CC BY
62
Математическое моделирование бактериального метаболизма
А. Н. Голомысова1,0, М. Гомельский2, П. С. Иванов1
1 Московский государственный университет имени М. В. Ломоносова, физический факультет,
кафедра биофизики. Россия, 119991, Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 2.
2 Вайомингский университет, кафедра молекулярной биологии. 1000 Е University Ave., Dept. 3944,
University of Wyoming, Laramie, WY 82071, USA.
E-mail: a agolomy@yandex.ru
Статья поступила 25.12.2009, подписана в печать 18.02.2010
Представлен вариант построения математической модели анаэробного метаболизма пурпурной несерной бактерии, основанный на методе баланса стационарных метаболических потоков. Модель включает в себя все центральные метаболические пути бактериальной клетки, а также пути биосинтеза аминокислот и бактериохлорофилла. Показано, что результаты моделирования фотогетеротрофного роста бактерии на ацетате хорошо согласуются с экспериментальными значениями для известных потоков метаболитов, что позволяет говорить об адекватности построенной модели реальным клеточным процессам.
Ключевые слова: моделирование метаболизма, линейное программирование, метод баланса потоков, стехиометрическая модель.
УДК: 579.017.7, 51-76. PACS: 87.17.Аа.
Введение
Одной из основных целей системной биологии является реконструкция и моделирование сложных биологических систем, таких как клеточный метаболизм. Подобное моделирование включает в себя не только построение сети биохимических реакций, но и предсказание интенсивности потока метаболитов (скорости реакции) через каждую ветвь сети и поведения системы при различных внешних условиях [1].
В последние годы для характеристики распределения потоков внутри клетки успешно применяется подход, известный как метод баланса стационарных метаболических потоков (метод БСМП, Flux Balance Analysis (FBA), или Metabolic Flux Analysis (MFA)), именуемый также стехиометрическим моделированием [2-4]. В этом методе проводится линейная оптимизация распределения потоков метаболитов в стационарном состоянии при известной стехиометрии реакций. Предположение стационарности означает, что для любого метаболита скорость его наработки считается равной скорости его расхода, в итоге задача сводится к системе линейных уравнений. Поскольку обычно в метаболической сети число реакций больше числа метаболитов, система уравнений оказывается недоопре-деленной и имеет бесконечно много решений. В БСМП методом линейного программирования из пространства возможных решений выбирается одно, дающее максимум некоторой линейной комбинации потоков, которая называется целевой функцией. Выбор этой функции имеет принципиальное значение, поскольку именно она имитирует «цель» жизнедеятельности клетки. Например, часто исследователя интересует решение, соответствующее максимальной скорости роста клетки (или максимальному производству биомассы), так как при естественном отборе должны выживать самые быстрорастущие организмы [5]. Альтернативой является поиск решения, доставляющего максимум наработки энер-
гетических эквивалентов (АТР), необходимых клетке для всех видов жизнедеятельности, а не только для роста [6].
Благодаря своей простоте потоковые модели часто используются при изучении сложных метаболических систем, для которых невозможно составить подробную кинетическую модель из-за отсутствия достаточного количества данных. Такие модели помогают как объяснять известное поведение клетки [3, 4], так и исследовать возможности воздействия на ее метаболизм [7, 8].
К настоящему времени созданы потоковые модели нескольких бактериальных клеток и разработаны программные методы их построения на основе проаннотированных геномов [8].
В работе представлена потоковая модель основных метаболических путей пурпурной несерной бактерии рода Rhodobacter [9]. Исследован фотогетеротрофный рост бактерии в отсутствие кислорода. Этот тип роста особенно интересен тем, что характеризуется наработкой больших количеств бактериохлорофилла [10], а также способностью бактерии запасать полигидрокси-бутират [11] и производить молекулярный водород. Именно эта бактерия рассматривается как потенциальный производитель водородного топлива, что делает моделирование ее метаболизма особенно актуальным [12].
