CC BY
30
МИКРОБИОЛОГИЯ
УДК.579.253+579.812.11
ЗНАЧЕНИЕ ГЕТЕРОГЕННОСТИ ПОПУЛЯЦИИ БАКТЕРИЙ, СОЗДАВАЕМОЙ ПРОЦЕССОМ ДИССОЦИАЦИИ, ДЛЯ РОСТА ПУРПУРНЫХ
ФОТОСИНТЕЗИРУЮЩИХ БАКТЕРИЙ В ЕСТЕСТВЕННЫХ МЕСТАХ ИХ ОБИТАНИЯ
Е.С. Милько1*, Е.Н. Красильникова1, Д.М. Милько2
1 Кафедра микробиологии, биологический факультет, Московский государственный университет имени М.В. Ломоносова;
Россия, 119234, г. Москва, Ленинские горы, д. 1, стр. 12;
2 Институт географии, РАН; Россия, 119017, г. Москва, Старомонетный переулок, д. 29
*e-mail: esmilko@mail.ru
Впервые из популяции пурпурной фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter capsulatus получены Я- и М-диссоцианты, изучен их рост при разных условиях освещенности и аэрации. Аналогичные опыты ранее проводили с Я- и М-диссоциантами Rhb. shaeroides. Физиолого-биохимические различия близких видов бактерий коррелируют с особенностями их естественных мест обитания: Rhb. sphаeroides, выделенный из почвы, обладает низкой скоростью роста и способностью его М-диссоцианта расти в аэробных условиях в темноте, что дает этому виду преимущества при обитании в ограниченном и гетерогенном пространстве. Быстрорастущий Rhb. capsulatus, выделенный из воды, лучше приспособливается к обитанию в свободном пространстве.
Ключевые слова: фотосинтезирующие бактерии, возобновление роста, диссоциация, бактериохлорофилл, экзопротеиназы, выживаемость.
Диссоциация — это расщепление однородной популяции бактерий на варианты, различающиеся генетическими, физиолого-биохимическими и морфологическими свойствами. Возникновение дис-социантов в популяции и их реверсия происходят с частотой 10-2—10-5 на одно клеточное деление. Биологическое значение диссоциации — адаптация бактерий к изменениям в окружающей среде. Популяция бактерий всегда содержит то или иное количество диссоциантов, которое зависит от фазы развития [1] и условий культивирования [2], доминирует диссоциант, более приспособленный к данным условиям роста.
Нами впервые установлена способность пурпурной фотосинтезирующей бактерии Rhodobacter sphaeroides, выделенной из почвы, расщепляться на Я- и М-диссоцианты. Методом ПЦР их генов 168 рРНК установлена принадлежность Я- и М-дис-социантов к исходному штамму. Диссоцианты различаются морфологией колоний и устойчивостью к действию ряда физических и химических факторов [3], содержанием бактериохлорофилла (Бхл) и экзопротеиназ в клетках, особенностями дыхательной цепи [4].
Целью настоящей работы является получение диссоциантов другого вида того же рода пурпурной фотосинтезирующей бактерии — ШЬ. capsulatus В10, выделенного из воды, изучение их молекулярных, физиолого-биохимических и морфологических свойств и сравнение этих свойств с аналогичными свойствами Я- и М-диссоциантов ШЬ. sphaeroides.
