CC BY
48© Соловых Е.А., Караогланова Т.Б., 2014 УДК 616.314.17-002-092
МАТРИКСНЫЕ МЕТАЛЛОПРОТЕИНАЗЫ И ЗАБОЛЕВАНИЯ ПАРОДОНТА
Е.А. Соловых1, кандидат медицинских наук, Т.Б. Караогланова1, Н.Е. Кушлинский1, 2, член-корреспондент РАМН, профессор
1Московский государственный медико-стоматологический университет им. А.И. Евдокимова МЗ РФ, Российская Федерация, 127473, Москва, ул. Делегатская, д. 20, стр. 1; 2Российский онкологический научный центр им. Н.Н. Блохина РАМН, Российская Федерация, 115478, Москва, Каширское шоссе, д. 24 E-mail: [email protected]
Введение. В представленной работе изложены основные современные сведения о роли ММПв различных биохимических процессах в организме. Основное внимание уделено роли ММП в патогенезе пародонтита. Приведенные литературные данные свидетельствуют о неоднозначности научных взглядов на роль ММР в этиологии и патогенезе воспалительных и воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта.
Цель. Выяснение диагностического значения увеличения концентрации воспалительных цитокинов в ротовой жидкости у пациентов с воспалительными и воспалительно-деструктивными заболеваниями пародонта.
Материал и методы. Проведено комплексное стоматологическое обследование 145 пациентов в возрасте от 18 до 52 лет, из них 63 — с интактным пародонтом, 25 — с легкой, 45 — со средне-тяжелой и 12 — с тяжелой степенью пародонтита. Концентрации ММР-8 и ММР-9 определяли в нестимулированной слюне иммуноферментным анализом.
Результаты. Выявлен ряд закономерностей в концентрации воспалительных цитокинов в ротовой жидкости у пациентов с различным состоянием тканей пародонта. На начальном этапе воспалительно-дистрофических заболеваний пародонта важнейшее значение имеет фактор гигиенического состояния, в частности, микробной обсемененности полости рта. В дальнейшем прогрессирование заболевания связано с присоединением возрастных изменений в организме человека, причем данный фактор, согласно результатам корреляционного анализа, начинает играть важную роль в патогенезе пародонтита.
Заключение. Воспалительно-дистрофический процесс в пародонте развивается поэтапно, и на каждом этапе возможны появление новых патогенетических факторов или суммирование их негативного влияния. ММР-9 в ротовой жидкости может служить маркером хронического генерализованного пародонтита. Наличие в полости рта этих пациентов ортопедических конструкций из хромокобальтового или хромоникелевого сплава ведет к увеличению содержания ММР-2, ИЛ-1$ и ИЛ-6 в ротовой жидкости.
Ключевые слова: заболевания пародонта, патогенез пародонтита, матриксные металлопротеиназы, воспалительные цитокины
MATRIXMETALLOPROTEINASES AND PERIODONTAL DISEASES E.A. Solovykh1, T.B. Karaoglanova1, N.E. Kushlinskii1,2
Moscow State University of Medicine and Dentistry named after A.I. Evdokimov, Russian Federation, 127473, Moscow, Delegatskaya street, 20/1; 2N.N. Blokhin Russian Cancer Research Center, Russian Federation, 115478, Moscow, Kashirskoe shosse, 24
Introduction. The paper presents basic information about the modern role of the IMF in various biochemical processes. Emphasis is placed on the role of MMPs in the pathogenesis of periodontitis. These published data suggest ambiguity of scientific views on the role of MMPs in the etiology and pathogenesis of inflammatory and inflammatory-destructive periodontal disease.
The aim of the study. Ascertainment diagnostic value increasing concentrations of inflammatory cytokines in saliva of patients with inflammatory and inflammatory-destructive periodontal disease.
Methods. We conducted a comprehensive dental examination in 145 patients aged 18 to 52 years, 63 of them — with an intact periodontium, 25 — with mild periodontitis, 45 — with an average severity parodontitai 12 — with severe periodontitis. Concentrations of MMP-8 and MMP-9 in unstimulated saliva was measured by enzyme immunoassay.
Results. Revealed a number of regularities concentrations of inflammatory cytokines in saliva of patients with different state of periodontal tissues. At the initial stage of the inflammatory and degenerative diseases periodontal crucial factor hygienic conditions and, in particular microbial contamination of the oral cavity. In the future progression of the disease due to the addition of age-related changes in the human body, and this factor according to the results of correlation analysis, begins to play an important role in the pathogenesis of periodontitis. From this we can assume that the inflammatory- dystrophic process in periodontitis develops in stages and at each stage it is possible the emergence of new pathogenic factors or summation of their negative impact. MMP-9 in oral fluid may serve as a marker of chronic generalized periodontitis.
Conclusions. The presence in these patients oral prosthetic constructions made of nickel-chromium alloys or chrom-cobalt leads to increased levels of MMP-2, IL-1$ and IL-6 in saliva.
Key words: periodontal disease, the pathogenesis of periodontitis, matrix metalloproteinases, proinflammatory cytokines
Матриксные металлопротеиназы (ММР) — семейство внеклеточных цинксодержащих протеиназ [14].
ММР синтезируются в виде неактивных проферментов и активируются после отщепления про-пептида. Активность ММР регулируется на разных уровнях, включая транскрипцию, активацию белка и взаимодействие с ингибиторами, такими, как тканевые ингибиторы металлопротеиназ (ТГМРб).
ММР расщепляют большинство белков внеклеточного матрикса (ВКМ) и базальной мембраны [14]; они также вовлечены в деградацию и процессинг факторов роста, цитокинов, веществ, участвующих в апоптозе и клеточной адгезии. Кроме того, ММР вместе с другими внеклеточными протеиназами участвуют в различных физиологических процессах: физиологической и послераневой перестройке тканей, воспалении и иммунном ответе, имплантации яйцеклетки в стенку матки, неоангиогенезе. ММР — нейтральные протеиназы, которые активны при физиологических рН и температуре. Однако при наличии патологии ММР могут вызывать повреждение тканей.
К настоящему времени описано около 30 ММР. Традиционно они классифицируются по субстратной специфичности. За способность этих ферментов специфически гидролизовать все основные белки ВКМ они были названы матриксными ме-таллопротеиназами или матриксинами. Известно, что ММР играют центральную роль в обмене белков соединительной ткани, в процессах нормального развития матрикса, при онкогенной транс -формации клеток, при ангиогенезе, аутоиммунных и воспалительно-дистрофических заболеваниях. Семейству белков ММР присущи некоторые общие характерные черты. По составу ММР гомологичны на 32—49%, большинство из них имеют общую 5-доменную структуру в своей основе. Типичная ММР состоит из пропептида, включающего 80 аминокислот, каталитического металлопротеиназного домена из 170 аминокислот, связывающего пептида различной длины и гемопексина — домена, состоящего из 200 аминокислот.
В то же время на основании данных по структурной организации и субстратной специфичности в семействе ММР выделены следующие подсемейства:
♦ коллагеназы кишечника (ММР-1, -8, -13);
♦ желатиназы (коллагеназы коллагена-ГУ: ММР-2 и ММР-9);
♦ матрилизины (ММР-7, ММР-26);
♦ стромелизины (ММР-3, ММР-10);
♦ мембранный тип (МТ) ММР (трансмембранный тип и GPI-связанная эластаза);
♦ другие ММР, не относящиеся к перечисленным подсемействам, а именно: эластаза макрофагов, энамелизин, эпилизин.
ММР представленных подсемейств могут отличаться способом активации проферментов и особенностями взаимодействия с эндогенными ингибиторами.
Вместе с тем все члены семейства ММР обладают общими характерными чертами:
♦ содержат цинк в активном центре, относятся также и к кальций-зависимым протеиназам и поэтому ингибируются хелатными агентами;
♦ каталитический домен содержит мотив — HEXXHXXGXXH, 3 остатка гистидина которого связывают атом цинка в активном центре;
♦ обладают сходной доменной структурой;
♦ гидролизуют один или несколько компонентов матрикса и базальной мембраны;
♦ секретируются в виде проферментов, пропеп-тидный домен содержит консервативную последовательность, отвечающую за активацию про-ММР;
♦ проферменты активируются рядом протеиназ, тиолмодифицирующими агентами и хаотроп-ными реагентами;
♦ ингибируются специфическими тканевыми ингибиторами;
♦ последовательности кДНК всех ММР имеют высокую степень гомологии с кДНК коллагеназы;
♦ промоторные участки генов содержат несколько сходных регуляторных последовательностей.
