CC BY
55
УДК 616.61-085.017-085.03-085.1:612-084
МЕХАНИЗМ ЗАЩИТНОГО ДЕЙСТВИЯ ТРЕМУЛОИДИНА ПРИ ОСТРОМ ПОРАЖЕНИИ НЕФРОНА ГЕНТАМИЦИНОМ
Алексей Владимирович Дубищев, Марина Николаевна Кодакова
Кафедра фармакологии (зав. — проф. А.В. Дубищев) Самарского государственного медицинского университета, e-mail: [email protected]
Реферат
В острых опытах на беспородных крысах установлено, что тремулоидин, введенный одновременно с ген-тамицином, предупреждает развитие гентамициновой олигурии, увеличивает почечную экскрецию воды, натрия, калия за счет возрастания клубочковой фильтрации и угнетения канальцевой реабсорбции. Тремулои-дин на фоне гентамицина угнетает транспорт натрия и не влияет на межклеточный перенос уранина через биомембраны от мукозной поверхности кишки к серозной, стабилизирует мембранную проницаемость эритроцитов крыс для флуоресцентного зонда АНС.
Ключевые слова: тремулоидин, гентамицин, функция почек, клубочковая фильтрация, канальцевая реабсорбция, модельные опыты.
В медицинскую практику широко внедряются новые высокоэффективные препараты, содержащие биологически активные вещества, полученные из лекарственных растений. Выявление новых диуретиков, нефропротекторных средств среди растительных источников, в частности семейства ивовых, является весьма актуальной задачей. К семейству ивовых относятся хорошо известные представители — тополь, осина, ива. Почки, кора и листья этих растений содержат богатый набор биологически активных соединений, представляющих собой флавоноиды, фенилпропаноиды, простые фенолы и др. [6]. В коре осины доминирующим соединением выступают вещества фенольной природы. При исследовании коры осины методом колоночной хроматографии на кафедре фармакогнозии с ботаникой и основами фитотерапии СамГМУ впервые было выделено вещество, структурный анализ которого с помощью ЯМР-анали-за и масс-спектрометрии позволил идентифицировать его как тремулоидин [5]. Предыдущими опытами установлено, что тремулоидин обладает выраженными диуретическими свойствами и при курсовом введении предупреждает развитие гента-мициновой нефропатии [3].
С целью выяснения действия трему-
лоидина на клубочковую фильтрацию и канальцевую реабсорбцию на фоне нефро-токсического эффекта гентамицина поставлены 2 серии острых экспериментов. Для этого крыс наркотизировали путём подкожного введения этаминала натрия в дозе 50 мг/кг. В подкожную клетчатку инфузировали изотонический раствор натрия хлорида со скоростью 5 кап/мин. Производили катетеризацию мочевого пузыря, свободный конец катетера помещали в градуированный стеклянный капилляр для сбора мочи. Далее собирали одну 30-минутную контрольную порцию мочи. В контрольной группе выполняли однократную внутривенную инфузию ген-тамицина в дозе 50 мг/кг, в основной — вместе с гентамицином в вену инъецировали также тремулоидин в дозе 25 мг/кг. После этого сбор мочи продолжали в течение трех 30-минутных промежутков. Регистрировали экскрецию воды, натрия, калия, креатинина с мочой. Параллельно из вены забирали по 0,5 мл крови (всего 2 раза). В плазме крови определяли концентрацию натрия и креатинина. Рассчитывали клубочковую фильтрацию по клиренсу креатинина, канальцевую реабсорбцию воды по концентрационному индексу креатинина и натрия по экскре-тируемой фракции натрия.
Для изучения механизма действия тре-мулоидина и гентамицина на клеточном и мембранном уровнях были использованы модельные опыты на биологических мембранах, осуществляющих направленный транспорт электролитов, аналогично переносу их в почечных канальцах. Таким объектом явились отрезки тонкой кишки, из которых формировали замкнутые сегменты [2]. Крыс наркотизировали, вскрывали им брюшную полость. У каждой крысы вырезали 3—4 сегмента длиной 3 см каждый. Кишку тщательно промывали раствором Рингера. Потом
Таблищ 1
Влияние внутривенного введения гентамицина (50 мг/кг) на ионорегулирующую функцию почек крыс
(М±т, п=10)
Время, мин Диурез, мкл/мин/ 100 г Натриурез, мкМ/мин/ 100 г Калиурез, мкМ/мин 100 г Клиренс креа-тинина, мл/мин/100 г Концентрац. индекс креа-тинина, усл.ед. Экскрети-руемая фракция натрия, %
Контроль 4,28±0,24 1,46±0,07 0,27±0,03 4,33±0,61 10,06±1,07 0,31±0,07
30 2,25±0,22* 0,81±0,09* 0,15±0,02* 2,13±0,29* 9,35±0,74 0,30±0,04
60 1,97±0,21* 0,60±0,07* 0,16±0,03* 2,89±0,44* 14,31±1,09* 0,15±0,01*
90 1,74±0,11* 0,53±0,05* 0,14±0,02* 3,22±0,29* 18,39±0,95* 0,11±0,01*
* р<0,05 — достоверность отличия опытных показателей по отношению к контролю. То же в табл. 2—4.