1. Стехиометрическая модель
Стехиометрические, или потоковые, модели обычно состоят из двух основных частей. Первая представляет собой список биохимических реакций всех включенных в модель метаболических путей. Для каждой реакции должна быть проведена проверка активности соответствующего фермента в конкретном организме. Вторая часть модели — математический алгоритм, на вход которого подается набор стехиометрических коэффициентов и граничных условий, а на выходе выдаются значения скоростей реакций.
1.1. Построение списка реакций
Анализ метаболизма начинается с рассмотрения его центральной части — гликолиза, пентозофосфатного пути, цикла трикарбоновых кислот и цикла Кальвина [13, 14]. Биохимические реакции для этих частей хорошо изучены, как и гены, кодирующие соответствующие ферменты. Список реакций основного метаболизма был получен из базы данных KEGG (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes) [15] для вида Rhodobacter sphaeroides. Одна из особенностей метаболизма бактерий рода Rhodobacter заключается в отсутствие фермента глиоксилатного пути, необходимого для усвоения ацетата, хотя ацетат является одним из субстратов роста этой бактерии. Недавно в R. sphaeroides был обнаружен обходной, этилмалониловый, путь, который еще не вошел в базу данных KEGG. Соответствующие реакции были добавлены в список по [16].
Так как рост клетки подразумевает синтез основных строительных блоков, в систему были добавлены пути синтеза всех аминокислот и отток вещества на синтез липидов. Списки реакций для этих путей были также получены из базы данных KEGG.
Кроме того, мы включили в список реакций стадии фотосинтеза, представляющие наибольший интерес при фототрофном росте бактерий. Поскольку у пурпурных бактерий фотосинтез является циклическим, а рассматриваемые процессы находятся в стационарном состоянии, мы свели его к двум реакциям — поглощению фотона и переносу протона через мембрану. За счет указанных потоков создается разность концентраций протонов на мембране, которая в рамках модели идет на синтез энергетических эквивалентов — АТР и NADH [17]. Если не лимитировать скорость фотосинтеза, то клетка будет вырабатывать неограниченное количество энергии. Однако для такого сложного процесса трудно рассчитать численные значения верхней границы скорости. По этой причине в модели предполагается, что лимитирующим фактором является количество бактериохлорофилла и каротиноидов, необходимых для поглощения света. Реакции биосинтеза каротиноидов брали из базы данных KEGG, а для бактериохлорофилла была использована база данных MetaCyc (Multiorganism Metabolic Pathway and Enzyme Database) [18].
Поскольку пурпурные бактерии обладают способностью производить водород [12] и запасать поли-гидроксибутират [11], соответствующие биохимические реакции были также добавлены в модель.
В целях упрощения большинство метаболитов, участвующих только в двух реакциях, исключались из модели, а соответствующая реакция заменялась на одну. Итоговый список содержал 257 реакций и 216 метаболитов.
1.2. Метод баланса стационарных метаболических потоков (БСМП)
Список реакций переводится в матрицу стехиомет-рических коэффициентов S размерности т х п, где т — число реакций, а п — число метаболитов в модели. Другими словами, строки матрицы S соответствуют метаболитам, а столбцы — реакциям. Закон действующих масс для системы реакций может быть записан
в виде
dx
di = Sv'
где х — вектор концентраций метаболитов, V — вектор скоростей реакций (потоков).
В стационарном приближении концентрации метаболитов постоянны, и уравнение (1) принимает вид
Sv = 0.
(2)
Это основное ограничение на систему в методе БСМП. Кроме него ограничения накладываются на скорости реакций:
аг^ог^/Зь /=1,...,ш, (3)
где постоянные а и ¡3 выводятся из известных ограничений на работу ферментов, катализирующих соответствующие реакции.
В системе биохимических реакций обычно присутствуют замкнутые циклы и альтернативные пути, поэтому число реакций оказывается больше числа метаболитов. Это означает, что число линейных уравнений в (2) меньше числа неизвестных и решения (2) образуют некоторый многоугольник в многомерном пространстве потоков. Указанное множество решений и описывает возможности метаболизма клетки.
Для моделирования конкретного метаболического режима из пространства решений выбирается одно, соответствующее экстремуму целевой функции. Последняя строится в виде линейной комбинации потоков:
üof = CV,
(4)
где с — вектор коэффициентов целевой функции.