Функции ММР в норме. В физиологических условиях матриксины играют центральную роль в процессах морфогенеза, ремоделирования и резорбции тканей. Они участвуют в деструкции ВКМ при ряде заболеваний (пародонтиты, хронические язвенные процессы, аутоиммунные заболевания, в процессах инвазии и метастазирования опухолей). Матрикси-ны в физиологических условиях секретируются из клеток в очень незначительных количествах. Одной из характерных особенностей синтеза этих ферментов является их способность к индукции, т.е. синтез и секреция ММР могут контролироваться многими факторами. В процессах эмбрионального развития и морфогенеза деструкция соединительнотканного матрикса является центральной, критической стадией. Экспериментально на мышах было показано, что на стадии имплантации эмбриональных клеток в матку в них экспрессируются гены ММР-1,-2,-3 и особенно ММР-9, а также Т1МР-1. В клетках материнской ткани, окружающей эмбрион, в течение 5—6 дней экспрессируется ген Т1МР-3 (ингибитора желатиназ), но экспрессии и синтеза ТГМР-1 и ТГМР-2 ни в материнских, ни в эмбриональных клетках не наблюдается. Определенное соотношение синтеза ММР и специфических эндогенных ингибиторов обеспечивает внедрение эмбриона в стенку матки. Образование новых кровеносных сосудов — необходимый этап в процессах развития организма, заживления ран и воспаления. Процесс требует отделения эндотелиальных клеток от базальных мембран и их миграции через соединительнотканный барьер. Во время миграции клетки эндотелия продуцируют ряд ММР, которые облегчают миграцию клеток.
Стало известно, что ряд факторов стимулируют не только неоангиогенез, но и продукцию ММР. ММР-1, -2, -3 и -9; такие ферменты были обнаружены в стимулированных эндотелиальных клетках, а уровень каждого из них зависел от источника и вида клеток. Действие ингибиторов ММР, в том числе ТГМР-1, на инвазивный процесс эндотели-альных клеток, подтверждает участие ММР в ан-гиогенезе.
Сделан еще один важный шаг в понимании молекулярных основ регуляции процесса инвазии на уровне межклеточного взаимодействия. Известно, что инвазия зависит от кооперации процессов адгезии и протеолиза. Интегрины рассматриваются как молекулы адгезии, выполняющие функции внеклеточных рецепторов матрикса. Установлено, что ММР-2 может быть локализована в активной форме на поверхности инвазирующих клеток путем взаимодействия с интегрином-апв-3. Комплексы с интегрином обнаружены на поверхности эндоте-лиальных клеток. Эти данные указывают на участие единого рецепторного механизма в регуляции процессов деградации матрикса и миграции клеток. В настоящее время проводятся многочисленные исследования по разработке ингибиторов ММР как лекарственных препаратов.
Показано, что повышенная активность ММР оказывает непосредственное влияние на физиологию молочной железы, так как контролируемый процесс ремоделирования внеклеточного матрикса путем околоклеточного протеолиза является важной частью морфогенеза молочной железы, циклических изменений в течение менструального цикла и дифференциации, необходимой для лактации. Хотя разрушение внеклеточного матрикса необходимо для эпителиальных клеток, стромальные клетки, включая фибробласты, наряду с клетками воспаления и иммунными клетками, являются главными продуцентами ММР.
РОЛЬ ММП ПРИ ЗАБОЛЕВАНИЯХ ПАРОДОНТА
Пародонтит — хронический воспалительный процесс, индуцированный бактериальной инфекцией и затрагивающий десны и поддерживающие зубы структуры, включая кость. Длительно существующая инфекция пародонта активирует защитные, в том числе иммунные, механизмы, которые могут оказаться деструктивными для организма и привести к потере зубов и(или) зубных имплантатов. Современные методы клинического обследования больных пародонтитом и оценки природы бактериальной инфекции достаточно надежны и информативны, однако в большей степени оценивают историю и природу заболевания, чем его активность. В этой связи существенную помощь в оценке тяжести заболевания и формировании групп пациентов с повышенным риском прогрессирования пародонтита и возникновения необратимых деструктивных из-
менений могли бы оказать современные неинвазив-ные молекулярно-биохимические методы оценки состояния пародонта.
В здоровой ткани пародонта уровень TIMPs обычно выше, чем в воспаленной ткани, в которой соотношение между активностью ММР и уровнем TIMPs сдвигается в сторону ММР. Чем тяжелее воспаление, тем выше активность ММР. В десневой жидкости при пародонтите активность ММР-1, -2, -3 и -9 существенно повышается, а TIMP-1 и TIMP-2 резко понижена по сравнению с уровнем у здоровых людей. Некоторые исследования указывают на рост уровня TIMPs при пародонтите, которого, однако, недостаточно, чтобы блокировать повышенную активность ММР.
Известно, что одним из главных факторов в этиологии пародонтита является микробный. Большинство воспалительных заболеваний пародонта возникают в результате бактериальной инфекции. При отсутствии микробного фактора воспроизвести в эксперименте пародонтит невозможно. При этом основными патогенами, провоцирующими возникновение пародонтита, считаются Actinobacilius actinomycetem comitans и Porphyromonas gingivalis. Кроме того, в возникновении болезни участвуют Tannerella forsythia, Treponema denticola, Campylobacter rectus, Micromonas micros, Streptococcus intermedius, Eubacterium nodatum, Prevotella intermedia, Bacteroides forsythus и др. [1].
Однако роль спускового крючка в развитии хронического генерализованного пародонтита играют особенности иммунного ответа, нарушения в эндокринной системе и т.д. Вместе с тем взаимодействие микроорганизмов и их токсинов с клетками эпителия десны запускает цепь биохимических реакций, которые ведут к развитию очага воспаления, миграции в него лейкоцитов, нарушению проницаемости капилляров и кровоточивости десен. Усиленная продукция в очаге воспаления клетками протеолитических ферментов, в том числе и ММР, — результат ответной реакции клеток эпителия и иммунной системы на инвазию микроорганизмов, что приводит к разрушению ВКМ; в результате возникают пародонтальные карманы, патологическая подвижность и смещение зубов, резорбция межальвеолярных перегородок и остеопороз. Коллагеназы бактерий действуют иным способом: они расщепляют коллаген в различных участках, образуя множество коротких пептидных фрагментов [14].
Микроорганизмы взаимодействуют c эпителиальными клетками десен через TL-рецепторы (toll-like receptors). В ответ на это клетки секрети-руют интерлейкин (ИЛ) 1, фактор некроза опухоли (ФНОа), MMP и антимикробные пептиды. Цито-кины (ИЛ-1, -8, -12, ФНОа) стимулируют миграцию других типов иммунных клеток в очаг воспаления.
Под действием провоспалительных цитокинов, белков комплемента и продуктов патогенов в тка-
нях пародонта появляются нейтрофилы и макрофаги. Активированные макрофаги продуцируют ИЛ12 и интерферон (ИФН)-у. При хроническом течении процесса морфологическая картина в очаге воспаления напоминает гиперчувствительность замедленного типа. Наличие ИЛ12 ускоряет хемотаксис и последующую активацию макрофагов и Т-хелперов 1-го типа. В периоды обострения хронического пародонтита в очагах воспаления преобладают B-клетки, плазматические клетки и T-хелперы 2-го типа. Стимуляция этих клеток бактериальными продуктами (например, липополисахар идами) ведет к секреции цитокинов ИЛ1 и ФНОа, которые могут опосредованным путем индуцировать диф-ференцировку предшественников остеокластов и впоследствии их активацию. Дифференцировка остеобластов зависит от синтеза так называемого лиганда остеопротегерина (RANKL) этими клетками. В противоположность этому активированные Т-клетки за счет собственного синтеза RANKL могут напрямую ускорять дифференцировку остеобластов. RANKL преимущественно синтезируется в Th-1-клетках. Таким образом, в действии T-клеток на резорбцию костной ткани при пародонтите участвует в основном Th-1 тип Т-клеток.
