CC BY
36
масштабирование технологии получения липосомальной формы тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия и изучение ее мутагенных и иммунотоксических свойств
A.B. Ланцова, Л.Л. николаева, н.А. Оборотова, Е.В. Санарова, О.Л. Орлова, н.В. Голубцова, A.A. рудакова, З.А. Соколова, К.и. Кирсанов, Е.А. Лесовая, Л.р. Тилова
ФГБУ«НМИЦонкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Людмила Леонидовна Николаева [email protected]
Введение. Применение липосом в качестве систем доставки лекарственных средств в организм человека сегодня является признанным подходом к повышению эффективности лечения. По сравнению с другими наноразмерными носителями липосомы отличаются высокой биосовместимостью. Однако в литературных источниках имеется ряд данных об иммуногенности некоторых липосомальных препаратов. Проявления реакции гиперчувствительности средней и тяжелой степени отмечены у части пациентов при внутривенном введении липосом Doxil®, Ambisome®, DaunoXome®. Технология производства липосом — достаточно трудоемкий процесс, поэтому получение липосомальных лекарственных форм (ЛЛФ) в промышленных масштабах для проведения доклинических и клинических исследований проблематично для исследователей и производителей всего мира. В связи с этим актуальным представляется проведение исследований специфической токсичности липосомальных препаратов и масштабирования технологии получения липосом.
Цель исследования — оценка качества опытных образцов ЛЛФ на основе тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюми-ния, полученных по масштабированной технологии, в сравнении с образцами, произведенными в лабораторных условиях, а также изучение их мутагенных и иммунотоксических свойств.
Объект исследования — тетра-3-фенилтиофталоцианин гидроксиалюминия липосомальный, лиофилизат для приготовления раствора для инъекций 1,5 мг, во флаконах вместимостью 20мл.
Материалы и методы. В работе использовались метод Бенгема, экструзия, стерилизующая фильтрация, лиофилизация; тест на нарушение целостности межклеточных контактов (на промоторную активность), бактериальный тест Эймса, цитогенетическое исследование по учету хромосомных аберраций, тест на способность вызывать повреждение ДНК (тест ДНК-комет), метод Ерне;реакция гиперчувствительности замедленного типа, определение массы и клеточности центральных и периферических органов иммунитета, оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Результаты. По результатам проведенных исследований масштабирована технология получения ЛЛФ, позволяющая получать до 400 флаконов ЛЛФ за один производственный цикл. Установлено, что ЛЛФ в дозах 6 и 24 мг/кг не увеличивает количество хромосомных аномалий у мышей и не вызывает повреждений ДНК, в дозах 1,1—22,0 мкг/чашка не проявляет мутагенной активности в бактериальном тесте Эймса, в диапазоне концентраций 0,062—3,1 мкг в тесте на промоторную активность не разобщает межклеточные контакты. Определено, что ЛЛФ в дозах 6 и 12 мг/кг при 1-кратном внутривенном введении не оказывает влияния на гуморальный и клеточный иммунные ответы, не изменяет массу и клеточность центральных и периферических органов иммунной системы. ЛЛФ через 24 ч после введения в дозах 6 и 12 мг/кг дозозависимо снижает фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов, которая восстанавливается через 7 сут.
Заключение. Масштабирована технология получения ЛЛФ. В исследуемых дозах установлено отсутствие у ЛЛФ способности промотировать процесс канцерогенеза и влиять на гуморальный и клеточный иммунные ответы.
Ключевые слова: липосомальная лекарственная форма тетра-3-фенилтиофталоцианина гидроксиалюминия, масштабирование производства, мутагенные свойства, иммунотоксичность
DOI: 10.17650/1726-9784-2018-17-1-83-94
SCALING OF THE TECHNOLOGY OF OBTAINING THE HYDROXYALUMINIUM TETRA-3-PHENYLTHIO-PHTHALOCYANINE liposomal FORM And STuDYING ITS MuTAGENIC And IMMuNOTOXIC PROPERTIES
A. V. Lantsova, L.L. Nikolaeva, N.A. Oborotova, E. V. Sanarova, O.L. Orlova, N. V. Golubtsova, A.A. Rudakova, Z.A. Sokolova, K.I. Kirsanov, E.A. Lesovaya, L.R. Tilova
N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Background. The use of liposomes as drug delivery systems today is a recognized approach to improving the effectiveness of treatment. Compared with other nanosized carriers, liposomes are highly biocompatible. However, in the literature, there are a number of data on the immunogenicity of some liposomal drugs. Hypersensitivity reactions of moderate to .severe severity were noted in some patients with intravenous administration of liposomes Doxil®, Ambisome®, DaunoXome®. The technology of production of liposomes is a laborious process and obtaining liposomal forms on an industrial scale is problematic for researchers and manufacturers around the world. In connection with this, studies on the scaling up of technology for obtaining liposomes and studying the specific toxicity of liposomal preparations are relevant.
Objective — evaluation of the quality of prototypes of liposomal dosage form based on tetra-3-phenylthiophthalocyanine hydroxyalumi-num obtained by scaled technology in comparison with samples produced in laboratory conditions, as well as studying their mutagenic and immunotoxic properties.
Object of the study — tetra-3-phenylthiophthalocyanine hydroxyaluminum liposomal, lyophilizate for the preparation of injection for injection of 1,5 mg, in bottles with a capacity of 20 ml (LLF).
Materials and methods. Bengem's method, extrusion, sterilizing filtration, lyophilization, intercellular contact integrity test (for promoter activity), Ames bacterial test, cytogenetic study of chromosomal aberrations, DNA damage test (DNA comet test), Erne method; hypersensitivity reaction of delayed type, determination of mass and cellness of central and peripheral immunity organs, evaluation of phagocytic activity of peritoneal macrophages.
Results. Based on the results of the research, the LLF production technology is scaled, which allows obtaining up to 400 LLF flasks per production cycle. It has been established that LLF at doses of 6 and 24 mg/kg does not cause an increase in the number of chromosomal abnormalities in mice and does not cause DNA damage, in doses of 1,1—22,0 ^g/dish LLF does not show mutagenic activity in the Ames bacterial test, in the range concentrations of 0,062—3,1 ^g in the test for promoter activity does not separate intercellular contacts. It is determined that in doses of 6 and 12 mg/kg, LLF does not affect humoral and cellular immunity, does not change the mass and cellularity of the central and peripheral organs of the immune system. LLF, 24 hours after administration at doses of 6 and 12 mg/kg, dose-dependently decreases the phagocytic activity of peritoneal macrophages, which is restored after 7 days.
Conclusion. The technology of LLF production is scaled. In the doses studied, it was found that LLF does not have the ability to promote the process of carcinogenesis and the lack of influence on the humoral and cellular immune response.
Key words: hydroxyaluminium tetra-3-phenylthiophthalocyanine liposomal form, production scaling, mutagenic properties, immunotoxicity
Введение
Применение липосом в качестве систем доставки лекарств в организм человека сегодня является признанным подходом к повышению эффективности лечения, особенно в онкологической практике. В основе эффекта накопления (пассивного транспорта) частиц размером 50—150 нм в опухолях лежит дефектная архитектура образующейся de novo сосудистой системы — явление повышенной проницаемости капилляров и нарушенного лимфатического дренажа [1].