Таким образом, в методе БСМП формулируется следующая задача линейного программирования [7]:
найти максимум о0[ = cv
■ т
^2Sijüi = О, /=!,...,«,
при условии
(5)
í=I
^ai^Vi^ßi, ¿=l,...,m.
Для численного решения задачи (5) в работе применялся стандартный симплекс-метод, реализованный в среде программирования VC++ [19].
1.3. Выбор целевой функции
Целевая функция (4) имитирует «цель» жизнедеятельности клетки, поэтому ее выбору уделяется особое внимание. Обычно при построении стехиометрических моделей максимизируется производство биомассы [3, 5, 7, 14], что на практике эквивалентно наработке метаболитов гликолиза и цикла трикарбоновых кислот в физиологических соотношениях. В этом случае остальные метаболические пути могут оказаться неактивны, поэтому такой выбор целевой функции не подходит для подробного исследования метаболизма. Например, для исследования производства лизина бактерией Escherichia coli авторам [3] пришлось дополнительно вводить целевую функцию, связанную с метаболизмом этой аминокислоты.
Реже используются целевые функции, связанные с наработкой энергетических эквивалентов [5, 8]. Хотя АТР и NADH необходимы клетке для всех видов
БИОФИЗИКА И МЕДИЦИНСКАЯ ФИЗИКА
75
жизнедеятельности, а не только для роста, эти молекулы синтезируются в единичных реакциях [6]. Данные о направлении этих реакций должны быть введены в модель явным образом, иначе моделируемая система начнет производить энергию всеми теоретически доступными способами, что не соответствует известным сведениям из физиологии клетки.
В настоящей модели в качестве целевой функции выбран фотосинтетический поток, так как, с одной стороны, он напрямую связан с производством АТР, а с другой — его скорость лимитируется количеством бактериохлорофилла и каратиноидов [17]. Кроме того, потоки, связанные с синтезом аминокислот и липидов, фиксировались в модели в физиологических соотношениях [13, 17].
По аналогии с [7, 8] для большинства потоков ограничения вида (3) в модель не вводились. Исключение было сделано для реакций синтеза АТР, направления которых были зафиксированы, и реакций цикла Кальвина, поскольку при фотогетеротрофном росте именно этот путь является узким местом метаболизма [17].
2. Тестирование модели
Экспериментальное определение скоростей реакций, идущих в живой клетке, может быть проведено с помощью изотопного анализа [20]. Однако соответствующих данных для анаэробного фототрофного метаболизма пурпурных бактерий в доступной литературе авторы не обнаружили. По этой причине тестирование модели проводилось путем сравнения известных скоростей наработки отдельных метаболитов при известной скорости поглощения субстрата.
Авторы [10] показали, что при фотогетеротрофном росте R. capsulatusm ацетате скорость наработки хлорофилла составляет 10 мг на 1 г прироста биомассы. При поступлении на вход модели 1 г ацетата выход хлорофилла составил 13 мг. Согласно [11], при фотогетеротрофном росте R. sphaeroides на ацетате максимальная скорость наработки полигидроксибутирата равна 0.03 г на 1 г прироста биомассы, а авторы [13] приводят для нее значение 0.05 г на 1 г прироста биомассы. При подаче на вход модели 1 г ацетата выход полигидроксибутирата оказался равным 16 мг. Таким образом, полученные в модели значения потоков углеродсодержащих соединений по порядку величины соответствуют экспериментальным данным. Поскольку экспериментальные значения потоков в работах разных авторов сами по себе различаются примерно на порядок, полученное соответствие мы считаем подтверждением работоспособности модели.
Заключение
В работе построена стехиометрическая модель анаэробного метаболизма фототрофной бактерии в стаци-
онарном приближении. Она включает в себя все центральные метаболические пути бактериальной клетки (гликолиз, цикл трикарбоновых кислот, пентозофос-фатный путь, цикл Кальвина), а также пути биосинтеза аминокислот, бактериохлорофилла, каратиноидов, полигидроксибутирата и водорода. Моделирование фотогетеротрофного роста бактерии на ацетате дает сравнимые с реальными значения потоков некоторых метаболитов, что позволяет говорить о применимости модели к описанию метаболизма данной бактерии.
