CC BY
75
УДК 575.22
Локус agnostic дрозофилы: вовлеченность в становление когнитивных нарушений при синдроме Уильямса
Е. А. Никитина1,2*, А. В. Медведева1,3, Г. А. Захаров1,3, Е. В. Савватеева-Попова1,3 1Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, 199034, Санкт-Петербург, наб. Макарова, 6 2Российский государственный педагогический университет, 191186, Санкт-Петербург, наб. реки Мойки, 48
3Санкт-Петербургский государственный университет, 199034, Санкт-Петербург,
Университетская наб., 7-9
*E-mail: 21074@mail.ru
Поступила в редакцию 16.07.2013
После доработки 10.04.2014
РЕФЕРАТ Молекулярная основа патологических процессов, влекущих развитие геномных болезней, едина у высших беспозвоночных и млекопитающих. Поскольку когнитивные расстройства при такой геномной болезни, как синдром Уильямса, вызываются гемизиготностью по гену limkl, то может ли созданная нами на дрозофиле модель этого синдрома с привлечением аллелей дикого типа и мутантов локуса agnostic, несущего ген limkl, способствовать анализу двух диагностических признаков триады когнитивных нарушений синдрома Уильямса? К ним относятся дефектность зрительно-пространственной ориентации и необычайно высокая степень сосредоточенности на лицах при внутрипарных взаимодействиях с незнакомыми. Подходом к изучению первого симптома может быть анализ локомоторного поведения личинки, при котором реализуется исследование окружающей среды, непременно вовлекающее зрительно-пространственную ориентацию. Подходом к изучению второго симптома может быть анализ самого естественного для взрослых особей дрозофилы контактов самца и самки при реализации полового ритуала, первым этапом которого является ориентация самца по отношению к самке и преследование ее при постоянной фиксации на образе преследуемой. Решению данных вопросов и посвящено данное исследование. Моделирование синдрома Уильямса с привлечением мутантных и спонтанных вариантов локуса agnostic позволило выявить влияние изменения структуры гена limkl на локомоторные и когнитивные проявления.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА дрозофила, локомоторная активность, обучение, память, синдром Уильямса, LIMK1. СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ ИО - индекс обучения; ИУ - индекс ухаживания; УРПУ - условно-рефлекторное подавление ухаживания.
ВВЕДЕНИЕ
На протяжении последних 20 лет считалось, что одной из самых привлекательных моделей, позволяющих напрямую связать гены, мозг и поведение, является синдром Уильямса [1, 2]. К возникновению синдрома приводит делеция протяженностью 1500 т.п.н. в районе 7q11.23, специфическая архитектура которого предрасполагает к неравной рекомбинации. В деле-цию попадает около 20 генов, и их гемизиготность проявляется как нарушение развития, характеризующееся кардиоваскулярными проблемами, специфическими, эльфоидными чертами лица и несколькими типичными неврологическими аномалиями и когнитивными особенностями [3]. Гемизиготность по гену LIM-киназы 1 (КЕМК1 - ключевой фермент ремоде-
лирования актина) вызывает когнитивные нарушения. Они описываются триадой проявлений: 1) резко выраженный дефект зрительно-пространственного ориентирования; 2) промежуточный, варьирующий в зависимости от сложностей языковой культуры вербально-лингвистический дефект; 3) необычайно высокая пристальность взора - прикованность к лицам.
Эксперименты на высших животных имеют крайне высокую стоимость, поэтому для поиска и тестирования лекарственных препаратов, способных корректировать возникающие нарушения, требуются простые животные модели.