Материалы и методы
Объектами исследований являются фотосинтезирующие пурпурные бактерии Rhodobacter capcula-Шз В10 и ШЬ. sphaeroides 2Я из коллекции культур кафедры микробиологии. Бактерии выращивали в люминостате при 30°С на среде Ормерода [5] в присутствии 0,2% малата во флаконах, доверху заполненных средой (анаэробные условия), и в колбах на 250 мл с 50 мл среды на качалке при 250 об/мин (аэробные условия). Число жизнеспособных клеток и соотношение диссоциантов в популяции определяли подсчетом колониеобразующих единиц (КОЕ) на агаризованной среде (мясопептонный бульон и сусло, 1:1). При проведении полимеразной цепной реакции фрагментов генов 168 рРНК была использована система универсальных праймеров [6]. Общую внеклеточную протеолитическую активность определяли модифицированным методом Ансона [7]. За единицу протеолитической активности принимали такое количество фермента (в мл), которое за одну минуту высвобождает 1 мкг тирозина. Бхл определяли при 765 нм после его экстракции из целых клеток смесью ацетона и метанола в соотношении 7:2 [8]. В таблице и графиках представлены средние данные из трех опытов.
Результаты и обсужднние
Выделение диссоциантов. При рассеве трехсуточных культур ЕНЬ. capculatus на плотной среде вырастали колонии двух типов. В большинстве случаев это были колонии темно-красного цвета,
выпуклые, матовые, диаметром 3—3,5 мм (рис. 1, А). Кроме этого, обнаружены более мелкие колонии розового цвета, гладкие, блестящие, диаметром 1 мм (рис. 1, Б), в проходящем свете вокруг них видна бесцветная каемка капсульного материала (рис. 1, В).
ПЦР генов 16SрРНК. Для подтверждения принадлежности выделенного диссоцианта и исходного штамма Rhb. capsulatus B10 к одному виду была проведена полимеразная цепная реакция фрагментов их генов 16S рРНК (табл. 1). Последовательности генов 16S рРНК исходного штамма и выделенного диссоцианта идентичны между собой — 100% гомологии. На основании морфологических и молекулярных исследований исходный штамм идентифицировали как R-диссоциант, а вновь выделенный — как М-диссоциант.
Влияние освещенности и аэрации на рост и состав популяции диссоциантов Rhb. capsulatus. Диссоциация складывается из двух процессов: возникновения диссоциантов в результате изменений в геноме клетки и селекции возникших вариантов под возА #// МШ I
Рис. 1. Колонии К- и М-диссоциантов ЯНЬ. сареыЫыу. А — колонии К-диссоцианта, Б — колонии М-диссоцианта, В — колонии М-диссоцианта в проходящем свете
действием внешних факторов [2]. Сравнивали влияние на рост диссоциантов и состав их популяции наиболее важных для фотосинтезирующих бактерий физических факторов — света и аэрации. Бактерии выращивали в анаэробных условиях на свету или в аэробных условиях на свету и в темноте.
Наибольший рост клеток К-диссоцианта наблюдается в анаэробных условиях на свету (рис. 2, А1). Клетки обладают большой скоростью роста, поэтому их максимальная концентрация (9-109 клеток в 1 мл) достигается уже в первые сут культивирования. Ко вторым сут роста происходит лизис части клеток К-диссоцианта. Со вторых до третьих сут культивирования общее количество клеток не меняется, но происходит изменение соотношения диссоциантов в популяции, и к третьим сут количество возникших клеток М-диссоцианта составляет уже 10%. К четвертым сут рост бактерий возобновляется, и в популяции преобладающим становится М-диссоциант — 62%. Преимущество М-клеток обусловлено наличием у них более высокой лити-ческой активности, которая позволяет лизировать часть клеток К-диссоцианта — активность экзо-протеиназ М-клеток составляет 6,2 ед./мл, а К-кле-ток — 3 ед./мл.
Клетки М-диссоцианта (рис. 2, А2) обладают меньшей скоростью роста, чем клетки К-диссоци-анта: максимальное количество бактерий на свету в анаэробных условиях достигается только к третьим сут культивирования, и оно в два раза ниже, чем у К-диссоцианта. Это связано, вероятно, с меньшим содержанием в их клетках Бхл: количество Бхл составляет в клетках К-диссоцианта 31,6 мкг/мг белка, а в клетках М-диссоцианта — 20,4 мкг/мг белка. На третьи сут культивирования в популяции появляются быстрорастущие клетки К-диссоцианта, доля которых к четвертым сут увеличивается до 37%.
