CC BY
0INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
MAHALLIY SUT ACHITUVCHI BAKTERIYALARNI IDENTIFIKATSIYA QILISH
1Abdulaxadova G.Sh., 2Zuhritdinova N.Yu., 3Qutliyeva G.J.
1PhD doktorant, O'zR FA Mikrobiologiya instituti, Toshkent
2b.f.n., kat.i.x., O'zR FA Zoologiya instituti, Toshkent 3b.f.n.,kat.i.x., O'zR FA Mikrobiologiya instituti, Toshkent https://doi.org/10.5281/zenodo.13828207
Annotatsiya. Sut achituvchi bakteriya izolyatlari Berdji (2009) aniqlagichidagi ma'lumotlarga asoslanib tahlil qilindi, shtammlarning tur mansubligi aniqlandi va fenotipik, genotipik, MALDITOF mass spektrofotometr usullariyordamida identifikatsiya qilindi. Tahli natijalariga ko'ra Pediococcus acidilactici 1G, Pediococcus acidilactici 2G, Pediococcus acidilactici P1, Lactobacillus fermentum LF1, Lactobacillus plantarum 3G, Lactobacillus brevis 4G, Lactobacillus brevis 6G shtamlari aniqlandi.
Kalit so'zlar: sut achituvchi bakteriya, identifikatsiya, probiotik, MALDI TOF mass spektrofotometr.
Abstract. Lactic acid bacteria isolates were analyzed based on data from Bergey (2009), and strains were identified by phenotypic, genotypic and MALDI TOF mass spectrophotometry methods. Based on the results of the analysis, the strains Pediococcus acidilactici 1G, Pediococcus acidilactici 2G, Pediococcus acidilactici P1, Lactobacillus fermentum LF1, Lactobacillus plantarum 3G, Lactobacillus brevis 4G, Lactobacillus brevis 6G were identified.
Keywords: lactic acid bacteria, identification, probiotic, MALDI TOF mass spectrophotometer.
Аннотация. Молочнокислые бактерии изоляты анализировали на основании данных Берджи (2009), штаммы идентифицировали фенотипическими, генотипическими и MALDI TOF масс-спектрофотометрическими методами. По результатам анализа выявлены штаммы Pediococcus acidilactici 1G, Pediococcus acidilactici 2G, Pediococcus acidilactici P1, Lactobacillusfermentum LF1, Lactobacillus plantarum 3G, Lactobacillus brevis 4G, Lactobacillus brevis 6G.
Ключевые слова: молочнокислые бактерии, идентификация, пробиотик, MALDI TOF масс-спектрофотометр.
Probiotiklar deb inson organizmning sog'lig'ini tiklo'vchi, ichak mikrobiomasining tarkibiga ijobiy ta'sir ko'rsatishi va turli patogen va shartli patogen bakteriyalar, zamburug'lar yoki viruslarga qarshi faol bo'lgan metabolitlarni sintez qilish qobiliyatiga ega bakteriyalar tushuniladi [1]. So'nggi yillarda olib borilgan tadqiqotlar shuni ko'rsatdiki, probiotiklarning ta'siri faqatgina mikrobiotani to'g'rilash bilan cheklanmasdan, [2] immunomodulyatsion funktsiyalarga va moddalar almashinuvida ham klinik samaradorlikga ega ekanligi ko'rildi [ 3]. Yangi istiqbolli probiotik shtammlarni izlash, ularning probiotikli xususiyatlarini aniqlash, shuningdek, allaqachon ma'lum bo'lgan probiotik shtammlarni o'rganish fundamental fanning muhim vazifasi hisoblanadi [4]. Sut achituvchi bakteriyalarining yangi shtammlarini ajratish va o'rganishga qaratilgan tadqiqotlar butun dunyoda keng tarqalgan dolzarbd masala [5]. Istiqbolli shtammni izlash va tanlashning birinchi va muhim bosqichlaridan biri uning taksonomikligini aniqlash, shtammni tur darajasida to'g'ri ajratilgan mikroorganizmning xavfsizligi, kelib chiqishi, yashash muhiti va
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
fiziologik xususiyatlari haqida oldindan tushunchaga ega bo'lish imkonini beradi [6]. Birinchi marta Orla Jensen (1919) sut kislotasi bakteriyalarini tasniflash uchun asos bo'lgan monografiyani nashr etdi [7]. Laktobakteriyalar streptokokklar, laktokokklar va enterokokklar bilan bir qatorda sut achituvchi bakteriyalar guruhining eng ko'p o'rganilgan vakillaridan biri. Bakteriyalarning zamonaviy filogenetik tasnifiga ko'ra, Lactobacillus j insi bir yuz ellikdan ortiq tur va kichik turga ega [8] Probiotikli biologik faol qo'shimcha sifatida sotuvda eng keng tarqalgan bakteriya avlodlari Lactobacillus, Bifidobacterium, Streptococcus va Enterococcus hisoblanadi [9]. Tadqiqotchilar 16S rRNK gen sekvensiyasi yordamida SABlarining 14 ta izolatini: Enterococcus mediterraneensis, Lactobacillus fermentum va Streptococcus lutetiensis deb aniqlashdi. Izolyatlarning probiotik xususiyatlarini o'rganishdi [10]. ^nueBa Ä izlanishlari natijasida turli manbalardan ajratilgan laktobakteriyalar turlarini identifikatsiyalash uchun turlarga xos primerlar yordamida multipleks PCR asosida laktobakteriyalarni genetik identifikatsiyalash usuli ishlab chiqdi [11]. Sut achituvchi bakteriyalarning antioksidant, antimikrob, yallig'lanishga qarshi va detoksifikatsiya qiluvchi xususiyatlariga asoslangan molekulyar mexanizmlar hozirgi vaqtda probiotiklar tanlovini kengaytirmoqda[12].