внутрь тонкой кишки этих сегментов вводили раствор Рингера и помещали их в среду инкубации — раствор Рингера, содержащий вместо ионов натрия ионы лития. Количество ионов натрия, перенесенного со стороны слизистой оболочки к серозной при инкубации в течение 4 часов, являлось показателем транспортных процессов.
В аналогичных экспериментах исследовали влияние препаратов на перенос маркера парацеллюлярного транспорта уранина, помещенного внутрь кишки в концентрации 10 мг/дл [4]. Содержание уранина определяли на флуориметре «БИАН-130» (длина волны возбуждения — 365 нМ, флуоресценции — 510 нМ). Тре-мулоидин (10-4 моль/л) и гентамицин (10-3 моль/л) вводили по обе стороны биомембраны (6 серий экспериментов).
Возможность влияния тремулоидина и гентамицина на проницаемость цитоплазматических мембран анализировали в опытах на эритроцитах с маркером мембранного транспорта флуоресцентным зондом АНС (1-анилино-8-нафта-лин-сульфонат). Суть метода заключается в том, что при инкубации эритроцитов в среде АНС одна часть его фиксируется на стенке эритроцитов, а другая переносится через мембрану с наружной стороны внутрь клеток. Кинетика выбирания нативными эритроцитами АНС из раствора имела быструю фазу (длительность меньше 1 мин), определяемую адсорбцией красителя на наружной стороне мембраны, и медленную фазу, обусловленную переносом АНС через мембрану внутрь клетки. Количество АНС, проникшего в полость эритроцитов, является критерием проницаемости [7]. После приготовления порций эритроцитов их инкубирова-
ли в среде, содержащей 5 мкМ/л АНС, в течение часа. Препараты добавляли в той же концентрации. Забор эритроцитов со средой производили через 1, 5, 10, 20, 40 и 60 минут для приготовления супернатанта. Содержание АНС определяли на флуориметре «БИАН-130» (длина волны возбуждения — 365 нМ, флуоресценции — 485 нМ). Ставили 3 серии экспериментов.
Статистическая обработка полученных результатов экспериментов проводилась с использованием стандартных методов вариационной статистики.
Однократное внутривенное введение гентамицина вызывает резкое угнетение экскреции воды, натрия и калия в течение 1,5-часового периода наблюдения по сравнению с исходным уровнем (табл. 1).
В механизме угнетения экскреторной функции существенное значение имеют ослабление клубочковой фильтрации в течение всего периода наблюдения (соответственно в 2,0; 1,5; 1,3 раза) и возрастание канальцевой реабсорбции через 60 и 90 минут воды (в 1,4 и 1,8 раза) и натрия (в 2,0 и 2,8 раза). Однако одновременное с гентамицином введение тремулоидина в значительной степени предупреждает ослабление выделительной функции нефронов (табл. 2). Видно, что в течение первых 30 минут после инъекции препаратов достоверно падает экскреция воды, натрия, калия, одновременно снижаются клиренс креатинина и экскретируемая фракция натрия. Последнее свидетельствует о том, что причинами угнетения выделительной функции являются ослабление фильтрации и вторичное усиление канальцевой реабсорбции натрия. Через 60 минут эксперимента все показатели почти не отличались от исход-
863
Таблица 2
Влияние одновременного внутривенного введения тремулоидина (25 мг/кг) и гентамицина (50 мг/кг) на ионорегулирующую функцию почек крыс (М±т, п=10)
Время, мин Диурез, мкл/мин/ 100 г Натриурез, мкМ/мин/ 100 г Калиурез, мкМ/мин 100 г Клиренс креа-тинина, мл/мин/100 г Концентрац. индекс креатинина, усл.ед. Экскрети-руемая фракция натрия, %
Контроль 4,68±0,29 1,87±0,16 0,39±0,04 5,51±0,77 11,37±1,00 0,27±0,02
30 2,32±0,18* 0,76±0,06* 0,20±0,02* 2,98±0,29* 13,00±1,08 0,20±0,02*
60 4,42±0,32 1,65±0,12 0,31±0,04 5,35±0,56 11,99±0,80 0,23±0,01
90 4,28±0,23 1,73±0,11 0,29±0,03 5,43±0,37 12,69±0,54 0,21±0,01*
ных величин. Канальцевая реабсорбция натрия оставалась увеличенной и через 90 минут.