В НИИ ЭДиТО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России разрабатываются липосомальные препараты, получаемые методом включения активной субстанции в состав липидного бислоя. К преимуществам такого подхода в сравнении с инкапсулированием во внутренний объем относят возможность создания наносистем с приемлемой емкостью загрузки для широкого спектра веществ (в частности, для гидрофобных), уменьшение потерь препарата в кровотоке и при слиянии с клеткой, упрощение самой процедуры получения липосом, а также облегчение их внутриклеточной разгрузки за счет прямого трансмембранного переноса лекарства.
Наносистемы способны уменьшить токсичность химиотерапевтических средств с узким терапевтическим индексом, однако ряд данных in vivo и in vitro исследований показывает, что определенные типы
наночастиц обладают цитотоксичностью, вызывают аллергические и воспалительные реакции, приводят к оксидативному стрессу, повреждению ДНК и фиброзу [2—4].
Проявления реакции гиперчувствительности средней и тяжелой степеней отмечены у части пациентов при внутривенном введении липосом Doxil®, Ambisome®, DaunoХome® [5]. Такие реакции связаны с активацией липосомами системы комплемента. В связи с этим насущной проблемой представляются исследования по изучению специфической токсичности липосомальных препаратов.
При расширенном доклиническом и клиническом изучении препаратов возникает необходимость в масштабировании производства, а также пересмотре и усовершенствовании имеющейся технологии с целью увеличения выхода продукции и сокращения потерь сырья и материалов. В нормативных документах масштабирование в основном определяется как увеличение объема серий продукции от лабораторного до промышленного и предполагает использование более производительного оборудования и технологического процесса, параметры которого будут соответствовать этому оборудованию и его производительности.
Технология получения липосомальных форм лекарственных препаратов — достаточно трудоемкий процесс, поэтому получение липосом в промышленных
масштабах проблематично для исследователей и производителей всего мира.
В связи с этим на сегодняшний день проведение исследований масштабирования технологии производства и специфической токсичности нового препарата является актуальной задачей.
На базе лаборатории разработки лекарственных форм НИИ ЭДиТО ФГБУ «НМИЦ онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России проведено масштабирование технологии производства липосомаль-ной лекарственной формы (ЛЛФ) тетра-3-фенилтио-фталоцианина гидроксиалюминия 1,5 мг путем замены некоторого лабораторного оборудования на полупромышленные установки.
Цель исследования — оценка качества опытных образцов ЛЛФ, полученных по масштабированной технологии, в сравнении с образцами, произведенными в лабораторных условиях, а также изучение мутагенных и иммунотоксических свойств.
Материалы и методы
реактивы для получения липосом: тетра-3-фенил-тиофталоцианин гидроксиалюминия (ТФГА) (ФГУП «ГНЦ «НИОПИК», Россия), яичный лецитин (Lipoid GmbH, Германия), PEG-2000-DSPE 18:0 (Lipoid GmbH, Германия), холестерин (Lipoid GmbH, Германия), сахароза («Химмед», Россия), хлороформ, стабилизированный 0,6—1,0 % массовой долей этанола ТУ 2631-001-29483781-04 изм. 1,2 («Химмед», Россия), вода для инъекций ФС.2.2.0019.15, спирт этиловый 95 % ФС.2.1.0036.15 (ЗАО «Брынцалов-А», Ферейн, Россия).
материалы для фильтрации: нейлоновые мембранные фильтры N66, имеющие диаметр 25 и 90 мм и размер пор 0,22; 0,45 и 1,2 мкм (ООО «Палл Евразия», Россия), фильтрационная система Stericup GP Millipore Express Plus с полиэфирсульфоновыми фильтрами, имеющими размер пор 0,22 мкм (Merck Millipore, США).
реактивы для исследования мутагенных свойств: Hoechst 33258 (Sigma-Aldrich, США), OxiSelect™ Comet Assay Kit (Cell Biolabs, Сан-Диего, Калифония, США), 2-аминофлуорен (2-АФ) (Sigma, США), бенза-пирен (Fluka, Англия), гентамицин («ПанЭко», Россия), глюкозо-6-фосфат (Reanal, Венгрия), 4-(2-гидрокси-этил)-1-пиперазинэтансульфоновая кислота («ПанЭко», Россия), 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен (ДДДТДП) («Реахим», Россия), диметилсульфоксид («ПанЭко», Россия), ди-тиотрейтол (Amresko, США), дрожжевой экстракт («ПанЭко», Россия), калия гидроксид («Химмед», Россия), калия хлорид («Химмед», Россия), люцифер желтый, литиевая соль (Invitrogen, США), лития хлорид дигидрат («Химмед», Россия), магния хлорид («Химмед», Россия), метиловый спирт («Химмед»,
Россия), никотинамидадениндинуклеотидфосфат (Sigma, США), натрия ацетат («Химмед», Россия), натрия хлорид («Химмед», Россия), оксоплатин (Lache-ma, Чехия), параформальдегид («Химмед», Россия), пируват натрия («ПанЭко», Россия), 12-О-тетраде-каноилфорбол-13-ацетат (ТРА) (Invitrogen, США), уксусная кислота («Химмед», Россия), этилендиа-минтетрауксусная кислота, динатриевая соль (Sigma, США), спирт этиловый 95 % (ФС.2.1.0036.15), фосфатно-солевой буфер (Flow Laboratories, Англия), цисплатин (Lachema, Чехия).
реактивы для исследования иммунотоксичности: этиловый спирт 95 % (ФС.2.1.0036.15), фосфатно-солевой буфер («ПанЭко», Россия), питательная среда 199 («ПанЭко», Россия), уксусная кислота («Химмед», Россия), вода для инъекций (ФС.2.2.0019.15), раствор Хэнкса («ПанЭко», Россия), агароза (Helicon, Россия), комплемент морской свинки сухой («Щелковский Биокомбинат», Россия), овальбумин (Sigma Aldrich, США), синий Эванса (Panreac, Испания), коллоидная тушь («Гамма», Россия).
Оборудование: весы Sartorius LA 1200 S (Sartorius AG, Германия), роторный испаритель Rotavapor R200 (Büchi, Швейцария) с колбой на 2 л, роторный испаритель Heidolph Laborota 20 control safety с отгонной колбой на 20 л (Heidolph, Германия), экструдеры Lipex™ Thermobarrel Extruder на 100 и 800 мл (Northern Lipids Inc., Канада), ультразвуковая ванна Transsonic T310 (Elma, Германия), моечно-дезинфекционная машина Lancer 1400 UP DIN (Lancer, Франция), стерилизатор сухожаровой Binder ED (Binder, Германия), низкотемпературная камера NZ 280/75.A (Frigera, Чехия), сублимационная сушка Minifast DO.2 (Edwards, Великобритания), сублимационная сушка Edwards Minifast D0.10 (Ero Electronic S.p.A., Италия), полуавтомат ПЗР-34-ВИПС-МЕД для укупорки флаконов (ООО «Фирма «ВИПС-МЕД», Россия), наносайзер Nicomp 380 Submicron Particle Sizer (Particle Sizing Systems, США), спектрофотометр Cary 100 (Varian, Ina, Австралия), микроскоп марки Leica, модель TCS SP5 Mid System, анализатор Anthos2020, камера морозильная теплоизолированная (модель КТС-УОМЗ 1809М/04МО).