Остепротегерин (OPG) является белком — представителем семейства TNF-рецепторов. Он предотвращает связывание RANKL с трансмембранным рецептором RANK (активатор рецептора NF-kB), блокируя пролиферацию и дифференцировку остеобластов. При хроническом пародонтите соотношение RANKL/OPG повышается, что стимулирует образование остеокластов из предшественников. Известно также, что фактор роста кератиноцитов (KGF-1) запускает пролиферацию и инвазию эпителиоцитов в соединительную ткань, что способствует образованию зубодесневых карманов.
Кроме указанных эффектов, возможно и прямое повреждающее действие патогенов на ткани паро-донта, хотя в настоящее время этот механизм развития пародонтита считается второстепенным. Так, P. gingivalis секретирует ферменты (протеазы, MMP, фибринолизин, фосфолипазу A), которые могут повреждать клетки окружающих тканей и вести к их гибели.
Из известных ММР наибольшей протеолитиче-ской активностью по отношению к коллагену I типа обладает коллагеназа нейтрофилов или ММР-8, активность которой, по данным экспериментальных и клинических исследований, тесно связана с патологическими изменениями околозубной ткани. Существенный вклад в коллагенолиз вносят также желати-назы ММР-2 и ММР-9, главным субстратом которых является коллаген IV типа. Широкая субстратная специфичность ММР, включающая в том числе воспалительные цитокины, определяет их участие не только в процессах деструкции пародонта, но и в модуляции воспалительной реакции на бактериальную инфекцию.
ММР-8 (КОЛЛАГЕНАЗА-2, КОЛЛАГЕНАЗА НЕЙТРОФИЛОВ)
ММР-8 синтезируется гранулоцитами при их дифференцировке в костном мозге и сохраняется в специфических гранулах циркулирующих нейтрофилов. Однако существуют другие источники ММР-8: эпителиальные клетки, фибробласты из десен и пе-риодонта, моноциты/макрофаги, плазматические клетки [10, 14]. ММР-8 активно разрушает не только коллагены I, II, III, VII, VIII и X типов, но и другие молекулы клеток и ВКМ.
Имеются данные, указывающие на то, что сул-кулярные эпителиальные клетки и базальные клетки могут взаимодействовать с разрушающими ткани ММР [14]. Имеются доказательства того, что стимулированные цитокинами синовиальные и гингиваль-ные фибробласты, моноциты/макрофаги, клетки эндотелия и хондроциты суставов могут секретировать мезенхимальный тип ММР-8 de novo, указывая на более сложный, чем считалось ранее, характер процесса повреждения тканей этим ферментом.
MMP-8 высвобождается из нейтрофилов в латентной, неактивной проформе и становится активной в очаге воспаления в периодонте под действием независимых или координированных действий медиаторов воспаления, таких, как ФНОа и ИЛ1р, микробных протеаз и радикалов кислорода из активированных нейтрофилов [13, 14]. Размер ММР-8 колеблется, по данным разных авторов, от 50 до 85 kDa, а некоторые формы — в пределах 20 kDa [14], отражая различную степень гликирования ММР-8 и то, в какой форме (латентной или активной) находится фермент после ограниченного протеолиза. Активированная ММР-8 из периферических нейтрофилов при иммунноблоттинге может быть обнаружена во фракции 65—70 kDa, а ММР-8 из десневой жидкости определяется в основном в зоне 60 kDa и в небольшом количестве — в зоне 78 kDa, соответствуя активной и латентной формам фермента. Активность ММР-8 может быть блокирована ТШР-1 и TIMP-2, а также тетрациклинами (доксициклином), химически модифицированным производным тетрациклинов, бифосфонатами и ЭДТА.
Показано, что ММР-8 играет важную роль в разрушении тканей при пародонтите. Фермент считают основной коллагеназой при хроническом пародон-тите [14, 15]. Субстратами во внеклеточном матрик-се для ММР-8 являются коллагены I—III, VII и X типов, желатин, протеогликаны, брадикинин, ан-гиотензин I, фибриноген, субстанция Р и аггрекан, а также про- и противовоспалительные цитокины/ медиаторы. Активность ММР-8 наблюдали при воспалении, связанном с гингивитом. При гингивите уровень ММР-8 слегка повышается в десневой жидкости, но фермент обнаруживается в латентной, неактивной проформе. При хроническом пародонтите активность ММР-8 составляет 90—95% от активности всех коллагеназ в десневой жидкости. В активную, прогрессирующую фазу пародонтита уровень
ММР-8 в десневой жидкости существенно повышен, и фермент присутствует в основном в активной форме.
У пациентов с прогрессирующей потерей соединительной ткани периодонта в десневой жидкости обнаружена более высокая активность ММР-8, чем у пациентов со стабильным состоянием и у страдающих гингивитом. После успешного лечения пародонтита активность ММР-8 в десневой жидкости существенно понижается, а имеющаяся коллагеназа присутствует в латентной форме.
Уровень активной коллагеназы в слюнной жидкости и смыве из ротовой полости также отражает тесную связь со стадиями пародонтита. Так, в слюне или смыве из ротовой полости пациентов с нелеченым хроническим пародонтитом обнаруживали высокую активность ММР-8; после лечения ее уровень снижался. ММР-8 является также главным источником коллагеназной активности в воспаленной десневой ткани у человека. Экстракты воспаленной десневой ткани, взятые у больных с пародонтитом, при сравнении с экстрактами из здоровой ткани характеризовались патологически повышенным уровнем ММР-8 в активной форме. ММР-8 считают также основной ММП зрелой зубной бляшки у человека.
Повышенный уровень ММР-8 обнаружен при других воспалительных заболеваниях: ревматоидном артрите, хроническом воспалении легких, заболеваниях глаз. Вместе с тем показано, что ММР-8 присущи противовоспалительные и защитные функции при воспалениях легких различного генеза, возможно, через регуляцию апоптоза клеток в очаге воспаления и процессинге противовоспалительных цитоки-нов и хемокинов.
ЖЕЛАТИНАЗЫ ММР-2 И ММР-9
Предполагается, что ММР-2 и ММР-9 также участвуют в разрушении ткани периодонта при пародонтите, так как при этом заболевании в десневой жидкости обнаружено существенное повышение активности этих желатиназ, в результате лечения она снижалась.
ММР-2 и ММР-9 расщепляют как желатины (коллаген после денатурации кишечными коллагена-зами), так и коллагены IV, V, VII, X и XI типов, эластин и компоненты базальной мембраны. В структуре обеих желатиназ имеется 3 мотива фибронектина-II в каталитическом домене, которые необходимы для эффективного расщепления IV типа коллагена, эластина и желатинов.
ММР-2 (желатиназа А), размер 72 kDa, в основном синтезируется фибробластами и другими клетками соединительной ткани. ММР-2 расщепляет прежде всего эластин. Как и ММР-2, ММР-1 может действовать на внутриклеточные белки. ММР-2 обладает более слабой коллагенолитической активностью, чем ММР-1 в растворе, но у поверхности клетки фермент активируется мембраносвязанной МТ-ММР, увели-
чивая свою коллагенолитическую активность. Повышение уровня ММР-2 обнаружено в десневой ткани пациентов с хроническим пародонтитом в зоне рядом с сулкулярной базальной мембраной.
ММР-9 относится также к членам семейства протеолитических ферментов, которые регулируют клеточно-матриксную композицию; для проявления их активности требуется цинк. ММР-9 разрушает денатурированный коллаген (желатин), в частности IV тип коллагена, который входит как основной в состав базальных мембран.
Еще более эффективно ММР-9 расщепляет желатин, а также коллагены IV, I, II, III, V, VI и X типов, фибронектин, фибрилин и аггрекан. Такое разрушение коллагена помогает лимфоцитам и другим лей-коцитоподобным дендритным клеткам проникать в кровяное русло и лимфатические сосуды и циркулировать в них. ММР-9 также способна разрушать основной белок миелина (MBP) и 2-й тип желатинов, остающиеся эпитопы которых способны генерировать аутоиммунные процессы.