В модельных опытах на отрезках тонкой кишки установлено усиление переноса натрия от мукозной поверхности кишки к серозной под влиянием прямого действия гентамицина соответственно по часам в 1,3; 1,2; 1,3 и 1,3 раза (табл. 3).
Таблица 3
Влияние гентамицина (10-3 моль/л), комбинации тремулоидина (10-4 моль/л) и гентамицина (10-3 моль/л) на транспорт натрия от мукозной поверхности стенки тонкой кишки к серозной (М±т, п=10)
Время, час Контроль, мкМ/см2 Гента- мицин, мкМ/см2 Тремулоидин+ +гентамицин, мкМ/см2
1 11,03±1,39 14,40+0,78* 7,72±0,60 *
2 12,39±1,04 15,16+0,80* 8,74±1,15 *
3 14,27±1,15 19,40±1,70* 10,80±0,96*
4 15,71±1,45 20,70±1,83* 9,96±0,66*
При совместном действии на кишку тре-мулоидина и гентамицина транспорт натрия с внутренней поверхности кишки к наружной не только не увеличивается, но достоверно уменьшается в течение всего 4-часового периода инкубации (соответственно по часам в 1,4; 1,4; 1,3 и 1,6 раза). Следовательно, тремулоидин предотвращает повышенную проницаемость мембран, создаваемую гентамицином.
Усиление транспорта натрия через мукозный слой кишки при инкубации биомембран в растворе с гентамицином могло быть результатом возрастания как целлюлярного, так и парацеллюлярно-го переноса. В опытах, выполненных на кишке с уранином, распределяющимся преимущественно межклеточно, нами выяснено, что транспорт уранина от му-козной поверхности к серозной под действием как гентамицина, так и комбиниро-
864
ванного воздействия обоих препаратов не менялся (табл. 4).
Таблица 4
Влияние гентамицина (10-3 моль/л), комбинации тремулоидина (10-4 моль/л) и гентамицина (10-3 моль/л) на транспорт уранина от мукозной поверхности стенки тонкой кишки к серозной (М±т, п=10)
Время, час Контроль, мкМ/см2 Гента- мицин, мкМ/см2 Тремулоидин+ +гентамицин, мкМ/см2
1 2,79±0,56 3,36±1,05 2,54±0,43
2 5,04±0,82 4,54±1,08 4,28±1,11
3 6,16±1,08 6,02±0,86 5,36±1,01
4 6,09±0,89 5,20±0,69 5,27±0,65
Влияние препаратов на клеточный (трансмембранный) перенос ионов оценивался с использованием флуоресцентного зонда АНС в опытах на эритроцитах, в которых транспорт маркера мог происходить только через цитоплазматическую
0 мин 1 мин 5 мин 10 мин 20 мин 40 мин 60 мин Контроль -Щ— Гентамитцин —Тремулоидин+гента.миттин
Рис. 1. Влияние гентамицина(10'3 моль/л), комбинации тремулоидина (10-4 моль/л) и гентамицина (103 моль/л) на динамику поглощения флуоресцентного зонда АНС эритроцитами крыс (М±т, п=10).
мембрану. Как видно из рис. 1, перенос эритроцитарной пасты в раствор с АНС через 1 минуту вызывает снижение концентрации зонда, что свидетельствует об адсорбции маркера на поверхности эритроцитов. На первом этапе быстрая фаза заканчивается. Затем динамика падения концентрации зонда указывает на поглощение зонда клетками до выравнивания концентрации маркера по обеим сторо-
нам мембраны эритроцитов. Гентамицин увеличивает трансмембранный транспорт АНС, а тремулоидин совместно с гентами-цином не только предупреждает процесс переноса, но и стабилизирует мембраны эритроцитов, ослабляет поступление зонда внутрь клеток.
