CC BY
71
УДК 542.61.35 + 547.918
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЯ ЭКСТРАКТОВ КОРНЯ АРАЛИИ МАНЬЧЖУРСКОЙ
В СРЕДЕ СУБКРИТИЧЕСКОЙ ВОДЫ
© 2009 г. С.Н. Борисенко1, М.И. Руднев1, Р.Н. Борисенко1, К.С. Тихомирова1, Н.И. Борисенко2, Е.В. Ветрова1, Е.В. Максименко2, Д.В. Зимаков3
1Научно-исследовательский институт
физической и органической химии Южного федерального университета, пр. Стачки 194/2, Ростов н/Д, 344090, Ъе11@1рос. sfedu.ru
2Эколого-аналитический центр Южного федерального университета, пр. Стачки 194/2 Ростов н/Д, 344090
3Южный научный центр РАН ул. Чехова, 41, Ростов н/Д, 344006
1The Institute of Physical and Organic Chemistry of Southern Federal University, Stachki Ave, 194/2, Rostov-on-Don, 344090, [email protected]
2Ecoanalytical Center of Southern Federal University Stachki Ave, 194/2, Rostov-on-Don, 344090
3Southern Scientific Center of RAS, Chehov St., 41, Rostov-on-Don, 344006
Методом масс-спектрометрии в режиме электроспрей ионизации изучены продукты экстракции корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды.. Наличие и концентрация аралозидов А, В и С, в полученных экстрактах определены методами по-тенциометрического титрования и высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением ВЭЖХ/МС. С использованием разработанных методик идентификации хроматографических пиков процесс экстракции аралозидов из корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды изучен и оптимизирован.
Ключевые слова: высокоэффективная жидкостная хроматография, масс-спектрометрия, субкритическая вода, тритерпеновые гликозиды, аралия маньчжурская, аралозиды.
Aralia Manchurian root products of extraction in subcritical water medium have been investigated by electrospray ionization mass spectrometry. Both potenciometric titration and high performance liquid chromatography were applied to detect the concentration of aralosides A, B, C in the extract. Using developed methods of chromatographic peaks identification, aralosids extraction process from Aralia Manchurian root in subcritical water medium has been studied and optimized.
Keywords: high-performance liquid chromatography, mass spectrometry, subcritical water, triterpenoid glycoside, aralia mandshurica, araloside.
Введение
Тритерпеновые гликозиды остаются классическими объектами исследования благодаря широкому спектру их биологической активности и развитию методов выделения и анализа продуктов растительного происхождения. Типичным примером таких гликозидов служат биологически активные вещества из корней аралии маньчжурской Aralia mandshurica Rupr. et Maxim. -аралозиды А, В и С (I) (рис. 1), представляющие собой гликозиды олеаноловой кислоты [1]. Смеси этих арало-зидов являются действующими веществами настойки аралии и таблеток «Сапарал», применяемых в качестве тонизирующего и иммуномодулирующего средства, и близких по лечебному действию к препаратам с женьшенем [2]. Исходным продуктом для лекарственных средств из аралии является концентрат «Сапарал» (ФС 42-1924-82) - аморфный порошок кремового цвета без запаха с содержанием смеси аралозидов А, В и С (I) не менее 80 %. Классическая схема экстракции включает применение в качестве экстрагентов и реагентов метанола, этилацетата, н-бутанола, активированного угля, соляной кислоты и гидрооксида аммония [3], что при-
водит к необходимости регенерации и утилизации значительного количества растворителей и адсорбентов.
Рис. 1. Структурная формула аралозидов А (Я! = Ь-арабиноза, = Н), В (Я! = Ь-арабиноза, Я2 = Ь-арабиноза) и С (Я.! = Б-галактоза, Я2 = Б-ксилоза)
Известно, что вода в области критической точки может выступать в качестве реагента, растворителя и катализатора [4], в том числе в субкритической области температур (100 - 374 оС) и давлений менее 220-105 Па [5]. Сочетание свойств воды как наиболее эконо-
мически доступного и экологически чистого растворителя открывает путь к развитию новой методики получения аралозидов из корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды. Разработка соответствующей методики получения аралозидов - одна из основных целей данной работы. При этом важнейшей её частью является разработка эффективных методик установления качественного и количественного состава полученных в среде субкритической воды смесей с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии с МС- детектированием.