лабораторные животные: крысы линии Вистар, мыши линии C57Bl/6 массой тела 20—22 г из разведения ФГБУ «НМИЦ онкологии им. H.H. Блохина» Минздрава России, мыши-самки линии (СВА х С57BL/6)F1 возраста 6—8 нед массой тела 18—22 г, полученные из филиала питомника «Столбовая» ФГБУН «Научный центр биомедицинских технологий Федерального медико-биологического агентства». Животных содержали в виварии ФГБУ «НМИЦ онкологии им. H.H. Блохина» Минздрава России с естественным освещением на брикетированном корме и постоянном доступе к воде.
клеточные линии. В работе использовали линию иммортализованных клеток печени крысы IAR-2. Клетки культивировали в стандартной среде DMEM, содержащей 5 % эмбриональную сыворотку телят (РАА, Австрия) и гентамицин (50 ед/мл), при 37 °С и 5 % СО2.
оценка промоторной активности. Исследование промоторной активности проводили с применением теста на угнетение метаболической кооперации, при этом определяли целостность межклеточных контактов, наблюдая за перетеканием люминесцентного индикатора между клетками в монослое [6—8].
Опыты проводили на иммортализованных клетках печени крысы IAR-2, ЛЛФ исследовали в 4 концентрациях — 3,1; 0,62; 0,31 и 0,062 мкг/мл, в качестве отрицательного контроля использовали дистиллированную воду, в качестве положительного контроля вводили ТРА в концентрации 5 нг/мл.
Проведение теста по оценке промоторной активности. Клетки рассевали на 6-луночные планшеты в количестве 200 тыс. клеток на лунку, перед посевом клеток на дно каждой лунки помещали предварительно простерилизованное покровное стекло. Через 24 ч после посева к клеткам добавляли ЛЛФ и инкубировали в течение 72 ч. За 2 ч до проведения эксперимента клетки, служащие положительным контролем, обрабатывали TPA в концентрации 1 нг/мл. После окончания инкубации клетки 2 раза отмывали фосфатно-солевым буфером, покрывали раствором люминесцентного индикатора и наносили на монослой клеток 3 параллельных и 1 перпендикулярную царапины хирургическим скальпелем. Затем клетки инкубировали 2 мин при 37 °С во влажной атмосфере без доступа света, 3 раза отмывали фосфатно-соле-вым буфером в течение 1 мин при комнатной температуре. После промывки клетки покрывали фиксирующим раствором и инкубировали в течение 30 мин при комнатной температуре. Стекла переносили из лунок на предметные стекла и исследовали на флуоресцентном микроскопе Zeiss с фотонасадкой (Axio-plan 2 imaging) с использованием фильтра для FITC-флуоресценции и при увеличении 400.
критерии оценки промоторной активности. Для каждой исследуемой дозы соединения делали 10 независимых снимков области монослоя клеток, прилегающих к линии царапины. Для каждого снимка определяли порядок клетки, несущей флуоресцентный краситель. Разобщение межклеточных контактов определяли как отношение среднего числа слоев клеток с красителем для каждой концентрации исследуемого препарата к среднему числу слоев клеток с красителем, обработанных растворителем.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием t-критерия Стьюдента для определения М ± m, где М — среднее значение, m — стан-
дартная ошибка среднего, с помощью пакета программ Microsoft Excel.
Бактериальный тест на мутагенную активность Эймса. Тест Эймса предназначен для выявления способности изучаемой ЛЛФ или ее метаболитов индуцировать генные мутации у индикаторных тестерных штаммов [9—12]. В качестве индикаторных микроорганизмов использовали штаммы Salmonella typhimuri-um TA98 (генотип hisD3052 rfa uvrB/pKM101) и TA100 (генотип hisG46 rfa uvrB/pKM101). Для учета генных мутаций применяли чашечный метод. При проведении исследования использовали крыс линии Вистар, ЛЛФ вводили в 4 дозах: 1,1; 5,5; 11,0 и 22,0 мкг/чаш-ка. В качестве положительного контроля были использованы вещества, индуцирующие мутации у соответствующих штаммов-тестеров при наличии или в отсутствие активации смесью S9. Для вариантов тестирования без активирующей смеси были использованы ^метил^-нитро^-нитрозогуанидин и ДДДТДП. При применении активирующей фракции S9 ее активность контролировали по эффекту бензапирена и 2-АФ. Мутагенный эффект считался положительным при 2-кратном превышении числа мутантных колоний в опыте по сравнению с соответствующим контролем. В качестве отрицательного контроля использовали растворитель — дистиллированную воду.
критериями положительного результата являлись статистически достоверное зависимое от дозы увеличение количества ревертантов или воспроизводимый положительный ответ хотя бы для одной экспериментальной точки.
определение числа хромосомный аберраций. Определение числа хромосомных аберраций проводили с использованием модифицированного в АО «Всесоюзный научный центр по безопасности биологически активных веществ» метода С.Е. Ford и J.L. Hamerton на клетках костного мозга на стадии метафазы мышей линии C57B1/6 массой тела 18—20 г [13]. ЛЛФ вводили внутривенно за 24 ч до начала эксперимента в дозах 1ТД (6 мг/кг) и 4ТД (24 мг/кг) в пересчете на мышь или в течение 5 дней с интервалом между введениями 24 ч в дозе 1ТД в пересчете на мышь. В качестве отрицательного контроля использовали физиологический раствор, в качестве положительного контроля вводили циклофосфамид в дозе 20 мг/кг.
Фиксацию клеток костного мозга проводили спустя 24 ч после последнего введения препарата. На каждый опытный и контрольный варианты брали не менее 5 животных и анализировали по 500 метафазных пластинок, с хорошим разбросом хромосом, без продольных наложений и модульным числом 40 от каждого.
При анализе учитывали следующие показатели: одиночные и парные делеции, хроматидные и хромосомные обмены и другие нарушения хромосом.
