CC BY
73
направленных на поиск новых клеточных продуктов и оценки их клинической эффективности [1-4].
В связи с этим, целью нашей работы явилась оценка влияния применения аллогенного цельного костного мозга на процесс сперматогенеза у «пожилых» животных.
Эксперимент проведен на 60 крысах-самцах линии Вистар в возрасте 2,5 года, разделённых на две группы (контроль и опыт). Первой опытной группе вводилось суспензия клеток цельного костного мозга. Клетки цельного костного мозга получали непосредственно перед введением. Введение клеток животным опытной группе осуществляли внутрибрюшинно, в объёме 1,0 мл, с концентрацией клеток 2*106кл/мл. Учёт результатов осуществляли через 2 месяца после введения клеток. Для оценки функционального состояния семенников определяли плотность и формы спермиев (активно-подвижные, аномальные), полученных из хвостовой части эпидиди-миса по методике Е.К. Милованова в модификации Г.И. Егоровой.
Анализ полученных данных показал, что у животных опытной группы в динамике происходит улучшение всех изученных показателей. В частности, через 2 месяца после введения клеток, концентрация сперматозоидов в опытной группе составила (млн/мл) 15,5+2,1, что в 2 раза больше, чем в контрольной - 7,7+0,6. При сравнении процента подвижных сперматозоидов установлено, что в опытной группе количество подвижных сперматозоидов в 3,4 раза выше по сравнению с контролем (22,3+2,3% и 6,5+1,2% соответственно). При сравнении процента неподвижных сперматозоидов установлено, что в опытной группе их на 18% меньше, чем в контроле (76,7+3,3% против 93,5+3,9%). Анализ данных о количестве патологически изменённых форм выявил, что в опытной группе их на 42% меньше по сравнению с контролем (12,9+1,9% и 28,75+2,6% соответственно).
Анализ полученных данных показал, что суспензия клеток цельного костного мозга способствует активации сперматогенеза у «пожилых» крыс. Кроме того, введение клеток повышает качество спермы, проявляющееся в увеличении процента подвижных сперматозоидов Выводы:
Установлено, что применение клеток цельного костного мозга улучшает качественные показатели сперматогенеза за счет увеличения количества сперматозоидов и повышения процента подвижных форм.
Список литературы:
1. Аполихин О.И., А.А.Камалов, Г.Т.Сухих, В.А.Ефремов Ксенотрансплантация обогащённых клеточных культур различных видов при экспериментальном лечении инфертильности. // Материалы Международного Конгресса по андрологии. Сочи, Дагомыс. - 2009. - С. 15 - 16.
2. Засорин Б.В., Курмангалиев О.М., Белышев А.А. Эффективность применения мультипотентных ме-зинхимальных стволовых клеток костного мозга при токсических формах нарушения сперматогенеза. // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2010. - №3, XV. - С. 29-30.
3. Курмангалиев О.М., Засорин Б.В., Белышев А.А., Насиров И.Н. Экспериментальная оценка эффективности применения эмбрионально-клеточного «коктейля» при токсических формах нарушения сперматогенеза. // Медицинский журнал Западного Казахстана - 2010 - №3(27). - С.58 - 62.
4. Засорин Б.В., Курмангалиев О.М., Ермешев Е.М. Применение клеточных культур при экспериментальном лечении инфертильности токсической природы. // Медицина и экология - 2013, №1(66), -С. 155-156.
МАСС-СПЕКТРОМЕТРИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ НАРУШЕНИЙ МЕТАБОЛИЗМА
АЦИЛКАРНИТИНОВ
До 80-х годов прошлого столетия определение врожденных патологий метаболизма органических и жирных кислот проводилось, в основном, по анализу мочи методом газовой хроматографии (ГХ) с использованием неспецифических детекторов. Идентификация метаболитов при этом осуществлялась по времени удерживания.