При аэрации на свету (рис. 2, Б1) рост клеток К-диссоцианта в первые сут мало меняется по сравнению со стационарной культурой (рис. 2, А1). Начиная со вторых сут происходит лизис части бактерий, и концентрация клеток постепенно снижается к концу культивирования до 5-108 клеток в 1 мл. Колонии М-диссоцианта выявляются на третьи сут, к концу культивирования их доля в популяции возрастает до 40%. За наблюдаемый период рост не возобновляется.
Рост М-диссоцианта на свету при аэрации (рис. 2, Б2) ускоряется, наблюдается снижение количества образованных клеток. На вторые сут роста в популяции начали выявляться быстрорастущие К-клетки, которые к третьим сут становятся доминирующими.
При аэрации в темноте (рис. 2, В1) рост К-дис-социанта резко снижается, при этом популяция на 90% замещается М-клетками. Рост М-диссоцианта (рис. 2, В2) снижается уже ко вторым сут культивирования, в популяции обнаруживаются К-клетки.
Сравнение влияния освещенности и аэрации на рост и состав популяции R- и М-диссоциантов Rhb. sphaeroides и Rhb. capsulatus. В табл. 2 приведены
Таблица 1
Сравнение последовательностей генов 16S рРНК выделенного диссоцианта, исходного штамма Rhb. capsulatus
и типового штамма Rhb. сapsulatus NR029215
Seq
Rhb. capsulatus Ш029215
Исходный штамм Rhb. capsulatus
Выделенный диссоциант
Rhb. capsulatus ^029215
1D
99,9%
99,9%
Исходный штамм ^Ь. capsulatus
99,9%
1D
100%
Выделенный диссоциант
99,9%
100%
1D
Рис. 2. Влияние освещенности и аэрации на рост и состав популяции Я-диссоцивнтов (1) и М-диссоциантов (2) Rhb. capsulatus: в анаэробных условиях на свету — А; в аэробных условиях на свету — Б; в аэробных условиях в темноте — В. Количество (%)
в популяции клеток Я-диссоцианта — 1*, М-диссоцианта — 2*
данные для сравнения роста и изменения соотношений Я- и М-диссоциантов в популяции ШЬ. capsulatus и изученного ранее ШЬ. sphаeroides [3, 4] при различных режимах освещения и аэрации.
Во всех сериях опытов клетки Я- и М-диссоциантов ШЬ. capsulatus обладают большей скоростью роста и образуют на порядок больше клеток,
чем соответствующие диссоцианты ШЬ. sphаeroides. Это объясняется более высоким содержанием Бхл в клетках ШЬ. capsulatus по сравнению с ШЬ. sphаeroides: у Я-диссоциантов — в 2,5 раза, у М-диссоцианта — в 5,7 раз.
При всех условиях культивирования за 4 сут состав популяций медленнорастущих клеток Я- и
Таблица 2
Сравнение физиолого-биохимических свойств R- и М-диссоциантов Rhb. capsulatus и Rhb. sphaeroides
Свойства Rhb. capsulatus Rhb. sphaeroides Ссылки
R-диссоциант М-диссоциант R-диссоциант М-диссоциант
Максимальная концентрация клеток (рост в анаэробных условиях на свету), клетки/мл 90-109 50-109 39-108 28-108 [3,4]
Достижение максимального количества клеток, время культивирования, сут 1 3 2 3 [3]
Количество диссоциантов, возникших на четвертые сут роста в анаэробных условиях на свету, % 43 (М-диссо-цианты) 37 (R-диссо-цианты) 0 0 [3]
Содержание бактериохлорофилла, мкг/мг белка 31,6 20,4 12,7 3,6 [4]
Возобновление роста в анаэробных условиях на свету: — время культивирования, сут — количество возникших клеток М-диссоцианта, % 4 43 нет возобновления роста 26 20 нет возобновления роста [1]
Экзопротеиназы, ед./мл 6,2 3,0 4,0 2,1 [1]
Максимальная концентрация клеток (рост в аэробных условиях на свету), клетки/мл 70-109 20-109 43-108 23-108 [3]
Концентрация клеток (рост в аэробных условиях в темноте) на вторые сут культивирования, клетки/мл 12-109 2-109 5-108 20-108 [3]
М-диссоциантов ЯНЬ. spheroides, в отличие от ЯНЬ. capsulatus, не меняется.