Экспрессия и секреция ММР-9 активированными лимфоцитами и моноцитами регулируется цитокинами, хемокинами, эйкозаноидами и пепти-догликанами. В большинстве типов клеток генная транскрипция ММР-9 приводит к секреции зимогена (профермента), который остается неактивным до тех пор, пока не активируется после удаления пропептид-ного домена протеолитическими ферментами, подобно стромелизину-1, ММР-2 и другим ММРб. Обычно ММР-9 секретируется вместе с различным количеством специфического ингибитора TIMP-1, который контролирует ее протеолитическую активность. Нарушение баланса между ММРб и TIMPs может приводить к деградации тканей, что часто ассоциировано с такими воспалительными заболеваниями, как хронический пародонтит, атеросклероз, системная красная волчанка, синдром Съегрена, системный склероз, ревматоидный артрит, множественный склероз и полимиозит.
При пародонтите главным источником ММР-9 являются нейтрофилы, в меньшей степени — моноциты/макрофаги. Липополисахариды Fimbriae P. gingivalis могут играть существенную роль в индукции дендритными клетками (инфильтрирующими слизистую оболочку полости рта) ММР-9. Последняя считается потенциальным медиатором локальной деструкции тканей и лейкоцитарной инфильтрации.
Считается, что ММР-9 — основная желатиназа в десневой ткани, зубных бляшках, слюнной и дес-невой жидкости у пациентов с хроническим паро-донтитом. В десневой жидкости таких больных ее активность существенно выше, чем при локальном ювенильном пародонтите и у здоровых. В десневой жидкости, полученной методом омывания ротовой полости, собранной у больных пародонтитом, активная желатиназа (ММР-9) обнаружена в большинстве образцов (97,8%), тогда как при гингивите — только
в 11,4%. Средняя активность ММР-9 была максимальной у больных с рецидивирующим заболеванием и при возникновении абсцесса. В период образования зубодесневых карманов у больных пародонти-том средняя желатиназная активность возрастала в 2 раза, поэтому было предложено исследовать ММР-9 в качестве маркера при оценке клинической тяжести пародонтита, основываясь на изучении поперечных срезов из пародонта.
В настоящее время из ряда перспективных биомаркеров пародонтита в клиническую практику внедрен только MMP-8 — фермент, преобладающий в очагах пародонтита и в слюнной жидкости. Еще в 1999 г. с целью развития экспресс-анализа коллаге-назной активности S. Mancinietal разработан новый метод (solublebiotinylated-collagenassay — SBA), основанный на хемилюминесцентном обнаружении био-тинилированных продуктов расщепления коллагена. Они проверили диагностические возможности SBA в перекрестном и долгосрочном исследовании (участвовали 125 больных с пародонтитом и 32 здоровых добровольца). Анализ ММР-8 в десневой (альвеолярной) жидкости показал, что при прогрессирующем пародонтите уровень фермента возрастает в 18 раз по сравнению с показателем в контрольной группе и больных пародонтитом в стабильном состоянии. В ходе терапии уровень ММР-8 снижался более чем в
4 раза.
В десневой жидкости была обнаружена MMP-8 в концентрации >1 мг/л. Результаты, полученные при экспресс-тесте, длительность которого не превышала
5 мин, хорошо согласовывались с результатами имму-нофлюоресцентного анализа ММР-8 в десневой жидкости и клиническими проявлениями пародонтита. В результате лечения пародонтита уровень ММР-8 значительно снижался.
Примерно в то же время было испытано [8] портативное диагностическое устройство для анализа ММР-8 и других маркеров в слюне — Integrated Microfluidic РМАэгш for Oral Diagnostics (ШРОБ). В исследованиях этого коллектива 1МРОБ позволял быстро (за 3—10 мин) измерять концентрацию ММР-8 и других биомаркеров в слюне. Средняя концентрация ММР-8 в слюне пациентов с интактным пародонтом была в 10 раз меньше, чем у больных па-родонтитом. Таким образом, существующие технологии позволяют проводить экспресс-диагностику па-родонтита, контролировать его клиническое течение и эффективность терапии.
СОВРЕМЕННЫЕ КЛИНИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ ММР
С помощью иммуноферментного анализа выявлены [1] повышенные (по сравнению с 20 практически здоровыми людьми и 15 больными гингивитом) уровни ММР-8 в слюне и ММР-9 в межальвеолярной жидкости у 20 больных с начальной стадией пародон-тита. При этом в сравниваемых 2 группах авторы обнаружили низкий уровень ММР-2 в межальвеоляр-
ной жидкости (в отличие от показателей у больных пародонтитом). На основании проведенного анализа предположено, что определение уровней ММР-8 в слюне, а также ММР-2 и ММР-9 в межальвеолярной жидкости может служить маркером для раннего выявления пародонтита и гингивита.
Установлена связь биомаркеров слюны (ММР-8, HH1ß, OPG) c 3 основными аспектами пародонтита: воспалением, деградацией коллагена и костными изменениями [4, 9]. В исследовании случай-контроль (28 больных пародонтитом и 29 здоровых) было показано, что только при комбинации высоких показателей ММР-8 и KH1ß в слюне вероятность развития заболеваний пародонта увеличивается в 45 раз. При этом повышенные уровни всех 3 изученных биомаркеров в слюне коррелируют с индивидуальными клиническими признаками пародонтита.
С помощью ПЦР в реальном времени и иммуноферментного анализа было проведено [5, 12] сравнительное исследование уровня в слюне про-воспалительных цитокинов, ММР-8, ММР-9 и маркеров костной резорбции (OPG): 1) у практически здоровых/у больных гингивитом; 2) у больных пародонтитом. При этом уровни исследованных биомаркеров коррелировали с наличием анаэробных периодонтальных патогенов (Porphyromonas gingivalis и Treponema denticola), которые считаются предшественниками воспалительных заболеваний пародон-та. Такой подход имеет большое практическое значение, так как с помощью указанных выше маркеров позволяет выявлять локальные (в полости рта) и системные заболевания у человека.
В исследовании [1] представлены данные сравнительного иммуноферментного исследования ММР-1, -8, и -13 в образцах ткани при периапи-кальных повреждениях пародонта. Повышение уровня ММРs в очагах повреждения пародонта было пропорционально прогрессированнию патологического процесса и деструкции костной ткани, что подтверждено клиническими и рентгенологическими методами обследования. По мнению исследова-тел ей, полученные данные подтверждают деструктивную роль ММР-1, -8 и -13 при воспалительных процессах и напрямую связаны с дегенеративными изменениями в тканях пародонта.
Проведено [6, 11] сравнительное иммунофер-ментное (ELISA) и иммуноблоттинговое исследование содержания ММР-7, Т!МР-1 и внеклеточного индуктора ММП (EMMPRIN) в межальвеолярной жидкости у 60 пациентов с заболеваниями пародон-та (генерализованный агрессивный пародонтит — у 20, хронический пародонтит — у 20, гингивит — у 20) и 20 практически здоровых людей с интактным пародонтом. Авторы выявили достоверное по сравнению со здоровыми (p<0,008) повышение указанных выше маркеров у больных всех 3 групп. При этом обнаружены достоверно более высокие показатели Т!МР-1 у больных генерализованным агрессивным и хроническим пародонтитом (p<0,0001)
по сравнению с пациентами с гингивитом. Кроме того, исследователи выявили растворимые формы ЕММРЯШ с различной молекулярной массой (30, 55, 100, 180, 200 kDa) в межальвеолярной жидкости пациентов 3 групп. Отмечено также повышение (статистически незначимое) уровня Т!МР-1 и ЕММРЯШ у больных генерализованным агрессивным пародонтитом (по сравнению с больными гингивитом).
Данные ряда авторов [3, 5, 13] показывают, что ММР-7 ассоциирована с естественной защитой тканей пародонта, а высокие уровни Т!МР-1 и ЕММРЯШ в межальвеолярной жидкости — с воспалительным процессом в тканях пародонта. Авторы полагают, что Т!МР-1 и ЕММРЯШ могут участвовать в прогрессировании воспалительного процесса в тканях пародонта, при этом молекулы ЕММРЯШ присутствуют в начальной стадии этого процесса.