Оригинальные статьи 87
Доказательством цитогенетической активности явля- тора. Суспендирование проводили в растворе Хэнкса лось дозозависимое и/или воспроизводимое статисти- (рН 7,2—7,4) на холоде. Приготовленную суспензию чески значимое превышение доли клеток с хромосом- фильтровали и помещали в холодильник. ными аберрациями по сравнению с контролем. Расплавленную в дистиллированной воде 2 % Статистический анализ проводили с помощью теста х2. агарозу добавляли к равному объему 2-кратно нагре-оценка повреждений днк методом днк-комет. того до 45—48 °С раствора Хэнкса. В приготовленную Метод ДНК-комет позволяет регистрировать повреж- таким образом агарозу вносили суспензию ЭБ из рас-дения структуры ДНК и изучать процесс репарации чета 70—80 млн клеток на 1 мл агарозной смеси. В пред-ДНК на уровне одиночных клеток [14—16]. Экспери- варительно разогретые на водяной бане до темпе-менты по оценке повреждений ДНК проводили ратуры 46—48 °С пробирки разливали по 2,75 мл с использованием OxiSelect™ Comet Assay Kit по про- полученной смеси. Затем в пробирки, содержащие токолу производителя на мышах линии C57B1/6. агарозу с ЭБ, вводили суспензию селезеночных кле-Измерения проводили с помощью компьютер- ток. Содержимое пробирок встряхивали и выливали ной программы CometScore16, статистическую об- на чашки Петри диаметром 100 мм. Осторожным работку результатов проводили по каждой экспе- покачиванием и вращением смесь равномерно рас-риментальной точке путем сравнения показателей пределяли по дну чашки. После застывания агарозы поврежденности ДНК в опытной (ЛЛФ) и контроль- чашки помещали в термостат при 37,5 °С на 1 ч. Затем ной (циклофосфамид и физиологический раствор) на поверхность агарозы в чашках наливали по 3 мл группах с использованием непараметрических кри- раствора сухого комплемента морской свинки (раз-териев Даннета (% ДНК в хвосте, момент хвоста, ведение в физиологическом растворе 1:5) и инкуби-длина хвоста). ровали 45 мин в термостате при 37 °С. После инку-Показателем генотоксического действия являлся бации комплемент сливали и проводили подсчет индекс повреждения (ИП), который вычисляется образовавшихся зон гемолиза. При осмотре содер-по следующей формуле [17]: жимого чашек в проходящем свете на розовом фоне невооруженным глазом были видны небольшие оча- ДНК в хвосте в опытной группе Ип = miI, „ . ги — участки лизиса эритроцитов («прямые бляшки»). ДНК в хвосте в контрольной группе При микроскопии в центре зоны гемолиза была При ИП >2 исследуемый образец обладает гено- видна 1 клетка, являющаяся продуцентом антител-токсическими свойствами в условиях in vitro. гемолизинов. После подсчета зон гемолиза и коли-определение массы и клеточности органов. Мышей чества лимфоидных клеток, добавленных к агарозе, забивали на 7-й и 21-й дни после введения препарата вычисляли, сколько антителопродуцентов находи-с помощью цервикальной дислокации. Извлекали лось в исходной суспензии, затем делали перерасчет у них тимус, селезенку и трубчатые кости. Лимфоид- их количества на весь орган. ные органы взвешивали и с помощью стеклянного оценка влияния ллФ на клеточный иммунитет гомогенизатора готовили клеточную взвесь на основе в реакции гиперчувствительности замедленного типа питательной среды 199. Полученную суспензию филь- (ГЗт). Влияние ЛЛФ на клеточный иммунитет изу-тровали и 2 раза отмывали путем центрифугирования. чали в реакции ГЗТ по методу И.И. Подоплелова Костный мозг вытесняли с помощью питательной и соавт. [19, 21]. После введения препарата мышей среды 199 из бедренной кости левой лапки и затем иммунизировали 100 мкг овальбумина в сочетании гомогенизировали. Далее подсчитывали концентра- с 250 мкг синего Эванса в 0,2 мл физиологического цию ядросодержащих клеток (ЯСК) под микроскопом раствора в межлопаточную область. Вторую (разре-в 3 % уксусной кислоте. Результаты выражали в абсо- шающую) инъекцию 25 мкг овальбумина в 0,02 мл лютных единицах числа ЯСК в органе и в относитель- физиологического раствора производили на 5-е сут-ных значениях (процент от массы тела) [18, 19]. ки в подушечку задней лапы («опытная» лапа). оценка влияния ллФ на гуморальный иммунный В контралатеральную лапу вводили 0,02 мл стериль-ответ. В качестве антигена использовали суспензию ного физиологического раствора («контрольная» 3-кратно отмытых в стерильном физиологическом раст- лапа). Результаты реакции регистрировали через 24 ч воре эритроцитов барана (ЭБ) в дозе 5 х 107 ЭБ/мышь. путем определения массы «опытной» и «контроль-ЛЛФ вводили внутривенно, в качестве контроля ной» лап. Индекс реакции (ИР) для каждого живот-использовали воду для инъекций. На 5-е сутки после ного определяли по формуле иммунизации определяли число антителообразую- щих клеток (АОК) в селезенке (реакция Ерне) [20]. ИР = Ро — Рк Х 100 % Животных забивали с помощью цервикальной Рк дислокации, извлекали селезенки и готовили клеточ- где Ро — масса стопы «опытной» лапы; Рк — масса ную суспензию с помощью стеклянного гомогениза- стопы «контрольной» лапы.
1'2018 ТОМ 17 | vol. 17 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ | RUSSIAN JOURNAL OF BiOTHERAPY
оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. Через 24 ч после внутривенного введения препарата оценивали фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов по интенсивности захвата частиц суспензии 0,05 % коллоидной туши, введенной мышам внутрибрюшинно в объеме 2 мл. Через 10 мин брюшную полость промывали 5 мл изотонического раствора хлорида натрия. Полученные таким образом клетки перитонеального экссудата (КПЭ) 3-кратно отмывали, ресуспендировали в 1—2 мл физиологического раствора, подсчитывали концентрацию ЯСК и процент фагоцитирующих клеток под микроскопом. Для определения фагоцитарного индекса измеряли оптическую плотность лунок с лизатом КПЭ. Для этого клетки осаждали центрифугированием, супернатант удаляли, а осадок КПЭ лизирова-ли дистиллированной водой. Лизаты КПЭ помещали в плоскодонные 96-луночные планшеты и определяли с помощью спектрофотометрического анализатора при длине волны, равной 620 нм, оптическую плотность, отражающую количество туши, поглощенной перитонеальными фагоцитами. Результаты выражали в условных единицах, отражающих оптическую плотность лизата КПЭ, соотнесенную с количеством фагоцитирующих клеток.
Результаты
Получение ллФ с использованием полупромышленных установок и ее исследование. Липосомы получали по методу Бенгема в модификации для гидрофобных субстанций, для оценки возможности масштабирования технологии в технологический процесс были внесены изменения, связанные с использованием полупромышленных установок — роторного испарителя Heidolph Laborota 20 control safety с отгонной колбой на 20 л и экструдера Lipex™ Thermobarrel Extruder объемом 800 мл.
Экспериментальные исследования показали, что оптимальная загрузка вакуумной колбы 20 л для получения легко смываемой липидной пленки составляет 220 мл ТФГА в хлороформном растворе липи-дов. Увеличение объема приводило к формированию на стенках колбы неоднородной пленки, что требовало длительной сушки от органического растворителя и затем продолжительной регидратации полученной липидной пленки. Указанные обстоятельства осложняли процесс получения ЛЛФ как технологически, так и экономически (увеличение затрат на электроэнергию, износа оборудования). В связи с этим опытным путем был установлен наиболее рациональный объем загрузки отгонной колбы в 200—230 мл.