Экспериментальная часть
150^4 мм, изократический режим элюирования 0,01 N серная кислота/ацетонитрил в соотношении 65:35 при температуре 40 оС и скорости потока 0,8 мл/мин, время хроматографирования 10 мин.
Качество исходных корней аралии маньчжурской соответствовало требованиям ГФХ XI, т. 2, статья 65 «Корни аралии маньчжурской».
В качестве стандарта смеси аралозидов использован концентрат препарата «Сапарал» (ФС 42-1924-82) производства ЗАО «ВИФИТЕХ» с общим содержанием аралозидов 80,2 % в пересчете на сухой препарат.
Результаты и их обсуждение
Экстракция аралозидов из корней аралии в среде субкритической воды проведена в статическом режиме. В герметичный реактор из нержавеющей стали емкостью 10 см3 помещали навеску сухого средне измельченного корня аралии и добавляли выбранный объем воды; герметично закрытый реактор выдерживали в термостат при температуре 140±2 оС 1 ч. Затем реактор охлаждали, осадок вместе с остатками корней отфильтровывали на бумажном фильтре (синяя лента); водный фильтрат пропускали через хромато графическую колонку (h = 20 см, 0 = 1 см) c оксидом алюминия для хроматографии; фракцию аралозидов отделяли от смол и балластных веществ элюировани-ем смесью ацетонитрил/вода в соотношении 35:65. После упаривания с применением роторного испарителя (температура упаривания не более 40 оС) получен сыпучий порошок коричневого цвета без запаха. Содержание аралозидов в полученном экстракте определено методом потенциометрического титрования и составило 12,42±0,27 % от суммы аралозидов, влажность - 7,2 % после высушивания при температуре 102±2 оС до постоянного веса.
Наличие и концентрация аралозидов А, В и С в полученных экстрактах определены методом потенцио-метрического титрования в соответствии с требованиями ГФХ XI, т. 2, ст. 65 «Корни аралии маньчжурской», а также методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением ВЭЖХ/МС комплекса «Thermo Finnigan MSQ Surveyour», колонка ODS Cj8 5 мкм 150^2,1 мм, градиентное элюирование ацетонитрил-вода от 5 до 95 об. % при температуре 40 оС и скорости потока 0,4 мл/мин; ионизация электроспреем при напряжении на конусе - 70 В; продолжительность хроматограммы - 25 мин. Молекулярная масса и фрагментация аралозидов исследованы с применением тандемного МС'-спектрометра «Thermo Fin-nigan LCQ Deca XP Max» с ионизацией электроспреем при положительной полярности [6]; использован прямой ввод экстракта пробы со скоростью 5 мкл/мин; напряжение на конусе оптимизировано для каждого соединения; спектры МС/МС и МС/МС/МС получали с применением ионной ловушки и нормализованной энергии столкновений, обеспечивающей воспроизводимость результатов для различных МС-спектро-метров; величины заряда ионов определяли с использованием функции ZoomScan.
Параллельно с ВЭЖХ/МС комплексом использован жидкостный хроматограф «Thermo Separation Products» с УФ-детектором с детектированием при длине волны 206 нм, колонка Cromasil Q8 5 мкм
Классический экстракт аралозидов получен по методике [7] экстракцией метанолом. На рис. 2а представлена хроматограмма рутинного (метанольного) экстракта из корня аралии (с УФ-детектором с детектированием при длине волны 206 нм, колонка Croma-sil Q8 5 мкм 150^4 мм).
Рис. 2. Хроматограммы экстрактов из корня аралии: а - рутинный СН3ОН-экстракт по методике [7]; б - экстракт субкритической водой в статическом режиме. Аралозиды представлены пиками с временем удерживания 4,8^4,9,
5,78^5,79 и 6,48 мин (изократический режим, с УФ-детектором с детектированием при длине волны 206 нм, колонка Cromasil С18 5 мкм 150x4 мм)
Экстракция аралозидов из корней аралии проведена субкритической водой в статическом режиме. На рис. 2б представлена хроматограмма полученного в среде субкритической воды экстракта из корня аралии при тех же условиях хроматографирования.