Возобновление роста на четвертые сут культивирования наблюдается только у самого быстрорастущего из 4-х диссоциантов — Я-диссоцианта ЯНЬ. capsulatus после предварительного лизиса части клеток и увеличении доли М-диссоцианта в популяции. У Я-диссоцианта ЯНЬ. sphаeroides периодическое возобновление роста начинается только с 26-х суток периодического культивирования без дополнительного внесения питательных веществ после предварительного лизиса части клеток и увеличения доли М-диссоцианта в популяции, т.е. только после более позднего исчерпания биогенов из среды [1].
На свету при аэрации рост и М-диссоциантов обоих видов бактерий ускоряется по сравнению с анаэробными культурами. Количество клеток, образованных М-диссоциантами по сравнению с Я-диссоциантами, меньше у ЯНЬ. capsulatus в 3 раза, у янь. sphаeroides — в 2 раза.
Количество клеток, образованных в темноте при аэрации по сравнению со световыми аэробными культурами, на вторые сут культивирования снижается: у Я-диссоцианта ЯНЬ. capsulatus — в 6 раз, у М-диссоцианта ЯНЬ. capsulatus — в 10 раз, у Я-дис-социанта ЯНЬ. sphаeroides — в 9 раз, т.е. все эти культуры приспособлены к жизни в фотогетеротрофных условиях. У М-диссоцианта ЯНЬ. sphаeroi-des при аэрации рост одинаковый на свету и в темноте. Это связано с тем, что в дыхательной цепи
переноса электронов М-диссоцианта Rhb. sphaeroides присутствует цитохром aa3, выполняющий функцию цитохрома с оксидазы [4], что дает ему возможность расти в аэробных органотрофных условиях.
Таким образом, физиолого-биохимические различия двух близких видов фотосинтезирующих бактерий коррелируют с особенностями их естественных мест обитания: Rhb. sphaeroides, выделенный из почвы, обладает низкой скоростью роста и способностью расти на свету и в темноте, что дает ему преимущества при обитании в ограниченном и гетерогенном пространстве. Быстрорастущий Rhb. capsulatus, выделенный из воды, более приспособлен к обитанию в свободном пространстве.
При исчерпании питательных ресурсов наблюдается поочередный рост R-диссоциантов, обладающих большей скоростью роста и меньшей про-теолитической активностью, и М-диссоциантов, обладающих меньшей скоростью роста и повышенной активностью экзопротеиназ. Это приводит к периодическому лизису клеток и последующему возобновлению роста бактерий, а в целом — к увеличению выживаемости всей популяции данного штамма. Аналогичные закономерности возобновления роста и изменения состава популяции обнаружены при длительном периодическом культивировании без дополнительного внесения биогенов для S- и М-диссоциантов Pseudomonas aeruginosa [9] и Escherichia coli [10].
При физических или химических условиях, неблагоприятных для существования данного вида,
возобновления роста не происходит, например, при культивировании диссоциантов Rhb. capsulatus в темноте.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Milko E.S., Milko D.M. The process of bacterial population splitting into dissociants and long-term batch cultivation of bacteria // Арр1 Biochem. Mikrobiol. 2014. Vol. 50. N 4. P. 368-373.
2. Милько Е.С., Егоров Н.С. Гетерогенность популяции бактерий и процесс диссоциации. М.: Изд-во Моск. ун-та, 2011. 111 с.