Детальный анализ, проведенный в острых экспериментах, позволил дифференцировать изменения, возникающие как в нефронах, так и отдельно в клубочках и канальцах. Гентамицин угнетает почечную экскрецию электролитов и воды в первые 1,5 часа после внутривенного введения препарата, в механизме которого имеет значение угнетение клубочковой фильтрации в первые 30 минут с последующим вторичным возрастанием канальцевой реабсорбции. Через 60—90 минут тремулоидин, введенный одновременно с гентамицином, слабо влияет на клубочково-канальцевый аппарат в первые 30 минут эксперимента и почти полностью предотвращает сдвиги в последующие 60 минут.
Вопрос о точной локализации и механизме канальцевого эффекта гентамицина и тремулоидина мог быть решен в модельных опытах. Кишечник транспортирует воду и электролиты аналогично нефрону, поэтому опыты на этих моделях дают возможность расшифровать канальцевые сдвиги в нефронах. Гентамицин усиливает перенос ионов натрия от мукозной поверхности кишки к серозной, тремулоидин полностью блокирует указанный эффект; транспорт натрия даже ослабляется по сравнению с контролем, что указывает на возможность препарата стабилизировать проницаемость мембран. Перенос ионов может происходить как через клеточные структуры, так и сквозь межклеточные промежутки. Путем использования маркера парацеллюлярного транспорта уранина и маркера мембранного транспорта флуоресцентного зонда АНС нами было установлено, что тремулоидин не действует на перемещение маркера межклеточного транспорта уранина через стенку кишки и стабилизирует мембраны эритроцитов, угнетая транспорт АНС. Последнее позволяет предположить, что основной эффект препарата на канальцевую реабсорбцию натрия связан со стабилизацией клеточных мембран нефронов. Следовательно,
© 55. «Казанский мед. ж.», № 6.
гентамицин ослабляет клубочковую фильтрацию и усиливает канальцевую реабсорбцию за счет увеличения целлюлярного транспорта натрия, что, по-видимому, и лежит в основе развития гентамициновой нефропатии. Обладая диуретическим эффектом, тремулоидин способен нормализовать клубочковую фильтрацию и канальцевую реабсорбцию.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гланц С.А. Медико-биологическая статистика/ Пер.с англ. — М.: Практика, 1999. — 459 с.
2. Дубищев А.В., Зайцева Е.Н. Механизм действия серотонина и ондансетрона на целлюлярный и пара-целлюлярный транспорт натрия в нефронах/ «Фармация и общественное здоровье». Сб. матер. конфер. — Екатеринбург, 18—19 февраля 2008 г. — Екатеринбург,
2008. — С. 112—114.
3. Кодакова М.Н., Дубищев А.В. Влияние растительных препаратов на экскреторную функцию почек при острой почечной недостаточности / “Разработка, исследование и маркетинг новой фармацевтической продукции”. Сб. научн. трудов, выпуск 64. — Пятигорск,
2009.— С. 440—442.
4. Лебедев А.А. Фармакология почек. Очерки к 50 летию исследования проблемы. — Самара, 2002. — 104 с.
5. Правдивцева О.Е. Фармакогностическое исследование по созданию антимикробных и противовос-полительных средств на основе некоторых видов рода Populus L.: Автореф. дисс. ...канд. фарм. наук. — Самара, 2001. — С. 156.
6. Растительные ресурсы СССР: Цветковые растения, их химический состав, использование; семейства Paeoniaceae - Thymelaeaceae. — Л.: Наука, 1985. — 336 с.
7. Черницкий Е.А., Воробей А.В. Структура и функции эритроцитарных мембран. — Минск: Наука и техника, 1981.— 216 с.
Поступила 01.09.09.
THE MECHANISM OF PROTECTIVE ACTION OF TREMULOIDIN IN ACUTE RENAL AFFECTION BY GENTAMICIN
A.V. Dubischev, M.N. Kodakova
Summary
In acute experiments on outbred rats established was the fact that tremuloidin, introduced simultaneously with gentamicin, prevents the development of gentamicin-induced oliguria, increases renal excretion of water, sodium, potassium by increasing glomerular filtration rate and oppression of tubular reabsorption. Tremuloidin introduced simultaneously with gentamicin inhibits the transport of sodium and has no effect on intercellular transport of uranin through biomembranes from the mucosa to the serous surface, stabilizes the erythrocyte membrane permeability for a fluorescent probe.
Key words: tremuloidin, gentamicin, renal function, glomerular filtration, tubular reabsorption, model experiments.