Объединение методов газовой хроматографии с масс-спектрометрией (МС) значительно улучшило качество анализа по определению органических кислот за счет идентификации веществ как по массе, так и по времени удерживания. Такая комбинированная методика, известная как ГХ-МС, стала золотым стандартом в обнаружении метаболических нарушений по анализу мочи [1]. Большая часть имеющихся на настоящий момент данных об органических ацидемиях и дефектах окисления жирных кислот основываются на результатах ГХ-МС-анализа мочи
Черноносов Александр Анатольевич
К.х.н, н.с. ИХБФМСО РАН, г. Новосибирск Касакин Марат Фирдависович
Инженер ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск Федорова Ольга Семеновна
Д.х.н., профессор, зав. лаб. ИХБФМ СО РАН, г. Новосибирск
пациентов. Развитие методов хроматографии и масс-спек-трометрии позволили проводить анализ, как мочи, так и плазмы крови пациентов. Для этого стали использовать высокоэффективную жидкостную хроматографию (ВЭЖХ) в сочетании с методом МС/МС [2, 3], позволяющим определять не только массу вещества, но и его характерную структуру. Разработанная методика позволила определять жирные и органические кислоты также и по сухим пятнам крови, что значительно упростило процедуру подготовки и пересылки образцов. В настоящее время таким методом ВЭЖХ-МС/МС определяется 30 органических и жирных кислот.
Целью настоящей работы являлось определение концентрации ацилкарнитинов в крови по масс-спектро-метрическому анализу сухих пятен крови и выявление нормальных значений для жителей Новосибирской области.
Материалы и методы
В скрининге нарушений метаболизма ацилкарнити-нов приняли участие 649 пациентов, наблюдавшиеся в медицинских учреждениях г. Новосибирска или пришедшие на первичный осмотр. Средний возраст пациентов составил 4,7 года, минимальный - 1 год, максимальный - 9,9 лет. Пациентов мужского пола было 437, женского - 212. Пациенты сдавали кровь путем пропитывания кровью специальной бумаги (Whatman 903 Protein Saver Card, GE Healthcare, США). Образцы крови высушивали и передавали в ИХБФМ СО РАН для масс-спектроскопического анализа.
Из поступивших сухих образцов крови на бумаге вырезали пантчером диск диаметром 3 мм из полностью пропитанной кровью области. Каждый вырезанный диск помещали в отдельную 1,5 мл пробирку и добавляли 200 мкл рабочего раствора внутренних стандартов органических и жирных кислот (Chromsystems, Германия). После чего проводили экстракцию органических и жирных кислот из анализируемых образцов, для чего пробирки помещали в термостат и инкубировали в течение 30 минут при 25 °С при постоянном перемешивании с частотой 600 оборотов в минуту.
Супернатант переносили в чистые пробирки, раствор упаривали до полного высыхания либо в концентраторе CentriVap в течение 40-45 минут при 56 °С при постоянном перемешивании, либо в термостате в течение 1,5-2 часов при 56 °С при постоянном перемешивании с частотой 350 оборотов в минуту.
После чего проводили реакцию дериватизации органических и жирных кислот. Для этого к сухому остатку
добавляли 150 мкл раствора бутанол: концентрированная соляная кислота = 7:3 (v/v), пробирки помещали в термостат и инкубировали в течение 15 минут при 56 °С при постоянном перемешивании с частотой 400 оборотов в минуту. Далее раствор бутиловых эфиров органических и жирных кислот, полученных в процесс дериватизации, упаривали до полного высыхания в концентраторе CentriVap в течение 40-45 минут при 56 °С при постоянном перемешивании. Сухой остаток растворяли в 200 мкл 80% ацетонитрила, содержащего 0,1% муравьиной кислоты.
Определение концентрации органических и жирных кислот проводили на масс-спектрометре Agilent 6410 QQQ (Agilent Technologies). Параметры анализа были следующие: объем аликвоты - 10 мкл, скорость потока элюента - 0,1 мл/мин в изократическом режиме, 50% аце-тонитрил, время анализа - 3 мин, мода измерения - положительная, количество повторов анализа (3-4), диапазон -100-1000 m/z. Параметры формирования ионов: температура газа - 300 оС, поток газа - 7 л/мин, давление в небула-йзере - 20 psi, напряжение на капилляре 3500 В. После каждого анализа в программе MassHunter автоматически проводили количественный расчет, обработку и анализ данных. Статистическую обработку данных проводили в программе Microsoft Excel.
Результаты и обсуждения
В каждой пробе были проанализировано содержание 30-ти органических и жирных кислот. Максимальные, средние и минимальные значения концентраций представлены в Таблице 1.
Границы нормальных значений концентраций метаболитов (в мкмоль/л)
Таблица 1.