3. Ivanovskii R.N., Mil'ko E.S., Mil'ko D.M. Isolation of the phase variants of the purple photosynthetic bacterium Rhodobacter sphaeroides and investigation of their molecular, physiological, biochemical, and morphological characteristics // Microbiology (Mosc.). 2013. Vol. 82. N 2. P. 169-174.
5. Mil'ko E.S., Krasil'nikova E.N., Keppen O.I., Lebede-va N.V., Ivanovsky R.N. Metabolism of the phase variants of the phototrophic bacterium Rhodobacter sphaeroides // Microbiology (Mosc.). 2014. Vol. 83. N 4. P. 322-325.
5. Кондратьева Е.Н. Фототрофные бактерии. М.: Изд-во Акад. Наук СССР, 1963. 315 с.
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект № 14-04-01873).
6. Nucleic acid techniques in bacterial systematics. Chichester: John Wiley and Sons, Ltd., 1991. 329 рр.
7. Hagihara B, Matsubara H., Nakai M., Okunuki K. Crystalline bacterial proteinase. I. Preparation of crystalline proteinase of Bacillus subtilis // J. Biochem. 1958. \Ы. 45. N 3. P. 185-194.
8. Cohen-Bazire G., Sistrom W.R., Stanier R.Y. Kinetic studies of pigment synthesis by non-sulfur purple bacteria // J. Cell. Physiol. 1957. Vol. 49. N 1. P. 25-32.
9. Mil'ko E.S., Kreier V.G., Egorov N.S., Loiko N.G., Golod N.A. Development and population structure of mixed (S + M) Pseudomonas aeruginosa cultures in the late stationary growth phase // Microbiology (Mosc.). 2008. Vol. 77. N 3. P. 275-280.
10. Fincel S.E. Long-term survival during stationary phase evolution and the GASP-phenotype // Nat. Rev Microbiol. 2006. Vol. 4. N 2. P. 113-120.
Поступила в редакцию 09.03.2016 г. Принята в печать 18.05.2016 г.
MICROBIOLOGY
THE VALUE OF HETEROGENEITY OF BACTERIA POPULATION, CREATED BY THE PROCESS OF DISSOCIATION, FOR THE GROWTH OF PURPLE PHOTOSYNTHETIC BACTERIA IN THEIR NATURAL HABITAT
E.S. Milko1'*, E.N. Krasilnikova1, D.M. Milko2
Department of Microbiology, School of Biology, Lomonosov Moscow State University, Leninskiye gory 1—12, Moscow, 119234, Russia *e-mail: esmilko@mail.ru
For the first time R- and M-dissociants were isolated from the population of purple phototrophic bacterium Rhodobacter capsulatus, their growth under different luminance and aeration conditions was studied. Earlier, similar experiments were conducted with R- and M-dissociants of Rhodobacter sphaeroides. The physiological-biochemical differences of connatural bacterial species correlate with the distinctions of their inhabitation: Rhb.spheroides isolated from the soil is characterized by low speed of growth along with the ability to grow in dark and aerobiotic places demonstrated only by M-dissociant, which offers this specie an advantage in adaptation for limited and heterogeneity space. Being extracted from the water, rapidly growing Rhb. capsulatus is better adapted for habitation at a free space.
Keywords: photosynthethic bacteria, resumption of growth, dissociation, bacteriochlorophyll, exoproteinase, survive
Сведения об авторах:
Милько Елена Серафимовна — канд. биол. наук., ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-45-45; e-mail: esmilko@mail.ru
Красильникова Елена Николаевка — канд. биол. наук., ст. науч. сотр. кафедры микробиологии биологического факультета МГУ. Тел.: 8-495-939-42-03; e-mail: mguru@mail.ru
Милько Денис Михайлович — канд. географ. наук., науч. сотр. Института географии РАН. Тел.: 8-495-959-00-16; e-mail:d0@mail.ru
