, обусловленную переносом АНС через мембрану внутрь клетки. Количество АНС, проникшего в полость эритроцитов, является критерием проницаемости [4].
К первой опытной порции добавлялся гентамицин, ко второй - гумат магния и гентамицин. Инкубация в среде АНС продолжалась в течение 1 часа. Через 1, 5, 10, 20, 40 и 60 мин. производился забор эритроцитов для определения содержания АНС на флуориметре «БИАН - 130», длина волны возбуждения 365 нМ, флуоресценции - 485 нМ.
Все манипуляции с животными проводились в соответствии с Правилами Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и иных научных целей (ETS № 123, Стразбург, 18 марта 1986 г.). Статистическая обработка полученных результатов экспериментов проводилась с использованием стандартных методов вариационной статистики: расчет средней арифметической величины (М) и средней ошибки средней арифметической (m) - при помощи программ Microsoft Excel 2007 (MS Office 2007, USA) «Пакет анализа», Biostat 1999 г. по критериям Стьюдента.
Результаты и их обсуждение
Гумат магния в дозе 5 мг/кг увеличивает диурез в 1,9 раз, натриурез в 1,9 раз, креатининурез в 2,3 раза, при этом уменьшается выведение калия в 1,7 раз (таблица 1). При дальнейшем увеличении дозы до 7,5 мг/кг отмечается возрастание диуреза в 2,3 раза, натриуреза в 2,3 раза, креати-нинуреза в 2,8 раз и уменьшения калиуреза в 2 раза. Характерно, что гумат магния в дозах 5,0 и 7,5 мг/кг оказывает калийсберегающий эффект.
ТАБЛИЦА 1.
Влияние подкожного введения гумата магния на суточную
Доза, мг/кг Условия опытов Диурез, мл Экскреция натрия, мкМ Экскреция калия, мкМ Экскреция креатинина, мг
5 контроль 1,34+0,13 385,31+35,73 92,68+11,30 1,55+0,20
опыт 2,51+0,17* 726,49+53,19* 55,02+5,91* 3,55+0,39*
7,5 контроль 1,31+0,10 378,24+28,86 119,08+10,78 1,30+0,15
опыт 3,07+0,21* 879,85+78,75* 59,26+8,22* 3,60+0,42*
Примечание: *
группой.
разница достоверна по сравнению с контрольной
Таким образом, анализ дозозависимого эффекта гумата магния показывает, что препарат в дозе 7,5 мг/кг оказывает более выраженное стимулирующее действие на экскреторную функцию почек. С целью выявления нефропротекторно-
го эффекта в дальнейших экспериментах использовалась доза 7,5 мг/кг.
Оказалось, что токсическое действие гентамицина на почки появляется уже на 3-и сутки ежедневного введения препарата (таблица 2). Развиваются характерные признаки токсической полиурии. При этом существенно возрастает экскреция воды (1,7 раза), натрия (1,4 раза), калия (1,3 раза), креатинина (1,3 раза). Полиуретический эффект сохраняется и на 5-е сутки. Выведение воды, электролитов, креатинина по сравнению с контролем остается повышенным соответственно в 1,4; 1,7; 1,5 и 1,6 раза.
К концу периода наблюдения (7-е сутки) признаки токсической нефропатии становятся максимальными, и это проявляется в более выраженной экскреторной функции. Диурез остается увеличенным в 2,6 раза, натриурез в 1,9 раза, калиурез в 1,6 раза, креатининурез 1,8 раза. Полученные результаты подтверждают данные, ранее полученные на кафедре, о нефротоксическом действии гентамицина, характерным признаком которого является поражение нефронов, что приводит к угнетению канальцевой реабсорбции воды и электролитов. Одновременно поражаются и почечные клубочки, что сопровождается возрастанием клубочковой фильтрации [6]. На 5-е и 7-е сутки увеличивается потеря белка с мочей с 0,61+0,04 до 0,76+0,03 мг (р<0,05)
и с 0,61+0,03 до 0,82+0,03 мг (р<0,05) соответственно.