Органическая или/и жирная кислота Обозначение Максимальное Минимальное значе- Среднее зна-
значение ние чение
свободный карнитин C0 156,174 0,199 29,461
ацетилкарнитин C2 167,917 1,785 20,156
пропионилкарнитин C3 12,891 0,236 1,748
малонилкарнитин C3DC 0,903 0,002 0,103
изо -/бутирилкарнитин C4 3,967 0,042 0,640
метилмалонилкарнитин C4DC 6,198 0,088 0,652
3 -гидрокси-бутирилкарнитин C4OH 0,182 0,009 0,071
изовалерил 2-метил-бутирилкарниин C5 1,083 0,011 0,133
3-гидрокси-изовалерил- / 2-метил-3 -гидрокси-бутирилкарнитин C5OH 1,295 0,012 0,172
изовалерилкарнитин C5:1 0,524 0,001 0,024
глутарилкарнитин C5DC 0,321 0,001 0,032
гексаноилкарнитин C6 1,660 0,003 0,172
октаноилкарнитин C8 10,951 0,006 0,123
октеноилкарнитин C8:1 0,524 0,001 0,057
деканоилкарнитин C10 3,069 0,002 0,093
деценоилкарнитин C10:1 2,071 0,001 0,096
додеканоилкарнитин C12 0,854 0,003 0,096
тетрадеканоилкарнитин C14 1,151 0,004 0,117
тетрадеценоилкарнитин C14:1 0,495 0,002 0,078
тетрадекадиеноилкарнитин C14:2 0,332 0,001 0,034
3 -гидрокси-тетрадеканоилкарнитин C14OH 0,275 0,000 0,016
гексадеканоилкарнитин C16 5,738 0,020 0,871
3 -гидрокси-гексадеканоилкарнитин C16OH 36,164 0,001 0,205
гексадекеноилкарнитин C16:1 0,273 0,001 0,048
3 -гидрокси-гексадекеноилкарнитин C16:1OH 0,236 0,002 0,039
стеароилкарнитин C18 3,311 0,049 0,540
олеилкарнитин C18:1 4,280 0,072 0,885
3 -гидрокси-олеилкарнитин C18:1OH 0,144 0,000 0,012
3 -гидрокси-линолеилкарнитин C18:2OH 0,077 0,001 0,013
3 -гидрокси-стеароилкарнитин C18OH 0,094 0,001 0,015
При использовании в качестве границ нормы, параметров, указанных в [4], было показано, что во всех образцах концентрации жирных и органических кислот были в пределах нормы, за исключением:
1) 20-ти случаев, когда концентрация свободного кар-нитина была ниже нормы, причем, только в 1 -ом случае - менее, чем в 2 раза, и в 11 случаях - выше нормы, в том числе, 1 раз - более чем в 2 раза;
2) 22-х случаев, когда концентрация малонилкарни-тина была выше нормы, причем в 6-ти случаях - в 2 раза:
3) 215-ти случаев, когда концентрация гексаноилкар-нитина была выше нормы, причем в 33 случаях -более, чем в 2 раза.
Снижение и превышение концентрации свободного карнитина и гексаноилкарнитина, соответственно, относятся к нарушениям обмена жирных кислот, а повышение концентрации малонилкарнитина - к нарушениям обмена органических кислот.
Низкая концентрация свободного карнитина характерна при нарушении транспорта карнитина. Поскольку для более точного определения заболевания нет данных по дополнительным параметрам, можно сделать вывод, что в 2-х случаях методом масс-спектрометрии было выявлено нарушение транспорта карнитина и в 29 случаях -подозрение на нарушение транспорта карнитина.
Высокая концентрация гексаноилкарнитина характерна при недостаточности среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы [5], поэтому дополнительными параметрами для анализа в этом случае являются концентрации октаноилкарнитина, деценоилкарнитина, деканоилкарни-тина и величина отношения [С8]/[С10] [6]. В исследуемой выборке максимальное, среднее и минимальное значения [С8]/[С10] составляли 62,62, 1,54 и 0,16, соответственно. В исследуемых образцах плазмы крови превышение концентрации октаноилкарнитина, деценоилкарнитина и де-каноилкарнитина обнаружено не было, тогда как соотношение [С8]/[С10] в 29-ти случаях было выше нормы и в 4-х случаях превышало норму более, чем в 3 раза. Одновременное превышение нормы гексаноилкарнитина и соотношения [С8]/[С10] было обнаружено в 14-ти случаях. Следовательно, в 4-х случаях методом масс-спектроскопии была выявлена недостаточность среднецепочечной ацил-КоА-дегидрогеназы и в 29 случаях - подозрение на данное заболевание. Следует отметить, что количество случаев, когда отношение [С8]/[С10] было выше нормы в 7 раз, было меньше, чем количество случаев превышения нормы гексаноилкарнитина.