Пародонтит считают хроническим воспалительным заболеванием тканей пародонта; большинство исследователей полагают, что он инициируется группой патогенов, локализованных в тканях пародонта. После активного размножения колоний патогенов последние способны стимулировать иммунный ответ циркулирующих иммунных клеток, которые начинают активно продуцировать провоспалительные цитокины, простагландины, протеиназы, в том числе и ММРs.
В клиническом исследовании случай-контроль наряду с RANKL изучали также в нестимулирован-ной слюне 35 взрослых больных хроническим паро-донтитом с ремоделированием костной ткани и 37 практически здоровых лиц с интактным пародонтом С-телопептид коллагена I типа с пиридинолиновыми перекрестными связями (ICTP) и ФНОа. Последний был обнаружен во всех образцах слюны больных па-родонтитом (4,33 пг/мл); максимальный показатель — 27,96 пг/мл, его уровень был достоверно выше, чем в контроле (2,03 пг/мл; p<0,02). Авторы полагают, что показатель ФНОа в слюне может служить индикатором пародонтита и, кроме того, биомаркером в скрининге, диагностике и мониторинге больных с хроническими воспалительными заболеваниями тканей пародонта.
В последние годы интерес исследователей прикован к изучению молекул клеточной адгезии (CAMs) при хроническом пародонтите. Они представлены в виде белков на мембранах клеточной поверхности и участвуют в механизмах взаимодействия клеток друг с другом, с эндотелием и ВКМ. Растворимые формы CAMs (sCAMs) появляются при протеоли-тическом разрушении клеток, и эти белки попадают в десневую жидкость. Представлены данные [12] по иммуноферментному изучению sCAMs, sICAM-1, sVCAM-1 и sE-селектина в десневой жидкости у 22 практически здоровых людей с интактным пародон-том и 29 больных хроническим пародонтитом. Статистический анализ выявил достоверные различия
(p<0,05) в показателях sVCAM-1 у больных паро-донтитом и здоровых, что позволило авторам сделать заключение о высокой чувствительности этого маркера в выявлении пародонтита. Статистически достоверно этот маркер изменялся (его уровень снижался) после проведенной терапии у пациентов с хроническим пародонтитом. Полагают [12], указанные выше потенциальные маркеры клеточной адгезии могут быть чувствительными индикаторами прогрессирования пародонтита, в оценке эффективности терапии и играть превентивную роль в патогенезе воспалительных заболеваний тканей пародонта.
В крупных стоматологических клиниках Хельсинки и Вантаа обследованы [14] клинически и лабораторными методами 214 пациентов в возрасте от 44 до 78 лет с целью выделения биомаркеров в смывах из ротовой полости для определения их порогового уровня в оценке степени тяжести воспалительной реакции в тканях при пародонтите. Авторы сравнили несколько методов определения концентрации ММР-8; наряду с этим биомаркером изучали также активность эластазы и показатели Т!МР-1. Были выявлены тесная связь активности эластазы с высокими уровнями ММР-8, определенными иммунофлуориметрическим методом (ШМА) и наборами реактивов denta Analyzer в смывах из ротовой полости пациентов с воспалительными заболеваниями тканей пародонта, а также тенденция к повышению уровня !РМА-ММР-8/ТШР-1 и dentoELISA-ММР-8/TIMP-1 при утяжелении воспалительной реакции при пародонтите. Отмечено снижение уровня Т!МР-1 с возрастом пациентов. Авторы полагают, что ММР-8 и Т!МР-1 могут быть использованы как маркеры в оценке степени тяжести воспалительной реакции при пародонтите.
На основании исследования в сыворотке крови 55 больных хроническим пародонтитом (курящих — 16, некурящих — 39) и 56 практически здоровых людей с интактным пародонтом (курящих — 17, некурящих — 39) ММР-8, ММР-9, ТШР-1, эластазы нейтрофилов (NE), миелопероксидазы (МРО) выявлены [10] следующие особенности. При хроническом пародонтите концентрация МРО и NE в сыворотке крови была выше у курящих, чем у некурящих больных (соответственно p<0,002 и p<0,001). Такая же закономерность сохранялась в группе практически здоровых. В то же время уровень ТШР-1 был выше у некурящих больных хроническим пародонтитом, чем у курящих. Обнаружено более высокое соотношение ММР-9/ Т!МР-1 у курящих больных пародонтитом, чем у некурящих (p<0,01), вместе с тем данное соотношение, а также показатели ММР-8 и ММР-8/ТШР-1 в группе больных хроническим пародонтитом не отличались от таковых у практически здоровых людей. Авторы полагают, что высокие показатели ММР-9, МРО, NE при пониженной концентрации ТШР-1 в сыворотке крови у курящих больных хроническим пародонтитом по сравнению с некурящими может,
наряду с деструкцией тканей пародонта, указывать на предрасположенность к сердечно-сосудистым заболеваниям.
Выявлены [11] достоверно более высокие показатели ММР-9, ТШР-1, ММР/ТШР-1 в слюне 69 больных хроническим пародонтитом, чем у 54 пациентов с интактным пародонтом. При этом уровень указанных биомаркеров коррелировал с данными клинического обследования пациентов. Полиморфизм гена промотора ММР-9(-1562С/Т) в колумбийской популяции не был тесно связан с вариациями изученных биомаркеров в слюне у обследованных и не коррелировал с клиническим статусом у них пародонта. Однако авторы полагают, что уровни ММР-9>20 нг/мл, ТШР-1>64 нг/мл и соотношение ММР-9/ПМР-1М в слюне могут служить независимыми маркерами, связанными с наличием пародонтита.
Большинство исследователей считают ММР-8 ключевым медиатором воспалительных реакций при хроническом пародонтите. При этом известно, что ММР-8 может кооперированно активировать другие ММРs, в частности ММР-14, активные формы кислорода, а также протеазы патогенов. Изучение в течение длительного периода уровня ММР-8, ММР-14, ТШР-1 и миелопероксидазы (МРО) в десневой жидкости 50 больных хроническим пародонти-том в период ремиссий, обострений и после терапии позволило выявить выраженную позитивную связь между показателями ММР-8, МРО и соотношения МРО/ММР-8 с клиническим течением хронического пародонтита (периоды обострения и ремиссии), а также эффектом проводимого лечения. Взаимоотношение между активацией ММР-2 и оксидативным путем в каскаде реакций при хроническом пародон-тите могут быть полезными биомаркерами для выявления рецидива болезни.
Приведенные литературные данные свидетельствуют о неоднозначности научных взглядов на роль ММР в этиологии и патогенезе воспалительных и воспалительно-деструктивных заболеваний пародон-та. Ряд исследователей склонны считать увеличение концентрации воспалительных цитокинов в ротовой жидкости важнейшим патогенетическим подтверждением возникновения и прогрессирования заболеваний пародонта. Другие, напротив, не придают данному явлению значительной роли. Дискутабельным остается вопрос о диагностическом значении увеличения концентрации воспалительных цитокинов в ротовой жидкости у пациентов с воспалительными и воспалительно-деструктивными заболеваниями па-родонта.
Нами изучена концентрация ММП-8 и -9 в ротовой жидкости у пациентов с пародонтитом различной степени тяжести. Проведено комплексное стоматологическое обследование 145 пациентов в возрасте от 18 до 52 лет: из них 63 — с интактным пародонтом (21 мужчина, 42 женщины), 25 — с легкой степенью заболевания (7 мужчин, 18 женщин),
45 — со средней (17 мужчин, 28 женщин) и 12 — с тяжелым пародонтитом (5 мужчин, 7 женщин). Концентрацию ММР-8 и ММР-9 определяли в нестиму-лированной слюне с помощью реактивов для прямого иммуноферментного анализа «HumanMMP-8 (total)» и «HumanMMP-9 (total)» (Quantikine®, R&DSystems, США) в соответствии с инструкциями производителя.
Согласно полученным данным, у обследованных не было статистически значимых различий в содержании ММП-8 и -9 в ротовой жидкости, однако отмечена тенденция к увеличению концентрации ММР-9 у пациентов с более тяжелым течением па-родонтита, чем при интактном пародонте (группа контроля).
Выявлена положительная корреляционная зависимость между глубиной пародонтальных карманов и содержанием ММР-9 в ротовой жидкости. При дальнейшем анализе изучены особенности взаимосвязи показателей ММР-8 и ММР-9 у пациентов в каждой из обследованных групп.