Параллельно возрастает и экскреция мочевины с 1,30+0,13 до 1,68+0,11 мг (р<0,05) и с 1,35+0,13 до 1,90+0,07 мг (р<0,05). Последние два критерия свидетельствуют о нефротоксичности антибиотика.
ТАБЛИЦА 2.
Влияние ежедневного подкожного введения гумата магния в дозе 7,5 мг/кг на суточную экскреторную функцию почек в первые 7 дней развития токсической гентамициновой нефропатии (М±m, п=10)
часу инкубации - в 1,1 раза; за третий час - в 1,3 раза и в четвертый час - в 1,2 раза. Следовательно, гумат магния устраняет повышенную проницаемость биомембран, вызванную гентамицином, тем самым его влияние доминирует над эффектом гентамицина.
Показатели Дни эксперимента
1 3 5 7
Диурез, мл/сут. К 1,36+0,08 1,28+0,13 1,37+0,11 1,31+0,07
Г 1,55+0,09 2,14+0,12* 2,92+0,21* 3,51+0,23*
Г+ГМд 1,82+0,09 3,10+0,18* 4,22+0,29* 5,19+0,29*
Экскреция натрия, мкМ/сут. К 186,41+22,54 190,38+21,07 190,08+15,32 188,96+14,73
Г 188,40+23,74 261,42+24,49* 320,73+42,02* 355,64+9,86*
Г+ГМд 190,74+7,19 350,80+23,80* 486,85+43,44* 558,09+18,32*
Экскреция калия, мкМ/ сут. К 81,84+5,01 85,90+7,85 84,52+4,78 84,27+2,79
Г 91,43+3,90 111,51+6,08* 127,36+6,45* 136,07+3,54*
Г+ГМд 83,15+3,10 89,15+8,17* 93,42+5,87* 95,96+3,23*
Экскреция креатинина, мг/сут. К 4,16+0,32 4,12+0,38 4,17+0,48 4,10+0,26
Г 4,43+0,28 5,39+0,83* 6,53+0,50* 7,56+4,48*
Г+ГМд 4,35+0,42 6,85+0,37* 8,56+0,53* 10,97+0,88*
1 ЧАС 2 ЧАС 3 ЧАС 4 ЧАС
□ Контроль п Гентамицин □ Гентамицин+Гумат магния
РИС. 1.
Влияние гумата магния и гентамицина на транспорт натрия от мукозной поверхности к серозной стенки тонкой кишки (M±m, п=10).
Примечание: К - контроль, Г - гентамицин, Г+ГMg - комбинация гумата магния с гентамицином; Г*- по сравнению с контролем; Г+ГMg* - по сравнению с гентамицином.
Одновременно с гентамицином многодневное введение гумата магния предупреждает развитие нефротоксичности. Хотя диурез остается повышенным по сравнению с показателями, полученными только при назначении гентамицина на 3-, 5- и 7-й дни в 1,4; 1,4 и 1,5 раз, натриурез в 1,3; 1,5 и 1,6 раз, креатининурез в 1,3; 1,3 и 1,5 раз соответственно, тем не менее другие показатели - экскреция белка, калия и мочевины, изменяются в положительном направлении. Так, показатели калия уменьшаются в 1,3 раза на 3-и сутки, в 1,4 раза на 5-е и 7-е сутки. Выведение белка с мочей на 5-е и 7-е сутки наблюдения уменьшается соответственно с 0,76+0,03 до 0,64+0,03 мг (р<0,05) и с 0,82+0,03 до 0,70+0,02 мг (р<0,05). Выведение с мочей мочевины повышается с 1,30+0,13 до 1,96+0,06 мг (р<0,05) и с 1,35+0,13 до 2,14+0,05 мг (р<0,05). Эти показатели свидетельствуют об относительной сохранности почечных канальцев и клубочков.