Можно ли в этих целях использовать дрозофилу? С одной стороны, функции генов болезней человека
часто устанавливают по характеру проявления мутаций в гене дрозофилы, когда его последовательность такая же, как и выявленная для гена человека. С другой стороны, у дрозофилы известны все гены, собранные у млекопитающих вместе в одном критическом районе, входящем в делецию при синдроме Уильямса (напомним, что ген frizzled-9 был впервые описан у дрозофилы). Несмотря на другой способ эволюционной организации генома дрозофилы, при котором эти гены находятся в разных хромосомах, подход к анализу действия конкретного гена в генезе синдрома Уильямса возможен при следующих условиях: 1) должны быть известны мутации данного гена, ге-мизиготность по которым приводила бы у дрозофилы к проявлению мутантного фенотипа; 2) архитектура района хромосомы, в котором локализован ген дрозофилы, может предрасполагать к возникновению хромосомных перестроек за счет неравной рекомбинации; 3) в районе локализации гена должна быть зарегистрирована повышенная частота рекомбинации, что может приводить к спонтанной генерации деле-ций или других перестроек. Это должно выражаться в специфичном для района полиморфизме в линиях дикого типа. Всем этим условиям удовлетворяет обнаруженный и охарактеризованный нами локус agnostic, несущий ген, кодирующий LIMK1.
Локус agnostic был обнаружен в районе 11B Х-хромосомы при проведении целенаправленного скрининга температурочувствительных (ts) мутаций, индуцированных этилметансульфонатом (ЭМС), которые могли бы нарушать активность ферментов синтеза и распада сАМР [4]. У мух с мутацией agnts3 наблюдается необычайно высокая активность Са2+/кальмодулин-зависимой фосфодиэстеразы 1 [5]. Гетерозиготы по делеции Df(1)368 (обнажающей этот район) и Df(1)112 (изолированной нами по признаку ts-летальности в сочетании с agnts3) также гибнут при развитии при 29°С, т.е. мутантный фенотип проявляется, как и при синдроме Уильямса, в гемизигот-ном состоянии. Молекулярно-генетические исследования показали, что ген agnostic кодирует фермент LIMK1, содержащий повтор из двух LIM-доменов, фланкированный протяженными АТ-богатыми повторяющимися последовательностями (The National Centre for Biotechnology Information, NCBI). В этом районе наблюдается повышенная частота неравной рекомбинации, чем и обусловлен ярко выраженный полиморфизм у линий дикого типа Canton-S (CS), Berlin и Oregon-R (Or-R) [6-8].
Таким образом, ген agnostic в силу своего строения и нуклеотидного окружения может служить генетическим резервом полиморфизма и быть удобной моделью геномных болезней, таких, как синдром Уильямса. Если так, то может ли эта модель спо-
собствовать анализу таких двух диагностических признаков триады когнитивных нарушений при синдроме Уильямса, как дефектность зрительнопространственной ориентации и необычайно высокая степень сосредоточенности на лицах при внутрипар-ных взаимодействиях с незнакомыми?
Ответ на первый вопрос мог бы дать анализ локомоторного поведения личинок, при котором одновременно реализуется исследование окружающей среды, непременно вовлекающее зрительнопространственную ориентацию, и питание, достигаемое при ползании личинки по субстрату. Второй вопрос также можно решить при анализе самого естественного для взрослых особей дрозофилы контакта самца и самки при осуществлении полового ритуала, первым этапом которого является ориентация самца по отношению к самке и преследование ее, сочетающее как двигательную активность, так и постоянную фиксацию на образе преследуемой.
В настоящей работе показаны изменения параметров двигательной активности личинок и резкие нарушения траекторий движений при ориентации в пространстве у самцов Oregon-R и agnts3. У имаго этих же линий выявлены сильные дефекты обучения и памяти при условно-рефлекторном подавлении ухаживания за счет резко повышенной ориентации по отношению к партнеру и его преследованию.
экспериментальная часть
Линии дрозофилы
В работе использовали линии, проявляющие полиморфизм в районе локализации локуса agnostic (Х-хромосома, 11B).
1. Линия дикого типа Canton-S (CS), на генетическом фоне которой поддерживается температурочувствительная (ts) мутация по локусу agnostic - agnts3.
2. Линия дикого типа Berlin, выделенная из природной популяции Берлина и имеющая существенные нарушения регуляции гена limkl.
3. Линия дикого типа Oregon-R (Or-R). ПЦР-картирование гена limkl выявляет отсутствие фрагмента между праймерами, ограничивающими район, куда попадают оба LIM-домена и часть PDZ-домена.