Список используемых сокращений
АТР — Adenosine Triphosphate; NADH — Nicotinamide adenine dinucleotide; KEGG — Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes; MetaCyc — Multiorganism Metabolic Pathway and Enzyme Database.
Список литературы
1. Kitano H. 11 Science. 2002. 295. P. 1662.
2. Edwards J.S., Palsson B.O. 11 Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2000. 97, N 10. P. 5528.
3. Dien S.J. van, Iwatani S., Usuda Y., Matsui К. 11 J. Biosci. Bioeng. 2006. 102, N 1. P. 34.
4. Назипова H.H., Елъкин Ю.Е., Панюков В.В., Дроздов-Тихомиров H.H. II Матем. Биол. Биоинформ. 2007. 2, № 1. С. 98.
5. Chiu Н.С., Segrä D. 11 Genome. Inform. 2008. N 20. P. 171.
6. Gulik W.M. van, Heijnen J J. 11 Biotechnol. Bioeng. 1995. 48, N 6. P. 681.
7. Pharkya P., Burgard A.P., Maranas C.D. 11 Genome Res. 2004. 14, N 11. P. 2367.
8. Feist A.M., Herrgard M.J., Thiele I. et al. 11 Nat. Rev. Microbiol. 2009. 7, N 2. P. 129.
9. McEwan A.G. // Antonie van Leeuwenhoek. 1994. 66. P. 151.
10. Патрушева E.B., Федоров A.C., Белера B.B. 11 Прикл. биохим. и микробиол. 2007. 43, № 2. С. 208.
11. Sangkharak К., Prasertsan Р. // J. Biotechnol. 2007. 132, N 3. Р. 331.
12. Цыганков A.A. // Рос. хим. жури. 2006. L, № 6. С. 26.
13. Klamt S., Schuster S., Gilles E.D. 11 Biotechnol. Bioeng. 2002. 77, N 7. P. 734.
14. Boyle N.R., Morgan J.A. // BMC Syst. Biol. 2009. 3:4.
15. Kyoto encyclopedia of genes and genomes. http://www.genome.jp/kegg/
16. Erb T.J., Berg I.A., Brecht V. et al. // Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 2007. 104, N 25. P. 10631.
17. Современная микробиология. Прокариоты / Под ред. Й. Ленгелера, Г. Древса, Г. Шлегеля. М., 2005.
18. Multiorganism metabolic pathway and enzyme database. http://biocyc.org/
19. GLPK (GNU linear programming kit), http://www.gnu.org /software/glpk/
20. Fuhrer Т., Sauer U. // J. Bacteriol. 2009. 191, N 7. P. 2112.
Mathematical modeling of bacterial metabolism A.N. Golomysova1 0 , M. Gomelsky2, P. S. Ivanov1
1 Department of Biophysics, Faculty of Physics, M. V. Lomonosov Moscow State University, Moscow 119991, Russia.
2Department of Molecular Biology, 1000 E. University Ave., Dept. 3944, University of Wyoming, Laramie,
WY 82071, USA.
E-mail: a agolomy@yandex.ru.
A reconstruction of bacterial cell metabolism is presented. The model is based on Flux Balance Analysis. It includes all central metabolic pathways as well as pathways for biosynthesis of amino acids, chlorophyll and carotenoids. Metabolic fluxes of the bacterial growth on acetate predicted by the model proved to be in good agreement with experimental data. Therefore, the proposed model appears to adequately capture metabolic processes in phototrophic bacteria.
Keywords: metabolic modeling, linear programming, flux balance analysis, stoichiometric model.
PACS: 87.17.Aa.
Received 25 December 2009.
English version: Moscow University Physics Bulletin 3(2010).
Сведения об авторах
1. Голомысова Анастасия Никитична — аспирантка; e-mail: agolorny@yandex.ru.
2. Гомельский Марк — канд. биол. наук, профессор; e-mail: gomelsky@uwyo.edu.
3. Иванов Павел Сергеевич — канд. физ.-мат. наук, ст. науч. сотр.; тел.: (495) 939-30-25, e-mail: psmart@rambler.ru.