Высокая концентрация малонилкарнитина характерна для заболевания «малоновая ацидемия» (или «недо-
статочность малонил-КоА-декарбоксилазы»). Для данного заболевания отсутствуют данные по дополнительным параметрам, поэтомувыявленное в 6-ти случаях методом масс-спектрометрии подозрение на малоновую ацидемию требует дополнительного подтверждения. Выводы
Масс-спектрометрическим методом проанализировано 649 образцов сухих пятен крови, в каждом из которых определен уровень 30 органических и жирных кислот. Данные статистически обработаны, получено распределение концентраций всех кислот в каждой возрастной группе и определен диапазон нормальных значений. Зафиксировано несколько случаев нарушений метаболизма органических и жирных кислот. Благодарности
Работа выполнена при поддержке Программы РАН "Фундаментальные науки -медицине", проект №41.
Список литературы:
1. Niwa T. Metabolic profiling with gas chromatography-mass spectrometry and its application to clinical medicine// J. Chromatogr. - 1986. - V. 379. - P. 313345.
2. Millington D.S., Kodo N., Norwood D.L., Roe C.R. Tandem mass-spectrometry: a new method for acylcarnitine profiling with potential for neonatal screening for inborn errors of metabolism. // J. Inherit. Metab. Dis. - 1990. V. - 13. P. - 321-324.
3. Chace D.H., Kalas T.A. A biochemical perspective on the use of tandem mass spectrometry for newborn screening and clinical testing // Clin. Biochem. - 2005. - V. 38. - № 4. - P. 296-309.
4. Хромато-масс-спектрометрическая диагностика наследственных болезней метаболизма. Новая медицинская технология. Федеральное государственное учреждение «Московский научно-исследовательский институт педиатрии и детской хирургии росмедтехнологий». Москва. 2008. Разрешение Росздравнадзора на применение ФС № 2009/241 от 29 июля 2009.
5. Chace D. H., Kalas T. A., and Naylor E. W. Use of Tandem Mass Spectrometry for Multianalyte Screening of Dried Blood Specimens from Newborns. // Clinical Chemistry - 2003. - V. 49, - P. 1797-1817.
6. Hsu H.-W., Zytkovicz T. H., Comeau A. M., Strauss A. W., Marsden D., Shih V. E., Grady G. F. and Eaton R. B. Spectrum of Medium-Chain Acyl-CoA Dehydrogenase Deficiency Detected by Newborn Screening. // Pediatrics. -2008. - V. 121, - P. e1108-e1114.
РАСПРОСТРАНЕННОСТЬ МОДИФИЦИРУЕМЫХ ФАКТОРОВ РИСКА В ЗАВИСИМОСТИ ОТ ГЕНДЕРНЫХ ОСОБЕННОСТЕЙ У БОЛЬНЫХ
ИБС В РСО-АЛАНИЯ
Датиева Агунда Юрьевна
Аспирант кафедры внутренних болезней №4 ГОУВПОСОГМА
Изучена распространенность наиболее значимых модифицируемых и частично модифицируемых факторов риска (ФР) ишемической болезни сердца (ИБС) в зависимости от гендерных особенностей на территории республики Северная Осетия-Алания. Нами были рассмотрены следующие факторы риска: артериальная гипертензия (АГ), психоэмоциональное напряжение, избыточная масса
тела/ожирение, злоупотребление алкоголем, гиперхоле-стеринемия (ГХС), гипертриглицеридемия (ГТГ), сахарный диабет (СД), курение, гиподинамия.
Проведено комплексное обследование 200 больных ишемической болезнью сердца в сочетании с артериальной гипертензией (средний возраст56,0 +0,6 года): 120 мужчин и 80 женщин. При этом установлено, что такие