Спектр инфракрасного поглощения суспензии экстракта в вазелиновом масле содержит широкие полосы поглощения в области 1660-1620 см-1, характерной для солей карбоновых кислот, и области 3400-3200 см-1, характерной для ассоциированных гидроксильных групп углеводных фрагментов; полоса поглощения сложноэфирного карбонила при атоме С-28 в структуре I (рис. 1) расположена при 1732 см-1 и имеет слабую интенсивность, что подтверждает преобладание балластных веществ в полученном экстракте [8].
Спектр электронного поглощения раствора экстракта в воде при рН 7 имеет два максимума поглощения: острый и интенсивный при 206 нм и более широкий в районе от 250 до 340 нм; кривая поглощения соответствует наличию несопряженной двойной связи при атомах С-12 и карбонильной группы при С-28 в структуре I [9] (рис. 1).
Идентификация аралозидов, полученных экстракцией в условиях субкритической воды, выполнена с применением спектроскопии ЯМР 1Н. Для получения с целью их дальнейшей идентификации индивидуальных веществ экстракт разделен на фракции с применением полупрепаративной ВЭЖХ-колонки «Cromasil 018» 5 мкм 150x4,2 мм (хроматограмму см. на рис. 2б). В каждой из 3 полученных фракций зафиксировано наличие в спектре ЯМР 1Н, 7 синглетов интенсивностью по 3Н каждый при с 0,84, 0,89, 0,96, 0,98, 0,99, 1,10 и 1,21, что соответствует 7 метильным группам: Ме-26, Ме-24, Ме-30, Ме-29, Ме-23, Ме-25 и Ме-27 структуры I. Присутствие р-глюкозного фрагмента при карбонильной группе С-28 агликона I доказано аномерным сигналом при с 5,42 (1Н, d, J = 7,5 Гц).
Из [10] известно, что некоторые тритерпеновые сапонины могут быть термически неустойчивыми. Так, например, соевый сапонин pg количественно превращается в сапонины I и V при нагревании в растворе при температуре выше 80 оС в течение 5 ч либо в кислых или щелочных растворах при комнатной температуре. Двойные связи некоторых стеринов сравнительно легко подвергаются химическим превращениям, например, холестерин у млекопитающих превращается в дигидрохолестерин, который в виде цис-конформера (копростанол) выводится из организма [11].
Поскольку в процессе экстракции в среде субкритической воды аралозиды подвергаются воздействию высоких температур и давлений, существует возможность сопровождения данного процесса изомеризацией или окислительно-восстановительными реакциями агликона. Нами изучена возможность изомеризации фрагмента олеа-ноловой кислоты в выделенных аралозидах структуры I в среде субкритической воды. Получено, что стереохимиче-ски информативные константы спин-спинового взаимодействия фрагментов ^Н^СН^^
ПнаНа = 13,5 ГЦ, J
18CH-19CHaxHeq И
JHeqHeq = 3,8 Гц),
5CH-6CHaxHeq подтверждают ориентацию при атомах С-3 и С-18, а также транс-конфигурацию колец А и В, что согласуется с [12, 13] и отвергает предположение о возможной изомеризации фрагмента олеаноловой кислоты.
Наличие в экстракте аралозидов А, В и С с характерными молекулярными массами (926, 1058 и 1088) доказано с использованием жидкостной хроматографии с масс-спектральным детектором. Так как каждый аралозид содержит фрагмент глюкуроновой кислоты, и выделение аралозидов проведено в форме солей аммония, то хроматограмма экстракта аралози-дов содержит 3 характерных изохронных группы пиков однозарядных катионов: М + H+, M + NH4+ и M + Na+, т.е. [М + 1]+, [М + 18]+ и [М + 23]+. Соединения с катионами, имеющими m/z = 927, 944 и 949, идентифицированы как аралозид А (MW = 926) с m/z = = 1059; 1076 и 1081 - как аралозид В (MW = 1058), с m/z = 1089; 1106 и 1111 - как аралозид С (MW = 1088) (рис. 3). Относительное содержание аралозидов А, В и С определено методом нормировки и составило А : В : С = 57 : 27 : 16.