4. agnts3 - мутант по содержащему ген limkl локусу agnostic, несущий вставку 1.7 т.п.н., удаленную приблизительно на 1 т.п.н. от З'-нетранслируемой области гена limkl в области локализации А/Т-богатого района.
Изучение двигательной активности личинок
Локомоторное поведение личинок дрозофилы изучали при помощи оригинальной автоматизированной конструкции, созданной Г.А. Захаровым
и Т.Л. Паялиной (Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН) на основе установки для регистрации локомоторного поведения имаго дрозофилы, сконструированной Н.Г. Камышевым и соавт. [9]. Для регистрации локомоторного поведения личинок использовали круглые камеры диаметром 20 мм. Перемещение личинки отслеживали с помощью видеокамеры Logitech QuickCam. Для автоматизированной регистрации поведения использовали оригинальную компьютерную программу, разработанную Г.А. Захаровым и Н.Г. Камышевым. Длительность эксперимента 1 ч, температура в камерах 23-24°С.
Для анализа периодов покоя и движения общую запись разбивали на кванты, равные 1 с. Затем вычисляли скорость движения личинки на данном кванте. Если полученное значение было меньше порогового (0.5 мм/с), то считали, что личинка в течение данного кванта времени находилась в покое, в противном случае - личинка двигалась. Соседние кванты с одинаковым характером движения объединяли, формируя периоды движения и покоя.
Для анализа динамики параметров локомоторной активности общее время записи разделяли на интервалы длиной 300 с. Каждый период покоя или движения считали принадлежащим тому интервалу, на котором он начался. Для каждого интервала также считали частоту побежек (количество инициаций движения за 100 с) и индекс активности (доля времени, проведенного в движении). Анализировали не менее 25 личинок каждой линии. Статистическую значимость различий между экспериментальными группами определяли с помощью дисперсионного анализа по Краскелу-Уоллису с последующим множественным сравнением средних рангов для всех экспериментальных групп. Распределение траекторий сравнивали с использованием парного t-критерия для долей. Статистическую значимость всех различий рассчитывали при уровне значимости p < 0.05.
Оценка способности к обучению и сохранению памяти
Для выработки условно-рефлекторного подавления ухаживания (УРПУ) 5-суточного самца тестируемой линии, не имеющего опыта полового поведения, помещали в экспериментальную камеру из оргстекла (диаметр - 15 мм) с оплодотворенной 5-суточной самкой Canton-S и оставляли на 30 мин (тренировка). Обучение и память тестировали сразу (0 мин) и через 3 ч (180 мин) после тренировки, используя новых оплодотворенных самок Canton-S в возрасте 5 сут. В качестве контроля использовали самцов, не имеющих опыта полового поведения (наивных). Этограмму поведения самца регистрировали в течение 300 с, фиксируя время начала отдельных эле-
ментов ухаживания (ориентация, вибрация, лизание, попытка копуляции), а также время исполнения элементов, не связанных с ухаживанием (побежка, прининг, покой). Регистрацию начинали через 45 с после помещения мухи в камеру. Для расшифровки и анализа данных использовали специально разработанные компьютерные программы (автор программ -Н.Г. Камышев). Вычисляли индекс ухаживания (ИУ) для каждого самца, т.е. время ухаживания самца за самкой, выраженное в процентах от общего времени наблюдения. Для количественной оценки результатов обучения вычисляли индекс обучения (ИО) по следующей формуле:
ИО = [ИУН - ИУТ]/ИУН х 100% =
= (1 -ИУТ/ИУН) х 100%,
где ИУН и ИУТ - средние индексы ухаживания в независимых выборках самцов, не имеющих опыта полового поведения, и самцов, прошедших тренировку. Статистическую обработку результатов проводили при помощи рандомизационного анализа [10-12].
результаты и обсуждение
Суммарные отличия параметров локомоторной активности
Наиболее общим параметром, отражающим локомоторную активность личинок, является индекс активности, представленный на рис. l.