В группе с интактным пародонтом не установлено статистически значимых корреляций между концентрацией ММР-9 в ротовой жидкости, показателями индексной оценки состояния тканей пародонта и данными рентгенологического исследования. Концентрация ММР-8 у пациентов с интактным паро-донтом составила: нижний квартиль — 92,60; медиана — 181,03; верхний квартиль — 345,85 нг/мл, при легкой и средней степени тяжести пародонтита наблюдалось повышение концентрации ММР-8 соответственно до 94,80/257,95/291,60 и 116,85/183,15/518,90 нг/мл, при тяжелом пародонтите она понижалась до 78,40/169,75/326,00 нг/мл. Различия для ММР-8 между группами оказались статистически недостоверными (р>0,05), хотя отмечена тенденция к более высоким уровням ММР-8 и ММР-9 в ротовой жидкости больных при тяжелой степени пародонтита (по сравнению с более легким его течением и интактным пародонтом).
Изучалась корреляционная зависимость между содержанием ММР-9 в ротовой жидкости и показателями индексной оценки состояния тканей паро-донта (РМА, Р!) и гигиенического состояния полости рта (АРИ).
В группе пациентов с пародонтитом легкой степени тяжести выявлена статистически значимая корреляция между показателями ММР-9 в ротовой жидкости и индексом РМА (r=0,7302; р=0,00005 по Spearman). Положительная корреляция обнаружена в данной группе между глубиной пародонтального кармана (r=0,572 при р=0,42 по Spearman). Наличие корреляционной зависимости между API и содержанием ММР-9 свидетельствует об активации деструктивных процессов в полости рта при ухудшении гигиенического состояния последней. Отсутствие корреляционной зависимости между содержанием ММР-9 и показателями РМА, PI в ротовой жидкости свидетельствует о непол-
ной ее объективности индексной оценки состоя -ния тканей пародонта и необходимости поиска более информативных критериев, характеризующих воспалительно-дистрофический процесс в паро-донте.
У пациентов со средней степенью тяжести пародонтита выявлена статистически значимая корреляционная зависимость между глубиной паро-донтальных карманов и концентрацией ММР-9 (r=0,33; р=0,0056 по Spearman), корреляционные показатели по Gamma и Kendall Tau достигли соответственно r=0,253 и r=0,232 при уровне значимости р=0,0047. Положительная статистически значимая зависимость выявлена также между показателями ММР-9 в ротовой жидкости и количеством зубов, вовлеченных в патологический процесс (r=0,413; р=0,0005 по Spearman). Корреляционный коэффициент Gamma достиг r=0,332 при р=0,0002, показатель Kendall Tau: r=0,309 при р=0,0002. У пациентов со средней степенью тяжести пародонтита выявлена корреляционная зависимость между возрастом и показателями индексной оценки состояния пародон-та, а также клиническими критериями состояния тканей пародонта. Так, коэффициент корреляции Spearman между возрастом пациентов и показателем АР! составил r=0,5535 при р=0,0041, а между возрастом и индексом РМА — уровня r=0,5656 при значимости р=0,0144. Также положительная корреляционная зависимость выявлена между возрастом пациентов и количеством зубов, вовлеченных в патологический процесс: r=0,2826; уровень значимости — р=0,03.
Установленные корреляционные зависимости свидетельствуют о важном негативном влиянии возрастных изменений в организме человека на патогенез воспалительно-дистрофических процессов в па-родонте. Данный факт обусловливает необходимость дальнейшего изучения патогенетических механизмов воспалительно-дистрофических заболеваний паро-донта и детализации роли цитокинов, факторов роста и молекулярно-биологических маркеров в развитии этой патологии.
У пациентов с тяжелым пародонтитом статистически значимая корреляция выявлена между концентрацией ММР-9 и глубиной пародонтальных карманов (r=0,918 при р=0,00047), коэффициенты корреляции по критериям Gamma и Kendall Tau составили соответственно r=0,93 и r=0,84 (p=0,0017). PI статистически значимо коррелировал с концентрацией ММР-9 в ротовой жидкости на уровне значимости р=0,0475 (r=0,76). Данная зависимость по критерию Gamma составила r=0,73, по критерю Kendall Tau r=0,63 при р=0,047. Особенности корреляций между изучаемыми показателями в указанной группе свидетельствуют об отсутствии зависимости между гигиеническим состоянием полости рта и индексом РМА при прогрессировании воспалительно-дистрофических заболеваний пародонта. Наиболее объективно степень деструкции альвеолярной кости
можно оценить по концентрации ММР-9 в ротовой жидкости и РГ
Выявленные закономерности в изменении концентрации воспалительных цитокинов в ротовой жидкости у пациентов при различном состоянии тканей пародонта свидетельствуют о том, что на начальном этапе воспалительно-дистрофических заболеваний пародонта важнейшее значение имеет гигиеническое состояние полости рта, в частности микробная обсемененность. В дальнейшем прогрес-сирование заболевания связано с присоединением возрастных изменений в организме человека, причем данный фактор, согласно результатам корреляционного анализа, начинает играть важную роль в патогенезе пародонтита. Отсюда можно предположить, что воспалительно-дистрофический процесс в пародонте развивается поэтапно, и на каждом этапе возможны появление новых патогенетических факторов или суммирование их негативного влияния. Отсутствие корреляционной зависимости между показателями АР^ РМА, PI и содержанием ММР-9 в ротовой жидкости свидетельствует о неполной объективности индексной оценки состояния тканей па-родонта.
Согласно результатам корреляционного анализа, наиболее объективным клиническим критерием состояния тканей пародонта является глубина пародон-тального кармана, которая достоверно коррелировала с уровнем ММР-9 в ротовой жидкости.
МТ1-ММР играет критическую роль в деградации коллагена и вовлечении в развитие пародонти-та. Иммуногистохимическим методом обнаружены повышенные уровни МТ1-ММР и ТШР-2 в тканях десны у 12 больных пародонтитом, по сравнению с показателями у 10 здоровых с интактным пародон-том. Морфологические исследования выявили экспрессию МТ1-ММР в фибробластах и макрофагах тканей десны, а ТШР-2 — в фибробластах, макрофагах и эпителиальных клетках. По мнению авторов, нарушение баланса экспрессии указанных молекул (медиаторов ремоделирования коллагена) у больных пародонтитом позволяет предполагать их вовлечение в патогенез заболевания.
В десневой жидкости 27 больных хроническим пародонтитом и 15 обследованных с интактным па-родонтом изучен уровень ММР-8, ТШР-1, ТШР-2, МРО, общей ММР-9 и различных ее молекулярных форм (87, 92, 130 и 180 kDa). Достоверно более высокие уровни ММР-8, ТШР-1, ТШР-2, МРО и 87 kDa-ММР^ выявлены у больных пародонтитом по сравнению с контролем; через 3 мес после нехирургического лечения болезни они достоверно снижались. Различий между 2 группами обследованных в показателях общего ММР-9 и его высокомолекулярных форм (180, 130, 92 kDa) не обнаружено.
Изучены эффекты экстрактов [3], полученных УЗ-методом из 3 патогенов, связанных с периапи-кальным пародонтитом (P. gingivalis, P. endodontalis, F. nucleatum), на активацию ММР-2 и инактивацию
TIMP-1 и TIMP-2 в культуре клеток HT1080 из связок пародонта человека. Авторы полагают, что только экстракт из P. gingivalis может быть тесно связан с деструкцией апикальной части пародонта путем активации про-MMP^ (72 kDA) в MMP-2 (66 kDa) и инактивации TIMP-1 и TIMP-2.
В экспериментальных исследованиях in vitro показано, что MMP-13 может инициировать костную резорбцию и активировать про-MMP^, при этом обе металлопротеиназы связаны с деструкцией тканей при хроническом пародонтите. Поэтому M. Hernández Ríos et al. (2009) исследовали связь активности MMP-13 и уровня TIMP-1 в десневой жидкости больных с клиническими признаками прогрессирования хронического пародонтита. Наряду с этим авторы определяли уровни С-концевого телопептида коллагена I типа (ICTP). На основании анализа данных проспективного исследования они выявили достоверное увеличение уровня ICTP и MMP-13 у больных с прогрессированием паро-донтита. Кроме того, добавление синтетического ингибитора MMP-13 CL-82198 к эксплантатам тканей десны больных хроническим пародонтитом предотвращало активацию MMP-9. Авторы предполагают участие MMP-13 в деградации тканей пародонта и активации про-MMP^ в ходе прогрессиро-вания хронического пародонтита.