В этой же хроматограмме обнаружен незначительный (до 4 % от суммы аралозидов А, В и С) пик арало-зида с молекулярной массой 1118, соответствующей брутто-формуле С54Н86О24 и отличающийся от арало-зида С добавлением СН2О-фрагмента в R2 структуры I. Предположительно, это может быть 4-й аралозид, впервые обнаруженный в 1998 г. [14] в корнях аралии близкого вида Aralia dasyphylla. Исчерпывающая идентификация этого соединения в экстракте из корней аралии маньчжурской требует продолжения исследований.
С использованием разработанных методик идентификации хроматографических пиков процесс экстракции аралозидов из корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды был изучен и оптимизирован. На эффективность предложенного процесса получения смеси аралозидов влияют добавки в воду аммиака, температура процесса, продолжительность экстракции и соотношение сырье:экстрагент. На рис. 2б представлена типичная хроматограмма экстракта аралозидов из корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды, полученная в статическом режиме с оптимизированными параметрами.
Из таблицы и рис. 2б следует, что экстракция субкритической водой в статическом режиме позволяет извлечь в 1,9 раза больше аралозидов А, В и С, чем традиционный метод экстракции метанолом.
Сравнение методов экстракции аралозидов из корня аралии маньчжурской (n = 6)
Метод экстракции Экстрагент Время, мин Температура, оС Выход аралозидов из 1 г сырья Эффективность извлечения**
мг/г* %*
Традиционный Метанол 180 65 23,6±2,6 2,4 1
Субкритическая вода Вода 60 140 30,1±4,5 2,9 1,3
Субкритическая вода + аммиак 1 %-й водный раствор аммиака 60 140 43,4±3,4 4,4 1,9
С:№и1 tnjmcraf*ülui..Ж-1 UM
платами ws л рм
J6-I lfl-ä PJiW ИТ: Ml AV: 1 KL l.MB F: -РДЧ- С ESI niora >№7T]JI» ИПЧММС RH ПЧ| тЛ01ЖЦ
UXh
Iw]
I Hb
11ЯЛ
11ПГЛ
IHM
1ЮЦ
t№!
J»i.T
-1-1-1-Г-
11 in .Ii
11ШЛ 11114 I , I 111JT 111ТЛ
I 1 I I I ' I I I II I I
11Z12
113М)
10H
l№
ttm
14HS
1HO
11»
111G
HIB
11»
ЧИ
mH
MfcMhJtUi-'l-iM ilSM-lMf KT iMfrlPJ» HW i M.-JJÖSi F: [M»+tE5i™mi5Hrraj(B ИЧКЬГОРШгтниИННЗГОИП
1«:
I I
1 №
1№4
■ 1В4И
««3
1(1».J
I . 1ИИ iflHi имя. iflw-i
■■ ■■ I 11 ■■ I 11 I I I --1 ■ I I ч 4 I . I 11 I I '.,... ............ I >■■
Ч-Т 1«0
1057.3
l№iJQ
miiKirj" 11И-, над
■ ■■ ■ 11И1 ii il Ii i i ■■ 1Д ^ * !■ ■■ i ■■■■■ ■■■■■■ ■ ■ ■■ ■■ ■ ■■ ■■■ ■ ■ ■■
над
1Ш
1D№
Kfl
1ГНС
11»
111D
11»
11H
11«
HU
«teUlltH 11 -07-2*13» FT В Л AT. 1 №И.ЫЫ P (C.U) + еВДда^и dtJIHbDÜ Flirra [ИИЩ-ИИЩ
1И>Э ! н i
■ 4fr
! »
8ltl tim Slfr.1* т—i—i—i—|—i—i—i—i—|—i—i—i—r*
SIC
rao
Щ5
I ем
V—'i"-"Г SLHI
B-JC.J «ал
M3i
ОД1
NiF
:
-1—i—i—i—-—i— ВД5 MD
mil
iii—
"j" ЕМД ИМ «ГД
"f-* им
B4G
Ssö
SS5
BW
№
а
б
в
Рис. 3. Масс-спектры аралозидов А, В и С, экстрагированных из корня аралии маньчжурской в условиях субкритической воды: а - аралозид А с временем удерживания 9,45 мин; б - аралозид В с временем удерживания 11,00 мин; в - аралозид С с временем удерживания 8,81 мин. (градиентный режим). Для каждого аралозида характерны катионы [М + Н]+, [М + МН4]+ и [М + Ыа]+
Этот результат можно объяснить тем, что в субкритических условиях происходит как более эффективное проникновение растворителя в глубь мицеллы, так и частичное разрушение клеток растения, способствующее извлечению аралозидов. Добавление небольшого количества аммиака позволило перевести смесь различных солей аралозидов в водорастворимую аммонийную соль. При этом следует отметить, что и чистая вода без примеси аммиака в субкритических условиях позволяет извлечь большее количество аралозидов по сравнению с традиционным методом. Важно также, что в субкритических условиях процесс экстракции аралозидов идет в 3 раза быстрее, к тому же с использованием экологически безопасного растворителя - воды. В силу всего вышеизложенного можно говорить о преимуществах экст ракции арало-зидов в субкритической условиях по сравнению с традиционными методами.