Линия CS имеет более высокий индекс активности (0.34), чем все другие линии. Это заметно по медиане и обоим квартилям. Статистически значимых различий между линиями agnts3, Berlin и Or-R по этому параметру не выявлено.
Изменения индекса активности могут происходить за счет изменения частоты совершения побежек и их длительности. Межлинейные различия по частоте побежек полностью аналогичны различиям в индексе активности. Это значит, что изменение индекса активности в основном можно объяснить снижением частоты побежек, однако могут существовать и различия в длительности побежки.
По этому параметру линия CS также отличается от всех остальных линий. Линия CS характеризуется большим средним временем побежки. Кроме того, выявлено отличие линии Berlin от Or-R и agnts3, которого не наблюдали при рассмотрении индекса активности.
Следующий параметр, независимый от рассмотренных ранее, - скорость побежки. Наибольшие значение скорости побежки также зафиксировано у личинок CS. Далее следует линия agnts3, затем
35 30 25 20 g 15 10 5 0
CS Berlin Or-R agn'1
Рис. 1. Суммарные параметры локомоторной активности личинок. 1 - отличие от CS; 2 - отличие от линии Berlin; 3 - отличие agnts3 от Or-R. Дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису с последующим множественным сравнением средних рангов для всех экспериментальных групп, p < 0.05
Berlin и Or-R. Такое же распределение имеют оба квартиля.
Временная динамика параметров локомоторной активности
Временная зависимость параметров локомоторной активности представлена на рис. 2. Личинки CS активно движутся в первый момент после их помещения в экспериментальные камеры. Медиана индекса активности составляет примерно 0.55. В дальнейшем активность плавно снижается. Начиная с 40-й мин эксперимента медиана индекса активности составляет 0.3 и далее не меняется.
Личинки линий Berlin и agnts3 в нормальных условиях характеризуются существенно более низким уровнем подвижности, чем CS. Медиана индекса активности составляет 0.1-0.15. Различия значимы вплоть до 25-й мин эксперимента и на 35-й мин. Затем различия исчезают вследствие падения активности личинок CS. Мутанты agnts3 имеют еще более низкую активность, отличия от CS статистически значимы в течение всего эксперимента. Линия Or-R изначально имеет более низкую подвижность, чем CS, хотя при этом она выше, чем у Berlin и agnts3. В ходе эксперимента активность личинок Or-R быстро падает, и начиная с 30-й мин значимо отличается от активности личинок CS.
Теперь рассмотрим подробно параметры, вносящие вклад в изменение индекса активности. Динамика частоты побежек сходна с динамикой индекса активности. Линия CS характеризуется достаточно большой частотой побежек (медиана примерно 5.5 х 10-2 Гц), которая плавно снижается и достигает приблизительно 3.6 х 10-2 Гц к концу эксперимента.
Линия Or-R изначально имеет такую же частоту по-бежек, как и CS (на 5-й мин эксперимента она статистически значимо выше, чем у Berlin и agnts3). Частота побежек быстро падает и к 30-й мин эксперимента становится ниже, чем у CS. Линия agnts3 имеет более низкую частоту побежек, чем CS в течение всего эксперимента. Линия Berlin изначально имеет более низкую частоту побежек, чем CS, однако после 25-й мин эти различия исчезают.
Таким образом, наибольшими по сравнению с CS дефектами характеризуется линия agnts3. Заметно также различие в динамике активности линий Berlin и Or-R. Более низкая подвижность Or-R связана с быстрым падением активности в ходе эксперимента. Линия Berlin имеет изначально более низкую активность, но она падает медленнее, чем у CS, поэтому во второй половине эксперимента статистически значимые различия исчезают.