По данным многоцентрового рандомизированного исследования, субантимикробные дозы док-сициклина в комбинации с хирургическим методом ускоряют появление ремиссии у больных хроническим пародонтитом и способствуют ингибированию ранней стадии костной резорбции.
Представлены данные [12] по сравнительному изучению экспрессии генов MMP-1, 2, 9, 13, TIMP-1, TIMP-2 методом ПЦP в реальном времени у 10 больных гингивитом, 10 — с генерализованным хроническим пародонтитом, 8 — генерализованным агрессивным пародонтитом и у 10 обследованных с интактным пародонтом. Авторы использовали Вестерн-блот-анализ MMP-2 и MMP-9, чтобы оценить посттранскрипционные особенности регуляции MMP и уровни этих белков. Они не выявили достоверных различий между группами в частоте выявления и уровнях транскриптов MMPs и TIMPs. Отмечена тенденция к повышению активности MMP-2 и MMP-9 в образцах с воспалением. Зимография и Вестерн-блот-анализ показали, что MMP-2 практически отсутствует у больных хроническим пародон-титом. Представленные данные свидетельствуют о комплексной регуляции генной экспрессии MMPs и TIMPs в процессе развития воспаления при гингивите. Кроме того, выявлена значительная вариабельность биологических характеристик даже среди людей с одинаковым статусом пародонта.
Во всех изученных образцах [2] тканей десны, в пародонтальной связке и десневой жидкости (у больных гингивитом, пародонтитом и у здоровых людей) выявлены TIMP-1, TIMP-2, активные и
про-ММР-2 и 9, активные ММР-1, 8. Кроме того, обнаружено, что уровень ММР-2-комплексов и коллагенолитических фрагментов был выше в тканях пародонтальной связки и десневой жидкости больных пародонтитом, а уровни ТШР были ниже в патологически измененных тканях пародонта. Удивительно, но некоторые ММРs были выявлены в больших количествах в тканях здоровой десны и пародонтальной связки. Авторы считают, что высокий уровень активных ММР-2-комплексов и колла-генолитических фрагментов у больных пародонти-том свидетельствует об их связи с деструктивными процессами при данном заболевании.
У больных хроническим пародонтитом обнаружена [6] высокая экспрессия ММР-13; при прогрес-сировании заболевания наблюдалось дальнейшее повышение уровня маркера и снижение уровня ТШР-1. Уменьшалось также содержание ТШР-1 в десневой жидкости у больных пародонтитом, однако после лечения концентрация маркера возрастала.
После длительного (в течение 6 мес) лечения и наблюдения за 33 больными пародонтитом, у которых определяли в слюне исходно (до лечения), через 16 и 28 нед уровень HH1ß, ИЛ8, воспалительный белок макрофагов (М№)-1а, ММР-8, OPG и ФНОа, удалось установить, что эти биомаркеры могут быть чувствительными индикаторами ответа на лечение и потенциальными прогностическими факторами в мониторинге пародонтального статуса.
По данным [1, 11], протеолитическая деградация коллагена I типа считается одним из ключевых факторов неконтролируемого разрушения ВКМ па-родонта. По мнению [2, 9], коллагенолитическая активность присуща в первую очередь ММР — представителям мультигенного семейства, состоящего из более чем 20 цинкзависимых эндопептидаз, субстратами которых, помимо большинства компонентов ВКМ, могут быть другие протеазы, хемотаксические молекулы, латентные формы факторов роста, растворимые и мембраноассоциированные белки, связывающие факторы роста, цитокины. Активность ММР в межклеточном пространстве специфически подавляется тканевыми ингибиторами (ТШР) — структурно родственными белками, 3 из которых (ТШР-1, -2 и -4) секретируются в растворимой форме, а один (ТШР-3) - связан с ВКМ.
Из всех известных ММР наибольшей протеоли-тической активностью по отношению к коллагену I типа обладает коллагеназа нейтрофилов или ММР-8, активность которой, по данным экспериментальных и клинических исследований, тесно связана с патологическими изменениями в пародонте[4]. Существенный вклад в коллагенолиз вносят также желати-назы ММР-2 и ММР-9, главным субстратом которых является коллаген IV типа [6]. Широкая субстратная специфичность ММР, включающая и воспалительные цитокины, определяет их участие не только в процессах деструкции пародонта, но и в модуляции воспалительной реакции.
По мнению исследователей [4, 8, 13], достаточно информативным и неинвазивным способом оценки состояния и активности протеолитических процессов в пародонте является исследование ротовой жидкости. Нужно отметить, что на биохимические изменения в ротовой полости могут оказывать влияние не только собственно патологические процессы в пародонте, но и различные сопутствующие заболевания: сердечно-сосудистые [14], сахарный диабет [5], а также внешние факторы — такие, как курение [10] или наличие конструкционных материалов, используемых для реставрации зубов и зубных рядов [7].
В наших собственных исследованиях методом иммуноферментного анализа определена концентрация ММР-2, -8, -9, ИЛф и 6, ТШР-1, ТШР-2 и ФНОа в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом с различными конструкционными материалами, применявшимися для реставрации зубов и зубных рядов.
Обследованы 105 пациентов в возрасте от 18 до 52 лет: 58 — с несъемными металлическими конструкциями при реставрации зубов и зубных рядов (24 мужчины, 34 женщины) и 47 — без металлических конструкций (16 мужчин, 31 женщина). Были выявлены статистически значимые различия в концентрации ММР-9 и ММР-8 в ротовой жидкости между обследованными с интактным пародонтом и при хроническом генерализованном пародон-тите с металлическими конструкциями в полости рта (соответственно p=0,0168 и 0,0363). При этом концентрация ММР-9 при интактном пародонте составила 537,65 + 144,89 нг/мл, уровень ММР-8 — 223,23+93,3 нг/мл, у пациентов с металлическими конструкциями и воспалительными заболеваниями пародонта — соответсвенно 863,24+116,8 и 329,51+53,54 нг/мл.
В группе пациентов без металлических конструкций статистически значимые различия обнаружены между показателями ММР-9 (при интакт-ном пародонте 574,58+96,35 нг/мл, у пациентов с пародонтитом - 1478,38+293,28 нг/мл; p=0,0069), ТШР-2 (соответственно 21,31+7,05 и 44,22+7,17 нг/ мл; p=0,045) и ММР-2 (0,25+0,13 и 4,43+1,37 нг/мл; p=0,003). Остальные параметры были без статистически значимых различий. Выявленная статистически значимая разница между концентрацией ММР-9 и ММР-8 у обследованных с интактным пародонтом и больных хроническим генерализованным паро-донтитом подтверждает важную роль ММР-9 в развитии воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта.
При непараметрическом дисперсионном анализе установлены статистически значимые различия в концентрации ММР-2 в ротовой жидкости (х2=9,98; p=0,0188) между 4 группами пациентов: максимальный показатель зафиксирован у пациентов с пародонтитом без металлических конструкций (4,43+1,37 нг/мл), минимальный (0,25+0,13 нг/
мл) - у обследованных с интактным пародонтом и без металлических конструкций. В группе больных пародонтитом с металлическими конструкциями выявлена та же закономерность: при пародонтите — 1,86+0,93 нг/мл, у пациентов с интактным пародонтом — 0,95+0,75 нг/мл. В обеих группах наиболее высокие значения зафиксированы у пациентов с пародонтитом, однако у пациентов с наличием металлических конструкций в полости рта разница в концентрации ММР-2 при интактном пародонте и пародонтите была меньше, что, по-видимому, связано с супресивным действием компонентов металлического сплава на продукцию ММР-2.