Maqsad. Mahalliy sut achituvchi bakteriya izolyatlarini tur mansubligini aniqlash, fenotipik, genotipik, MALDI TOF mass spektrofotometr usullari yordamida identifikatsiya qilish.
Tadqiqot metodologiyasi. MALDI -TOF mass spektrofotometr yordamida identifikatsiya qilish. Ajratib olingan izolyat namunalari MALDI-TOF Mass spectrophotometry EXS 2600 (Zybio) uskunasi yordamida identifikatsiya qilindi. Tekshirilayotgan izolyatlar MRS qattiq ozuqa muhitida 37 °C haroratda 24 soat davomida termostatda o'stirildi. Tajriba davomida qo'llaniladigan asbob-uskunalar tayyorlab olindi: sentrifuga, vortex, tomizgich, ilmoq, reagentlar to'plami (Matrix solution, Microorganism lysate I, Microorganism lysate II) ultrasof suv, suvsiz etanol. Identifikatsiya jarayonini amalga oshirish uchun toza va alohida koloniya tanlab olindi. Sentrifuga probirkalariga 300 mkl ultrasof suv solindi. 1-5 mg alohida koloniyalar olinib, sentrifuga probirkasiga solindi. To'liq suspenziya holatiga kelgunicha vortex qurilmasida aralashtirildi. Keyin, 900 mkldan suvsiz etanol solib chiqildi, aralashtirildi. 2-3 daqiqa davomida 12000 ayl/min tezlikda sentrifuga jarayoni amalga oshirildi. Supernatant qismi olib tashlandi. Intakt qismi 5 daqiqa davomida xona haroratida quritildi. 20 mkldan Microorganism lysate I reagenti qo'shildi va yaxshilab aralashtirildi. Tajribaning keyingi bosqichida 20 mkl Microorganism lysate II solindi, pipetka yordamida yaxshilab aralashtirildi. 2 daqiqa davomida sentrifuga qilindi. MALDI-TOF plastinkasi 96 % spirt bilan tozalandi. 1 mkldan supernatant qismi plastinka katakchalariga joylandi. Plastinkalar quritildi 1 mkl "Matrix solution" reagent tomizildi. Plastinkalar quritildi va MALDI-TOF qurilmasiga joylandi va identifikatsiya qilindi.
Molekulyar-genetik identifikatsiyalash
SAB izolyatlarini genotipik identifikatsiyalash uchun 16s rRNK ketma-ketligi tahlili o'tkazildi. Izolyatsiyaning genomik DNKsi GeneJET genomik DNKni tozalash to'plami (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, AQSh) yordamida tozalandi. PZR amplifikatsiyasini amalga oshirishda 16S rRNK genining universal oligonukleotid praymerlardan foydalanildi: 27F (AGAGTTTGATCMTGGCTCAG), va 1492 R (GGTTACCTTGTTACGACTT).
Bakteriya shtammlaridan ajratilgan DNK namunalari PZR-amplifikatsiyasi GenPak® PCR MasterMix kitida amalga oshirildi. Bunda, reaksiya umumiy 20 mkl miqdorida tayyorlanib, 10 mkl Dilution, 8,2 mkl 2 marta ditillangan suv, 0,4 mkldan (27F va 1492R) universal praymer va 1 mkl DNK namunalaridan iborat.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
16S rRNK genlari ketma-ketligi NCBI ma'lumotlar bazasiga joylandi va registratsion raqamlar olindi. Mahalliy SABlarning 16S rRNK geni sekvenirlash natijalari asosida filogeneik daraxtni tuzish amalga oshiriladi [13].