1. Методом масс-спектрометрии в режиме электроспрей ионизации изучены продукты экстракции корня аралии маньчжурской в среде субкритической воды.
2. Наличие и концентрация аралозидов А, В и С в полученных экстрактах определены методом высокоэффективной жидкостной хроматографии с применением ВЭЖХ/МС с ионизацией электроспреем.
3. Показано, что экстракция аралозидов А, В и С в среде субкритической воды происходит без существенной изомеризации агликона.
4. Эффективность экстракции субкритической водой в статическом режиме сопоставима по эффективности с традиционным методом, а при использовании добавки аммиака превосходит традиционный метод в 1,9 раза.
Работа выполнена в научно-образовательном Эко-лого-аналитическом центре Юга России ЮФУ при финансовой поддержке Фонда СКОБ и Министерства образования РФ по российско-американской программе «Фундаментальные исследования и высшее образование» и программе «Развитие научного потенциала высшей школы» Рособразования РФ (проекты РНП 2.2.2.2.3915, ВР3С04, ВР4М04).
Литература
1. Ботанико-фармакологический словарь / под ред. Блиновой К.Ф. и Г.П. Яковлева М., 1990. 166 с.
2. Машковский М.Д. Лекарственные средства. М., 1985. Т. 1. 141 с.
3. Минина С.А., Каухова И.Е. Химия и технология фитопрепаратов. М., 2004. С. 460-464.
4. Галкин А.А., Лунин В.В. Вода в суб- и сверхкритическом состояниях - универсальная среда для осуществления химических реакций // Успехи химии. 2005. № 1. С. 24-40.
5. Walton R. Subcritical solvothermal synthesis of condensed inorganic materials // Chem. Soc. Rev. 2002. Vol. 31. P. 230-238.
6. Список принятых сокращений русских и английских терминов // Масс-спектрометрия. 2004. Т. 1, № 1. С. 77-78.
7. Мальчуковский Л.Б., Либизов Н.И. Определение три-терпеновых сапонинов в порошке и таблетках «Сапарал» // Фармация. 1971. № 2. C. 68-71.
Поступила в редакцию
8. Смит А. Прикладная ИК-спектроскопия. Основы, техника, аналитическое применение. М., 1982. С. 217-222, 300-318.
9. Сильверстейн Р., Басслер Г., Морил Т. Спектрометрическая идентификация органических соединений. М., 1977. С. 422-427.
10. Quantification of the group B soyasaponins by highperformance liquid chromatography / J. Hu [et al.] // J. Agric. Food Chem. 2002. Vol. 50. P. 2587-2594.
11. Филиппович Ю.Б. Основы биохимии. М., 1999. 380 c.
12. High-Resolution 'H and 13C NMR of Glycyrrhizic Acid and Its Esters / A. Baltina [et al.] // Chem. of Natural Compounds. 2005. Vol. 41, № 4. P. 432-435.
13. Constituents of Chenopodium pallidicaule (Canihua) Seeds: Isolation and Characterization of New Triterpene Saponins / L. Rastrelli [et al.] // J. Agric. Food. Chem., 1996. Vol. 44. P. 3528-3533.
14. A Cytotoxic Triterpene Saponin from the Root Bark of Aralia dasyphylla / Kai Xiao [et al.] // J. Nat. Prod. 1999. Vol. 62. P. 1030-1032.
2 марта 2009 г.