Детальный механизм нефропротекторного действия на клеточном уровне был изучен в модельных опытах на отрезках тонкой кишки и эритроцитах. В результате было установлено усиление переноса натрия от мукозной поверхности кишки к серозной под влиянием прямого действия гентами-цина в концентрации 10 ммоль/л соответственно по часам: в 1 час - в 1,3 раза; во 2-й час - в 1,3 раза; в 3-й час - в 1,4 раза и в 4-й час -в 1,4 раза (рис. 1). Анализируя полученные данные, можно заключить, что гентамицин увеличивает транспорт ионов натрия в отрезках тонкой кишки в направлении от мукозного слоя к серозному.
При исследовании совместного действия гумата магния в концентрации 0,05% и гентамицина в концентрации 10 ммоль/л на транспорт натрия с внутренней поверхности кишки к наружной не только не увеличивался, но и достоверно уменьшался в течение всего 4-часового периода инкубации. В первый час эксперимента - в 1,1 раза, на втором
Так как транспорт натрия в нефронах может осуществляться как через клетки, так и через межклеточные промежутки, было важным исследование возможности влияния гентамицина и гумата магния на проницаемость мембран в опытах на эритроцитах. В результате было установлено, что перенос эритроцитарной пасты в раствор с АНС в концентрации 5 мкмоль/л через 1 мин. приводит к снижению концентрации флуоресцентного зонда с 5 мкмоль/л до 3,79±0,18 мкмоль/л (на 24%), что свидетельствует об адсорбции молекул маркера на поверхности эритроцитов (рис. 2). На этом быстрая фаза закончилась. Динамика дальнейшего падения концентрации зонда в инкубационном растворе выглядела так: через 5 мин. она уменьшилась до 3,26±0,18 мкмоль/л на (на 35%), спустя 10 и 20 мин. - до 2,84±0,15 мкмоль/л (на 43%) и 2,44±0,12 мкмоль/л (на 51%) соответственно, на 40 и 60 мин. - до 2,17±0,17 мкмоль/л (на 57%) и 2,08±0,19 мкмоль/л (на 58%) соответственно.
—♦—Контроль --»--Гентаимицин —а—Гентамицин+Гумат магния РИС. 2.
Влияние гумата магния и гентамицина на динамику поглощения флуоресцентного зонда АНС эритроцитами крыс (M±m, п=10).
Гентамицин в концентрации 10 мкмоль/л, добавленный в инкубационную среду с АНС, в первую минуту эксперимента снизил концентрацию зонда в сравнении с его исходной концентрацией в среде до 3,09+0,21* мкмоль/л (на 38%). Снижение концентрации АНС на 5-, 10-, 20- и 40-й минуте инкубационного периода до 2,55+0,12* мкмоль/л (на 49%), 2,12+0,17* мкмоль/л (на 58%), 1,55+0,12* мкмоль/л (на 69%), 1,62+0,10* мкмоль/л (на 68%) соответственно. На 60-й минуте концентрация зонда в среде и внутри эритроцитов уравновесилась, транспорт АНС практически приостановился, достигнув 1,66+0,07* мкмоль/л (на 68%). Значит, гентамицин способствует увеличению сродства молекул зонда АНС к биомембранам, а также его проникновению внутрь эритроцитов.
При добавлении в среду гумата магния в концентрации
0,05% и гентамицина в концентрации 10 мкмоль/л характеристика транспортных процессов в мембранах эритроцитов меняется. Препарат гумат магния ослабляет перенос флуоресцентного зонда АНС с наружной поверхности эритроцитов внутрь. Об этом свидетельствуют более низкие показатели транспорта АНС под действием комбинации гентамицина с гуматом магния по сравнению с одним гентамицином. Так, через 5, 10, 20, 40 и 60 минут перенос зонда соответственно уменьшен до 2,88+0,23* мкмоль/л, 2,47+0,14* мкмоль/л, 2,08+0,12* мкмоль/л, 1,88+0,11* мкмоль/л, 1,80+0,13* мкмоль/л.
Таким образом, гумат магния обладает выраженной диуретической активностью. Он увеличивает суточную экскрецию воды, натрия, креатинина в хронических экспериментах на крысах в дохах 5 и 7,5 мг/кг. Одновременно оказывает антикалиуретический эффект. Следовательно, гумат магния обладает характеристиками диуретика с калийсберегающи-ми свойствами.