Taxlil va natijalar. MALDI-TOF MS ma'lumotlar bazasi yordamida bakteriyalar, patogen bakteriyalar zamburug'larni aniqlash tez va samarali usullardan biri hisoblanadi. Ajratib olingan SAB izolyatlarini MALDI-TOF MS yordamida identifikatsiya qilindi va natijalar olindi (1. -jadval).
1 -jadval
№ Na'munalar Tahlil natijalari
1 P.spp 1G Pediococcus acidilactici 1G
2 P. spp 2G Pediococcus acidilactici 2G
3 P. spp P1 Pediococcus acidilactici P1
4 L.spp LF1 Lactobacillus fermentum LF1
5 L.spp 3G Lactobacillus plantarum 3G
6 L. spp 4G Lactobacillus brevis 4G
7 L.spp 6G Lactobacillus brevis 6G
Molekulyar-genetik identifikatsiyalash
№ Shtammlar GenBank
1 Pediococcus acidilactici 1G OQ427657 https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OQ427657
2 Pediococcus acidilactici 2G OQ427822 https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OQ427822
3 Lactiplantibacillu s plantarum 3G OQ433912 https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OQ433912
4 Levilactobacillus brevis 4G OQ434195 https:// www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/OQ434195
Xulosa va takliflar. Mahalliy sut achituvchi bakteriyalarning identifikatsiyalash natijalariga ko'ra Pediococcus acidilactici 1G, Pediococcus acidilactici 2G, Pediococcus acidilactici P1, Lactobacillus fermentum LF1, Lactobacillusplantarum 3G, Lactobacillus brevis 4G, Lactobacillus brevis 6G shtamlari ekanligi aniqlandi. fenotipik, genotipik, MALDI TOF mass spektrofotometr usullari yordamida identifikatsiya qilinganda, natijalar bir hil ekanligi va bir -biriga mutanosib ekanligi aniqlandi. Foydalanilgan adabiyotlar ro'yxati:
1. Ganzle M. G. Lactic metabolism revisited: metabolism of lactic acid bacteria in food fermentations and food spoilage // Current Opinion in Food Science. - 2015. - V. 2. - P. 106117.
2. Azad M. A. K., Sarker M., Li T., Yin J. Probiotic species in the modulation of gut microbiota: an overview // Bio Med research international. V. 2018.
3. He M., Shi B. Gut microbiota as a potential target of metabolic syndrome: the role of probiotics and prebiotics // Cell & bioscience. - 2017. - V. 7, № 1. - P. 1-14.
INTERNATIONAL SCIENTIFIC AND PRACTICAL CONFERENCE "STATUS AND DEVELOPMENT PROSPECTS OF FUNDAMENTAL AND APPLIED MICROBIOLOGY: THE VIEWPOINT OF YOUNG SCIENTISTS" _25-26 SEPTEMBER, 2024_
4. Цапиева А. Н. Дисс. на соискание ученой степени канд. Биол. Наук// Санкт-Петербург 2020.
5. T. Kuda, T. Yazaki, M. Ono, H. Takahashi, B. Kimura. In vitro cholesterol-lowering properties of Lactobacillus plantarum AN6 isolated from aji-narezushi// Letters in Applied Microbiology. - 2013. - Vol. 57, № 3. - P. 187-192.
6. Л.Г.Стоянова. Выделение и идентификация молочнокислых бактерий Lactococcus lactis subsp. lactis с антимикробным действием// Известия ТСХА, выпуск 5, 2017 год стр. 41 -61.
7. Quinto, E.J.; Jimenez, P.; Caro, I.; Tejero, J.; Mateo, J.; Girbes, T. Probiotic Lactic Acid Bacteria: A Review. Food Nutr. Sci. 2014, 5, 1765-1775.
8. V S. Kaewnopparat, N. Dangmanee, N. Kaewnopparat, T. Srichana, M. Chulasiri, S. Settharaksa. In vitro probiotic properties of Lactobacillus fermentum SK5 isolated from vagina of a healthy woman // Anaerobe. - 2013. - V. 22. - P. 6-13.
9. Selvaraj, S., and Gurumurthy, K. (2023). An overview of probiotic health booster-kombucha tea. Chin. Herb. Med. 15, 27-32. doi: 10.1016/j.chmed.2022.06.010
10. Al-Shimaa Ibrahim Ahmed l, Gihan Mohamed El Moghazy , Tarek Ragab Elsayed , Hanan Abdel Latif Goda , Galal Mahmoud Khalafalla.-Molecular identification and in vitro evaluation of probiotic functional properties of some Egyptian lactic acid bacteria and yeasts// J Genet Eng Biotechnol 2021 Aug 5;19(1):114.
11. Цапиева А. Н.Микробиологический и молекулярно-генетический анализ молочнокислых бактерий как перспективных пробиотиков. Дисс. Санкт-Петебрург - 2020. Стр 86.