На этапе образования пленки основными критическими точками технологического процесса являются температура водяной бани, величина вакуума и скорость вращения колбы. Температура водяной
бани не варьируется, а устанавливается на +37 ± 0,2 °С, что обусловлено физико-химическими свойствами вспомогательных веществ. Величина вакуума задается максимальной и поддерживается автоматически, а вот скорость вращения колбы требуется подобрать оптимальную. Так как данный роторный испаритель способен развивать скорость от 6 до 160 об/мин, проводили ряд экспериментов с использованием различных скоростей вращения. Эмпирическим путем было доказано, что скорость вращения колбы 20 л роторного испарителя для получения однородной липидной пленки должна быть в пределах диапазона от 20 до 40 об/мин. Пленку сушили под вакуумом в течение 2,5 ч до удаления остатков хлороформа.
После получения липидной пленки отключали вакуум, в колбу с пленкой добавляли рассчитанный объем воды для инъекций (300 мл) и продолжали вращение, но скорость его уже не превышала 10—15 об/мин для послойного смывания пленки и получения однородной липосомальной дисперсии. На этапе разработки лабораторной технологии установили, что смыв пленки раствором криопротектора приводит к образованию трудно измельчаемых липосом, тогда как при применении воды для инъекций процесс измельчения происходит легко и быстро. Поэтому при масштабировании технологии в качестве раствора для гидратации липидной пленки использовали воду для инъекций, которая обеспечивала получение липосомальной дисперсии с приемлемым диаметром везикул (160 ± 20 нм).
После гидратации липидной пленки проводили измельчение липосомальной дисперсии с использованием полупромышленного экструдера на 800 мл. Измельчение проводят путем пропускания дисперсии через фильтры, имеющие поры размером 1,2 мкм (1 раз), 0,45 мкм (1 раз) и 0,22 мкм (5 раз). Затем к измельченной дисперсии добавляли раствор крио-протектора, стерилизующую фильтрацию водной липосомальной дисперсии ТФГА с криопротектором проводили с использованием полупромышленного экструдера. Полученную стерильную дисперсию дозировали по 6 мл во флаконы и лиофилизировали, при этом объем наполнения камеры сублимационной установки в отличие от лабораторной технологии был максимальным и составил 400 флаконов.
Полученные по модифицированной технологии липосомы сравнивали по основным качественным показателям (содержание действующего вещества, диаметр липосом и рН полученной дисперсии) с полученными при лабораторном производстве (табл. 1).
При обработке данных, полученных после анализа качества серий ЛЛФ, наработанных с помощью масштабирования технологии, можно сделать вывод, что применение полупромышленных установок на этапах получения липидной пленки и экструзии/
таблица 1. Сравнительный анализ липосомальных дисперсий, полученных по лабораторной и масштабированной технологиям
Примечание. pH — водородный показатель; ТФГА — тетра-3-фе-нилтиофталоцианин гидроксиалюминия.
стерилизации, увеличение объема наполнения камеры сублимационной сушки не приводят к снижению качества получаемого продукта по сравнению с ЛЛФ, полученной в соответствии с лабораторной технологией. Максимально возможный объем серии ЛЛФ — 400 флаконов.
Исследование мутагенных свойств ЛЛФ
Потенциальную мутагенную активность изучали в соответствии с международным стандартом ISO 10993-3:2003.
оценка промоторной активности. При исследовании промоторной активности ЛЛФ определяли степень кооперации клеток. При воздействии ЛЛФ в максимальной концентрации 3,1 мкг/мл степень клеточной кооперации составляет 91 % по отношению к клеткам, обработанным TPA, что статистически достоверно неотличимо от клеток, обработанных дистиллированной водой (рис. 1), это указывает на отсутствие промоторной активности. На рис. 2 представлены
микрофотографии монослоя клеток в области царапины из образцов клеток, обработанных дистиллированной водой, ТРА и ЛЛФ в 4 концентрациях.
оценка мутагенной активности в тесте Эймса. В табл. 2 и 3 приведены результаты исследований мутагенной активности ЛЛФ на штамме ТА100, чувствительном к веществам, которые индуцируют мутации с заменой оснований, а также на штамме ТА98, чувствительном к соединениям, индуцирующим мутации со сдвигом рамки считывания. Каждый эксперимент проводили 2-кратно. Показатели контрольных исследований находятся в пределах стандартных уровней, характерных для исследуемых штаммов. В вариантах положительного контроля выявлена высокая активность фракции S9: промутагены 2-АФ и бензапирен индуцируют высокий уровень реверсий. Специфичность мутагенного ответа в системе без активации ферментов микросомных микрооксигеназ подтверждена испытаниями штамма ТА98 с мутагеном ДДДТДП и штамма ТА100 с мутагеном ^ме-тил^-нитро^-нитрозогуанидином. Результаты проведенных исследований по изучению мутагенной активности ЛЛФ в тесте Эймса показали, что в диапазоне доз 1,1—22,0 мкг/чашка препарат не вызывает мутаций бактерий в присутствии и/или при отсутствии экзогенной метаболической системы (фракции S9), полученной от млекопитающих.
определение числа хромосомных аберраций. Результаты цитогенетического исследования по учету хромосомных аберраций (рис. 3) оценивали путем регистрации видимых структурных нарушений хромосом на стадии метафазы. ЛЛФ в дозах 1ТД и 4ТД, а также при 5-кратном введении в отличие от цикло-фосфамида статистически достоверно не индуцировала увеличение числа хромосомных аномалий в клетках костного мозга мышей.
Показатель качества лабораторная технология масштабированная технология
опыт 1 опыт 2 опыт 1 опыт 2
Содержание ТФГА в липо-сомальной дисперсии, мг/мл 0,25 ± 0,2 0,25 ± 0,3 0,25 ± 0,1 0,25 ± 0,2
Диаметр липосом, нм 175 ± 18 170 ± 20 172 ± 15 175 ± 20
pH 6,9 7,1 6,8 6,6
Доля клеток, находящихся в кооперации, % относительно образца, обработанного дистиллированной водой
ТРА Контроль 0,062 мкг/мл 0,31 мкг/мл 0,62 мкг/мл 3,1 мкг/мл
t
20
40
60
80
100
рис. 1. Полученная на клетках 1АА-7 зависимость промоторной активности от концентрации липосомальных лекарственных форм. ТРА -12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетат
0
Рис. 2. Микрофотографии монослоя клеток в области царапины из образцов клеток: а — обработанных дистиллированной водой; б — 5 нг/ мл 12-0-тетрадеканоилфорбол-13-ацетата; в — липосомальная лекарственная форма (ЛЛФ) в концентрации 3,1 мкг/мл; г — ЛЛФ в концентрации 0,62мкг/мл; д — ЛЛФ в концентрации 0,31 мкг/мл; е — ЛЛФ в концентрации 0,062мкг/мл
Таблица 2. Результаты исследования мутагенного действия ЛЛФ на индикаторный штамм бактерии ТА100 в тесте Эймса
Штамм ТА100
Исследуемое Доза на чашку, мкг ^9 +S9
вещество опыт 1 опыт 2 МА опыт 1 опыт 2 МА
М ± т М1/М0 М ± т М/М0 М ± т М1/М0 М ± т М1/М0
Контроль фона 0 41 ± 6,4 1,0 39 ± 6,0 1,0 - 57 ± 2,0 1,0 55 ± 3,3 1,0 -
БП 4,4 403 ± 31,1 7,1 430 ± 33,3 7,8 +
2-АФ 22,0 520 ± 26,7 9,1 590 ± 13,8 10,7 +
НГ 4,4 507 ± 28,7 12,4 574 ± 14,7 14,7 +
1,1 44 ± 4,4 1,1 47 ± 3,3 1,2 - 51 ± 1,1 0,9 53 ± 2,7 1,0 -
ЛЛФ 5,5 37 ± 4,0 0,9 41 ± 2,7 1,1 - 49 ± 3,8 0,9 50 ± 1,1 0,9 -
11,0 41 ± 1,6 1,0 47 ± 2,9 1,2 - 49 ± 6,7 0,9 59 ± 13,1 1,1 -
22,0 39 ± 2,4 1,0 41 ± 2,2 1,1 - 61 ± 2,0 1,1 54 ± 1,1 1,0 -
Примечание. Здесь и в табл. 3:М — среднее значение, т — стандартная ошибка среднего. 2-АФ — 2-аминофлуорен; БП — бензапирен; ЛЛФ — липосомальная лекарственная форма; НГ — Nметил-^нитро-^нитрозогуанидин. М1/М0 — отношение числаревертантов в опыте к числу ревертантов в контроле. МА — мутагенная активность препарата («+» — наличие, «—» — отсутствие).