Важно отметить, что гумат магния оказывает нефропро-текторное действие при гентамициновой нефропатии. Известно, что гентамицин в клинических условиях обладает нефротоксическим действием, вызывая полиуретическую форму почечной недостаточности [7]. Гумат магния, назначаемый с гентамицином парентерально, в течение 7 дней, действует как диуретик, дополнительно увеличивает выведение из организма воды, натрия, креатинина, ослабляет калийуретический эффект, стимулирует клубочковую фильтрацию. Диуретическое действие гумата магния создает защитный гидродинамический эффект: увеличение внутреннего диаметра канальцев, тока внутриканальцевой жидкости, уменьшение коллапсиравания сигментов и взаимного сдавления и повреждения нефроцитов. Кроме того, о нормализации выделительной функции почек свидетельствует и возрастание выведения креатинина (3-, 5-, 7-е сутки), мочевины (5-, 7-е сутки) и уменьшение выделения белка с мочей (5- и 7-е сутки). Дополнительным положительным моментом в действии препарата является калийс-берегающий эффект (3-, 5- и 7-е сутки).
Изучение детального механизма действия гумата магния на клеточно-мембранном уровне как в физиологических условиях, так и при гентамициновой нефропатии показало возможность препарата оказывать прямое действие на транспортирующий эпителий кишечника. Гумат магния уменьшает усиленный гентамицином перенос натрия от мукозной поверхности к серозной, т. е. препарат оказывает стабилизирующее действие на мембраны кишечника. Этот эффект подтверждается и в экспериментах на эритроцитах, где четко регистрируется ослабление транспорта мембранной проницаемости флуоресцентного зонда АНС.
Гумат магния, вероятно, стабилизирует клеточные мембраны нефроцитов, тем самым предупреждает нефроток-сичность гентамицина. Дополнительный гидродинамический эффект препарата предупреждает дальнейшее повреждение канальцев. Калийсберегающее действие гумата магния нормализует водно-солевой обмен.
Выводы
1. Гумат магния увеличивает суточную экскрецию воды, натрия, креатинина, уменьшает выделение калия в хронических опытах на крысах.
2. Гумат магния оказывает нефропротекторное действие при гентамициновой нефропатии, стимулирует почечную экскрецию воды, натрия, креатинина, мочевины, уменьшает выделение почками калия и белка.
3. Гумат магния ослабляет транспорт натрия от мукозной поверхности к серозной в отрезках тонкой кишки и уменьшает перенос флуоресцентного зонда АНС через стенку эритроцитов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Аввакумова Н.П. Биохимические аспекты терапевтической эффективности гумусовых кислот лечебных грязей. Самара: СамГМУ, 2002. № 1. С. 13.
2. Городецкий В.В., Талибов О.Б. Препараты магния в медицинской практике. Малая энциклопедия магния. М.: Медпрактика, 2004. С. 57.
3. Панин В. П., Дубищев А. В., Куркин В.А. Анализ эффективности фитопрепаратов при острой почечной недостаточности по критерию NO- экскреторной активности. //Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов, выпуск 64. Пятигорск. 2009. С. 440-442.
4. Добрецов Г.Е., Владимиров Ю.А. Флуоресцентные зонды в исследовании биологических мембран. М.: Наука, 1980. 320 с.
5. Дубищев А.В., Зайцева Е.Н. Механизм действия серотонина и ондансте-рона на целлюлярный и парацеллюлярный транспорт натрия в нефронах. // Конф. с международным участием. Фармация и общественное здоровье: сб. мат. конференции. Екатеринбург. 2008. С. 112-114.
6. Дубищев А.В., Зайцева Е.Н. Новое представление о механизме регуляции канальцевого транспорта натрия в нефронах. //«Актуальные вопросы последипломного образования и здравоохранения». Юбилейный сборник научных работ. Самара. 2008. С. 89.
7. Кодакова М.Н., Дубищев А.В. Влияние растительных препаратов на экскреторную функцию почек при острой почечной недостаточности. // Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции. Сборник научных трудов, выпуск 64. Пятигорск. 2009. С. 440-442.