При корреляционном анализе полученных данных у обследованных с интактным пародонтом и без металлических конструкций в полости рта выявлена положительная корреляционная зависимость между концентрацией ММР-9 и ММР-8 в ротовой жидкости, показателями ММП-9 и ТШР-1, а также ММР-2 и ТШР-2. Отрицательные корреляции обнаружены между показателями ИЛ6 и ФНОа, а также между ИЛ^ и РГ
У пациентов с пародонтитом и без металлических конструкций также выявлена достоверная положительная корреляция между концентрацией ММР-9 и ММР-8. Уровень ММР-2 находился в положительной корреляции с возрастом пациентов, а также с индексами Р^ РМА, а концентрация ММР-8 отрицательно коррелировала с показателями PI и РМА. По сравнению с группами обследованных с интактным пародонтом наблюдалось снижение корреляционных взаимосвязей между ММР-9 и ММР-8. Наличие корреляций между ММР-2 и возрастом, Р^ РМА свидетельствует о тесной взаимосвязи концентрации ММР-2 в ротовой жидкости больных па-родонтитом и индексной оценкой состояния тканей пародонта, а также подтверждает опубликованные ранее данные о влиянии возрастных изменений на частоту воспалительно-деструктивных заболеваний пародонта.
В группе обследованных с интактным паро-донтом и наличием металлических конструкций в полости рта выявлена положительная корреляция между показателями ММР-9 и ММР-8 в ротовой жидкости. Уровень ММР-9 коррелировал также с концентрацией ИЛ6, а ММР-8 — с показателями ИЛ6 и ИЛ^ [15].
У пациентов с пародонтитом и наличием металлических конструкций в полости рта положительные корреляционные взаимосвязи выявлены между значениями ММР-9 в ротовой жидкости и ММР-8, ИЛ6, ИЛ^, ФНОа, а также между ММР-8 и концентрацией ИЛ^ и индексом АРГ Отрицательная корреляция определялась между значением ММР-8 в ротовой жидкости и глубиной пародонтальных карманов. Обнаружена положительная корреляционная связь между уровнями ИЛ6 и ИЛ^ в ротовой жидкости и отрицательная — между ИЛ6 и показателем глубины пародонтальных карманов. Положи-
тельные корреляции установлены также между концентрацией ИЛ^ и ФНОа и между ИЛ^ и РМА. Концентрация ММР-2 в ротовой жидкости пациентов данной группы положительно коррелировала с показателем PI [15].
Полученные данные свидетельствуют об относительной схожести регуляции процессов продукции ММР, ИЛ и ТШР в ротовой жидкости у пациентов с интактным пародонтом. При хроническом генерализованном пародонтите (как у больных с металлическими конструкциями зубов и зубных рядов, так и без них) выявленные корреляционные коэффициенты свидетельствует о возникновении каскада биохимических реакций, сопровождающихся активацией продукции цитокинов в ответ на воздействие этиологических факторов. Более выраженная реакция наблюдается в группе пациентов с пародонтитом и металлическими конструкциями: в данной группе в ответ на увеличение ММР-2, -8, -9 возрастает концентрация ИЛ^ и ИЛ6, что подтверждается выявленными корреляционными зависимостями.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
Таким образом, проведенное исследование позволяет считать, что ММР-9 в ротовой жидкости может служить маркером хронического генерализованного
пародонтита, что совпадает с мнением других авторов [2]. Результаты наших собственных исследований свидетельствуют о том, что наличие в полости рта пациентов ортопедических конструкций из хромоко-бальтового или хромоникелевого сплава ведет к увеличению содержания ММР-2, ИЛ^ и ИЛ6 в ротовой жидкости.
Анализ литературы и результаты собственных исследований позволяют рассматривать ММР как ключевой медиатор повреждения тканей при паро-донтите, поскольку имеются доказательства необратимого разрушения соединительной ткани при этом заболевании и факты, свидетельствующие о том, что расщепление коллагена соединительной ткани и органических компонентов костной ткани осуществляется через ММР. По мнению [14], причиной повышения активности ММР в этих условиях считается дисбаланс между ММР и их локально действующими ТIМPs.
Таким образом, можно заключить, что вопрос о патогенетическом влиянии ММР на воспалительные и воспалительно-деструктивные заболевания пародонта не решен. Дальнейшее изучение данной проблемы остается важным направлением как для диагностики заболеваний пародонта, так и для повышения эффективности их лечения, профилактики и прогноза.
ЛИТЕРАТУРА/REFERENCES
1. Andonovska B., Dimova C., Panov S. Matrix metalloproteinases (MMP-1, -8, -13) in chronic periapical lesions. Vojnosanit. Pregl. 2008; 65 (12): 882-886.
2. Bildt M., Bloemen M., Kuijpers-Jagtman A., Von den Hoff J. Collagenolytic fragments and active gelatinase complexes in periodontitis. J. Periodontol. 2008; 79 (9): 1704-11.
3. Carneiro E., Menezes R., Garlet G. et al. Expression analysis of matrix metalloprotei-nase-9 in epithelialized and nonepithelial-ized apical periodontitis lesions. Oral Surg. Oral Med. Oral Pathol. Oral Radiol. Endod. 2009; 107 (1): 127-32.
4. Christodoulides N., Floriano P., Miller C. et al. Lab-on-a-chip methods for point-of-care measurements of salivary biomarkers of periodontitis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1098:411-428.
5. Costa P., Trevisan G., Macedo G. et al. Salivary interleukin-6, matrix metalloprotein-ase-8, and osteoprotegerin in patients with periodontitis and diabetes. J. Periodontol. 2010; 81 (3): 384-91.
6. deQueiroz A., Taba M., O'Connell P. et al. Inflammation markers in healthy and periodontitis patients: a preliminary data screening. Braz. Dent. J. 2008; 19 (1): 3-8.
7. de Souza A., Gerlach R., Line S. Inhibition of human gingival gelatinases (MMP-2 and MMP-9) by metal salts. Dent. Mater. 2000; 16 (2); 103-8.
8. Christodoulides N., Floriano P., Miller C. et al. Lab-on-a-chip methods for point-of-care measurements of salivary biomarkers of periodontitis. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007: 1098: 411-28.
9. Gursoy U., Kononen E., Pradhan-Palikhe P. et al. Salivary MMP-8, TIMP-1, and ICTP as markers of advanced periodontitis. J. Clin. Periodontol. 2010; 37 (6): 487-93.
10. Heikkinen A., Sorsa T., Pitkaniemi J. et al. Smoking affects diagnostic salivary periodontal disease biomarker levels in adolescents. J. Periodontol. 2010; 81 (9); 1299-1307.
11. Isaza-Guzman D., Arias-Osorio C., Martinez-Pabon M., Tobon-Arroyave S. Salivary levels of matrix metalloproteinase (MMP)-9 and tissue inhibitor of matrix metalloproteinase (TIMP)-1: a pilot study about the relationship with periodontal status and MMP-9(-1562C/T) gene promoter polymorphism. Arch. Oral Biol. 2011; 56 (4): 401-11.
12. Kumar M., Vamsi G., Sripriya R., Sehgal P. Expression of matrix metalloproteinases
(MMP-8 and -9) in chronic periodontitis patients with and without diabetes mellitus. J. Periodontol. 2006; 77 (11): 1803-8.
13. Rai B., Kharb S., Jain R., Anand S.C. Biomarkers of periodontitis in oral fluids. J. Oral Sci. 2008; 50 (1): 53-6.
14. Sorsa T., Tervahartiala T., Leppilahti J. et al. Collagenase-2 (MMP-8) as a point-of-care biomarker in periodontitis and cardiovascular diseases. Therapeutic response to non-antimicrobial properties of tetracyclines. Pharmacol. Res. 2011; 63 (2): 108-13.
15. Кушлинский Н.Е., Соловых Е.А., Караогланова Т. Б., Баяр У., Герштейн Е.С., Трошин А.А., Костылева
О.И., Гринин В.М., Максимовская Л.Н., Янушевич О.О. Содержание матриксных металлопротеиназ 8-го и 9-го типа в ротовой жидкости больных хроническим генерализованным пародонтитом. Бюлл. экспер. биол. мед. 2011; 152 (8): 201-6. [Kushlinskij N.E., Solovyh E.A., Kara-oglanova T.B., Bajar U., Gershtein E.S. Content of matrix metalloproteinases 8-th and 9-th type in the oral fluid of patients with chronic generalized periodontitis. Bjulleten'j eksperimental'noj biologii i mediciny. 2011; 152 (8): 201-6 (in Russian)]