Оценка повреждения ДНК с помощью теста ДНК-комет. При исследовании степени повреждения ДНК ЛЛФ в тесте ДНК-комет была оценена доля «комет» в общем количестве клеток. При введении мышам ЛЛФ в дозах 1ТД и 4ТД было показано, что данное соединение не вызывает статистически досто-
верного увеличения количества клеток-«комет» (рис. 4). В то же время препарат циклофосфамид, известный ДНК-повреждающий агент, вызывал достоверное увеличение числа «комет» по сравнению с контрольной группой (33,8 % от общего числа клеток по сравнению с 5,2 % клеток в контрольной группе).
Таблица 3. Результаты исследования мутагенного действия ЛЛФ на индикаторный штамм бактерии ТА98 в тесте Эймса
Штамм ТА98
Исследуемое Доза на чашку, мкг -S9 +S9
вещество опыт 1 опыт 2 MA опыт 1 опыт 2 MA
M ± m Mt/M0 M ± m M/M0 M ± m М1/М, M ± m М1/М,
Контроль фона 0 9 ± 2,0 1,0 8 ± 2,9 1,0 - 16 ± 1,6 1,0 13 ± 2,2 1,0 -
БП 4,4 235 ± 16,7 14,7 189 ± 14,2 14,5 +
2-АФ 22,0 267 ± 17,8 16,7 227 ± 18,2 17,5 +
ДДДТДП 8,8 297 ± 42,2 33,0 320 ± 33,3 40,0 +
1,1 10 ± 1,3 1,1 7 ± 0,4 0,9 - 18 ± 1,8 1,1 16 ± 2,0 1,2 -
ЛЛФ 5,5 9 ± 0,9 1,0 9 ± 0,9 1,1 - 18 ± 3,6 1,1 13 ± 1,6 1,0 -
11,0 8 ± 1,6 0,9 8 ± 1,6 1,0 - 15 ± 0,7 0,9 13 ± 2,0 1,0 -
22,0 12 ± 1,3 1,3 9 ± 1,8 1,1 - 17 ± 2,2 1,1 14 ± 2,0 1,1 -
Примечание. ДДДТДП — 2,7-диамино-4,9-диокси-5,10-диоксо-4,5,9,10-тетрагидро-4,9-диазапирен.
Таблица 4. Характеристики клеток после обработки ЛЛФ в тесте ДНК-комет
Препарат, концентрация Средняя длина «хвоста кометы», пиксели Доля поврежденной ДНК, % Момент «хвоста кометы» ИП
Физиологический раствор, самцы, 24 ч 15,5 ± 2,0 0,00044 ± 0,00005 0,00004 ± 0,00001 -
Физиологический раствор, самцы, 5 сут 13,3 ± 2,03 0,000215 ± 0,000091 0,000055 ± 0,000019 -
Физиологический раствор, самки, 5 сут 13,5 ± 1,97 0,000236 ± 0,00009 0,00008 ± 0,000042 -
Циклофосфамид, самцы, 20 мг/кг, 24 ч 49,9 ± 4,0 3,54 ± 0,47 3,77 ± 0,57 8045,5
ЛЛФ, самцы, 1ТД, 24 ч 14,2 ± 1,2 0,000300 ± 0,00011 0,00006 ± 0,00001 0,68
ЛЛФ, самцы, 4ТД, 24 ч 14,6 ± 0,7 0,000390 ± 0,00010 0,00007 ± 0,00002 0,89
ЛЛФ, самцы, 1ТД, 5 сут 15,1 ± 0,91 0,0000362 ± 0,000107 0,000037 ± 0,000007 1,68
ЛЛФ, самки, 4ТД, 5 сут 17,7 ± 1,63 0,000297 ± 0,000092 0,000038 ± 0,000004 1,28
Примечание. ДНК — дезоксирибонуклеиновая кислота; ИП — индекс повреждения; ЛЛФ — липосомальная лекарственная форма.
Важными данными, получаемыми при проведении теста ДНК-комет, также являются такие характеристики «кометы», как длина «хвоста кометы», доля поврежденной ДНК в клетке, а также момент «хвоста кометы», определяемый как произведение длины «хвоста» на % поврежденной ДНК. Хвост «кометы» представляет собой фракцию относительно низкомолекулярной ДНК, образовавшейся в результате появления разрывов в высокомолекулярной хромосомной ДНК. В нашем случае средняя длина «хвоста кометы» при введении самцам мышей в течение 24 ч физиологического раствора составила 15,5 ± 2,0 пикселя, доля поврежденной ДНК и момент «хвоста» были пренебрежимо малы. Значения данных показателей для мышей, получавших ЛЛФ, находились в том же диапазоне, в то время как у самцов, получавших цикло-фосфамид в дозе 20 мг/кг, доля поврежденной ДНК
составила 3,54 %, а средняя длина «хвоста кометы» — 49,9 ± 4,0 пикселя (табл. 4), что подтверждает геноток-сические свойства циклофосфамида.
ИП был менее 2,0 для всех опытных групп, получавших ЛЛФ, что указывает на то, что исследуемый образец не обладает генотоксическими свойствами в условиях in vitro.
При анализе полученных данных можно сделать вывод, что ЛЛФ в исследованных дозах 1ТД и 4ТД не увеличивает количество хромосомных аномалий у мышей и не вызывает повреждений ДНК в тесте ДНК-комет, в дозах 1,1—22,0 мкг/чашка не проявляет мутагенной активности в бактериальном тесте Эймса, а также в тесте на промоторную активность in vitro в диапазоне концентраций 0,062—3,1 мкг/мл не обладает способностью разобщать межклеточные контакты, что свидетельствует об отсутствии
ЛЛФ 4ТД, 24 ч, самцы ЛЛФ 1ТД, 5 сут с интервалом 24 ч, самцы ЛЛФ 1ТД, 5 сут с интервалом 24 ч, самки ^^^^ Физиологический раствор, 24 ч, самцы Физиологический раствор, 5 сут с интервалом 24 ч, самцы Физиологический раствор, 5 сут с интервалом 24 ч, самки
Циклофосфамид 20 мг/кг, 24 ч, самцы
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 % аберрантных метафаз
Рис. 3. Результаты исследований влияния липосомальныхлекарственных форм (ЛЛФ) на увеличение числа хромосомных аномалий в клетках костного мозга мышей линии С57В1/6
Таблица 5. Состояние лимфоидных и кроветворных органов на 7-й день после введения ЛЛФ
Орган иммунной системы Контроль* ЛЛФ, 6 мг/кг ЛЛФ, 12 мг/кг
Количество ЯСК 3,0 х 108 2,7 х 108 3,1 х 108
Селезенка Масса, мг 90 83 86
Масса, % от массы тела 0,415 ± 0,017 0,407 ± 0,015 0,416 ± 0,019
Количество ЯСК 2,0 х 108 2,0 х 108 2,1 х 108
Тимус Масса, мг 56 49 55
Масса, % от массы тела 0,259 ± 0,013 0,272 ± 0,016 0,268 ± 0,011
Костный мозг (количество ЯСК в костном мозге левого бедра) 1,1 х 108 0,9 х 108 1,0 х 108
Примечание. Здесь и в табл. 6: ЛЛФ — липосомальная лекарственная форма; ЯСК — ядросодержащие клетки. *В качестве контроля использовалась вода для инъекций.
у данного препарата способности промотировать процесс канцерогенеза.
Исследование иммунотоксичности
Влияние ЛЛФ на массу и клеточность лимфоидных и кроветворных органов иммунной системы. На 7-й
и 21-й дни после внутривенного введения ЛЛФ оценивали влияние препарата на состояние селезенки, тимуса, костного мозга мышей. Значимых изменений в органах лимфоидной системы после применения ЛЛФ по сравнению с контролем (вода для инъекций) не наблюдали (табл. 5 и 6).
Оценка влияния ЛЛФ на гуморальный иммунный ответ. Оценка гуморального иммунного ответа, т. е. способности иммунной системы к выработке антител в ответ на чужеродные агенты, является наиболее информативной при изучении иммунотоксичности. Оценка проводится в интегральном функциональном тесте: выработка АОК при иммунизации мышей Т-зависимым антигеном - ЭБ.
Данные, приведенные в табл. 7, показывают, что ЛЛФ в исследованных дозах не оказывала влияния на выработку АОК.
ЛЛФ 1ТД, 24 ч, самцы ЛЛФ 4ТД, 24 ч, самцы ЛЛФ 1ТД, 5 сут, самцы
ЛЛФ 1ТД, 5 сут, самки
Физиологический раствор, 24 ч, самцы Физиологический раствор, 5 сут, самцы Физиологический раствор, 5 сут, самки Циклофосфамид 20 мг/кг, 24 ч, самцы
Рис. 4. Влияние липосомальных лекарственных форм (ЛЛФ) на количество клеток «комет»
5 10 15 20 25 30 35 % увеличения числа «комет»
0
Таблица 6. Состояние лимфоидных и кроветворных органов на 21-й день после введения ЛЛФ
Орган иммунной системы Контроль ЛЛФ, 6 мг/кг ЛЛФ, 12 мг/кг
Количество ЯСК 3,8 х 108 3,6 х 108 3,5 х 108
Селезенка Масса, мг 100 97 92
Масса, % от массы тела 0,441 ± 0,017 0,453 ± 0,020 0,419 ± 0,015
Количество ЯСК 3,3 х 108 3,3 х 108 3,1 х 108
Тимус Масса, мг 90 86 89
Масса, % от массы тела 0,392 ± 0,011 0,401 ± 0,017 0,381 ± 0,015
Костный мозг (количество ЯСК в костном мозге левого бедра) 1,5 х 108 1,4 х 108 1,4 х 108
Таблица 7. Влияние ЛЛФ на количество АОК селезенки мышей
Группа Количество ЯСК Среднее количество АОК на селезенку Коэффициент по отношению к контролю Р
Контроль* 4,6 х 108 1990,42 ± 24,48 - -
ЛЛФ, 6 мг/кг 4,5 х 108 2016,40 ± 46,51 1,013 0,17
ЛЛФ, 12 мг/кг 4,6 х 108 1950,22 ± 64,0 0,96 0,13
Примечание. Здесь и в табл. 8: р — стандартное отклонение; АОК — антителообразующие клетки; ЛЛФ — липосомальная лекарственная форма; ЯСК — ядросодержащие клетки. *В качестве контроля использовалась вода для инъекций.
■
Оценка влияния ЛЛФ на клеточный иммунитет в реакции ГЗТ. Реакция ГЗТ дает возможность изучить влияние на продукцию сенсибилизированными лимфоцитами медиаторов, вовлекающих клетки мононуклеарных фагоцитов в иммунный ответ, и оценить влияние на функциональную активность системы Т-клеток иммунитета.
В табл. 8 приведены данные, полученные при оценке влияния ЛЛФ на развитие ГЗТ к овальбумину. Установлено, что ЛЛФ не оказывала влияния на выраженность ГЗТ при внутривенном 1-кратном введении в дозах 6 и 12 мг/кг.
Таблица 8. Влияние ЛЛФ на клеточный иммунный ответ
чество макрофагов в организме, так как сами являются объектом фагоцитоза [22]. Поскольку исследуемый препарат является липосомальной формой, вероятно, при введении за 24 ч до исследования фагоцитарной активности он мог быть фагоцитирован, что вызвало снижение количества макрофагов у мышей. В связи с этим определяли длительность сохранения выявленного снижения количества макрофагов у мышей. Через 7 сут после введения препарата (табл. 10) фагоцитарная активность в опытных группах не отличалась от контроля.
Таблица 9. Влияние ЛЛФ на фагоцитарную активность перитоне-альных макрофагов через 24 ч после введения
Группа ИР, % Р
Контроль* 7,2 ± 0,51 -
ЛЛФ, 6 мг/кг 7,2 ± 0,55 0,73
ЛЛФ, 12 мг/кг 7,2 ± 0,60 0,85
Примечание. ИР — индекс реакции.
*В качестве контроля использовалась вода для инъекций.
Фагоцитирующие клетки Фагоцитарный индекс
Группа Количество, X 10б % от общего числа ЯСК КПЭ
Контроль 1,6 ± 0,1 3,1 0,428 ± 0,015
ЛЛФ, 6 мг/кг 1,1 ± 0,1 2,5 0,375 ± 0,043*
ЛЛФ, 12 мг/кг 1,0 ± 0,1 2,5 0,286 ± 0,023*
Оценка фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов. При изучении фагоцитарной активности перитонеальных макрофагов через 24 ч после введения ЛЛФ обнаружили, что препарат снижает количество и процент фагоцитирующих клеток, а также дозозависимо уменьшает фагоцитарный индекс КПЭ (табл. 9). Липосомы могут снижать системное коли-
Примечание. Здесь и в табл. 10: КПЭ — клетки перитонеального экссудата; ЛЛФ — липосомальная лекарственная форма; ЯСК — ядросодержащие клетки.
*р <0,05 по отношению к контролю. В качестве контроля использовалась вода для инъекций.
Таким образом, исследование действия ЛЛФ на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов
Таблица 10. Влияние ЛЛФ на фагоцитарную активность перитонеальных макрофагов через 7 сут после введения
при внутривенном введении в дозах 6 и 12 мг/кг показало, что препарат не оказывает влияния на клеточный иммунитет.
Заключение
По результатам проведенных исследований масштабирована технология получения ЛЛФ, позволяющая получить за 1 производственный цикл до 400 флаконов.
Изучено влияние ЛЛФ на мутагенные свойства и иммунотоксичность. Установлено, что ЛЛФ в исследованных дозах 6 и 24 мг/кг не увеличивает хромосомные аномалии у мышей и не вызывает повреждений ДНК, в дозах 1,1—22,0 мкг/чашка не проявляет мутагенной активности в бактериальном тесте Эймса, в диапазоне концентраций 0,062—3,1 мкг в тесте на промоторную активность не разобщает межклеточные контакты, что свидетельствует об отсутствии у данного препарата способности промоти-ровать процесс канцерогенеза.
Определено, что в дозах 6 и 12 мг/кг ЛЛФ не оказывает влияния на гуморальный и клеточный иммунитет, не изменяет массу и клеточность центральных и периферических органов иммунной системы. ЛЛФ через 24 ч после введения в дозах 6 и 12 мг/кг дозо-зависимо снижает фагоцитарную активность пери-тонеальных макрофагов, которая восстанавливается через 7 сут. Следовательно, ЛЛФ в изученных дозах не оказывает иммунотоксического действия.
Фагоцитирующие клетки Фагоцитарный индекс
Группа Количество, х10б % от общего числа ЯСК КПЭ
Контроль 1,8 ± 0,1 3,0 0,432 ± 0,019
ЛЛФ, 6 мг/кг 1,8 ± 0,1 3,2 0,430 ± 0,027
ЛЛФ, 12 мг/кг 1,9 ± 0,1 3,0 0,438 ± 0,018
Работа выполнена при финансовой поддержке Минобрнауки РФ (госконтакт № 14.N08.12.0074).
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Maeda H., Wu J., Sawa T. et al. Tumor vascular permeability and the EPR effect in macromolecular therapeutics: a review. J Control Rel 2000;65:271-84.
DOI: 10.1016/S0168-3659(99)00248-5.
2. Wick P., Manser P., Limbach L.K. et al. The degree and kind of agglomeration affect carbon nanotube cytotoxicity. Toxicol Lett 2007;168(2):121-31. DOI: 10.1016/j.toxlet.2006.08.019.
3. Ziemba B., Matuszko G., Bryszewska M., Klajnert B. Influence of dendrimers on red blood cells. Cell Moll Biol Lett 2012;17(1):21-35. DOI: 10.2478/s11658-011-0033-9.
4. Аляутдин Р.Н., Романов Б.К. Рекомендации по оценке безопасности лекарственных средств, содержащих наночастицы. Безопасность и риск фармакотерапии 2015;4:10-22.
5. Szebeni J., Muggia F., Gabizon A., Barenholz Y. Activation of complement by therapeutic liposomes and other lipid excipient-based therapeutic products: prediction and prevention. Adv Drug Deliv Rev 2011;63(12):1020-30.
DOI: 10.1016/j.addr.2011.06.017.
6. Brissette J.L., Kumar N.M., Gilula N.B., Dotto G.P. The tumor promoter 12-O-tet-radecanoylphorbol-13-acetate and the ras oncogene modulate expression and phos-phorylation of gap junction proteins. Mol Cell Biol 1991;11:5364-71.
7. Abbaci M., Barberi-Heyob M., Blondel W et al. Advantages and limitations of commonly used methods to assay the molecular permeability of gap junctional intercel-
lular communication. BioTechniques 2008; 45:33-46. DOI: 10.1128/MCB.11.10.5364.
8. Na M.R., Koo S.K., Kim D.Y. et al. In vitro inhibition of gap junctional intercellular communication by chemical carcinogens. Toxicology 1995;98:199-206.
DOI: 10.1016/0300-483X(94)02931-J.
9. Maron D.M., Ames B.N. Revised methods for the Salmonella mutagenicity test. Mutat Res 1983;113(3-4):173-215.
DOI: 10.1016/0165-1161(83)90010-9.
10. Руководство по проведению доклинических исследований лекарственных средств. Методические указания по оценке мутагенных свойств фармакологических препаратов. М.: Гриф и К, 2012. Ч. 1. 944 с.
11. Белицкий Г. А., Ревазова Ю.А., Аби-лев С.К. и др. Методические рекомендации по исследованию канцерогенных свойств фармакологических и лекарственных средств. Ведомости Фармакологического комитета 1998;1:21-4.
12. Фонштейн Л.М., Абелев С.К., Бобринев Е.В. и др. Методы первичного выявления генетической активности загрязнителей среды с помощью бактериальных тест-систем (Методические указания). М., 1983. 34 с.
13. Ford C.E., Hamerton J.L. Chromosomes of five rodent species. Nature 1956;31:247-54.
14. Оценка генотоксических свойств методом ДНК-комет in vitro. Методические рекомендации. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Ро-спотребнадзора, 2010.
15. Olive P.L., Banath J.P. The comet assay:
a method to measure DNA damage in indi-
vidual cells. Nat Protoc 2006;1(1):23-9. DOI: 10.1038/nprot.2006.5.
16. Budunova I.V., Mittelman L.A., Belitsky G.A. Identification of tumor promoters by their inhibitory effect on intercellular transfer of lucifer yellow. Cell Biol Toxicol 1989;5(1):77-89.
DOI: 10.1007/BF00141066.
17. Ostling O., Johanson K.J. Microelectropho-retic study of radiation-induced DNA damage in individual mammalian cells. Biochem Biophys Res Commun 1984;123:291-8. DOI: 10.1016/0006-291X(84)90411-X.
18. Иванова А.С., Мастернак Т.Б., Мартынов А.И. Принципы изучения иммунотоксического действия фармакологических препаратов. Токсикологический вестник 2010;5:26-31.
19. Иванова А.С., Мастернак Т.Б., Малкина Е.Ю., Мартынов А.И. Принципы оценки иммунологической безопасности фармацевтических продуктов. Биомедицина 2011;(3):94-7.
20. Jerne N.K., Nordin A.A. Plaque formation in agar by single antibody-producing cells. Science 1963;140:405.
21. Подоплелов И.И., Крылов О.Р., Меду-ницын Н.В. Эванс синий как адъювант для получения повышенной чувствительности замедленного типа в эксперименте. Бюллетень экспериментальной биологии и медицины 1985;6:729.
22. Raz A., Bucana C., Fogler W.E. et al. Biochemical, Morphological, and Ultrastructural Studies on the Uptake of Liposomes by Murine Macrophages. Cancer Res 1981;41:487-94. PMID: 7448797.