Весьма интересной оказалась динамика продолжительности побежки. Мухи линии CS в течение всего эксперимента (за исключением первых 5 мин) имеют практически постоянное время побежки, равное 5 с. Линия Berlin также сохраняет постоянную длительность побежки, равную 4.5 с (различия статистически значимы до 55-й мин). Линия Or-R изначально имеет практически такую же длительность побежки, как и CS, и значимо большую, чем у Berlin. В интервале с 20-й по 25-ю мин длительность побежки резко падает и остается стабильной на уровне 2.5 с. Линия agnts3 до 55-й мин имеет такую же длительность побежки, как и CS. Различия наблюдаются только на 60-й мин. В ряду точек (5-15, 25, 35 мин) длительность побежки agnts3 статистически значимо выше, чем у Berlin. Значимых отличий от линии Or-R не обнаружено.
§
Я
i
Время, мин
0.40
0.38
0.36
!3 2 1
Canton-S' Berlin *
Oregon-R
agnts3
•-!.......I
3 1
......!...........
■!
12
Время, мин
5 10 15 20 25 30 35 40 45 50 55 60
Время, мин
Рис. 2. Временная динамика индекса активности и скорости побежки личинок. Точки показывают медианы распределений. 1 - отличие от CS; 2 - отличие от линии Berlin; 3 - отличие agnts3 от Or-R. Дисперсионный анализ по Краскелу-Уоллису с последующим множественным сравнением средних рангов для всех экспериментальных групп, p < 0.05
В начале эксперимента личинки линии CS имеют самую высокую скорость движения (порядка 0.45 мм/с), которая достаточно быстро снижается и достигает 0.4 мм/с к концу. Линия Berlin изначально имеет более низкую скорость движения, чем CS (порядка 0.36 мм/с). Но при этом скорость движения не падает, а, напротив, слегка возрастает к концу эксперимента. Поэтому, начиная с 40-й мин эксперимента, различия между Berlin и CS исчезают. Линия Or-R в течение всего эксперимента имеет более низкую скорость движения, чем CS (0.38 в начале и около 0.34 мм/с к концу). На 50-й и 60-й мин зафиксированы статистически значимые отличия от линии Berlin. При этом общая
скорость побежки у линий Berlin и Or-R отличается статистически значимо в течение всего эксперимента. Линия agnts3 имеет высокую скорость побежки. С 10-й по 50-ю мин подобные отличия от линии CS отсутствуют. В целом ряду точек наблюдаются отличия от линий Berlin (55-15, 25-35, 60) и Or-R (10-50).
Таким образом, изучение временной динамики параметров локомоторной активности показало, что индекс активности личинок и частота побежек падают в ряду CS ^ Berlin ^ Or-R ^ agnts3. Причем у Berlin низкие значения индекса активности сохраняются в течение всего эксперимента, в то время как Or-R характеризуется очень быстрым падением изначаль-
Рис. 3. Образцы классов треков. 1 - полностью заполняющие экспериментальную камеру - все доступное для передвижения пространство; 2 - с незначительными дефектами заполнения - передвижения в пространстве; 3 - со значительными дефектами передвижения в пространстве; 4 - не полностью очерченная окружность движений в пространстве; 5 - не имеющие полностью очерченной окружности и со значительными дефектами передвижения в пространстве;
6 - с ярко выраженными дефектами передвижения в пространстве
но высокого индекса активности. По длительности побежки наибольшее отличие демонстрирует линия Or-R, в то время как agnts3 ближе к дикому типу. По-видимому, именно это перекрестное изменение длительности и частоты побежки приводит к отсутствию различий в индексе активности между линиями Berlin, Or-R и agnts3. Скорость побежки падает в ряду CS agnts3 Berlin ^ Or-R.
Распределение по форме траекторий движения (треков)
Характеристика способности к зрительнопространственному ориентированию, т.е. того, как животное способно ориентироваться в окружающей среде при реализации исследовательской активности и прекращает ее с течением времени, может быть получена при анализе треков (траекторий движения). Все проанализированные треки были разделены на шесть классов. Характерный вид треков каждого класса представлен на рис. 3.
Распределение треков личинок по классам выявляет существенные межлинейные различия. Наиболее заметно снижение количества треков класса 1 примерно в 3 раза у Berlin, Or-R и agnts3 по сравнению с CS (рис. 4). У линии Berlin статистически значимо возрастает количество треков классов 3 и 6.
У линии Or-R также достоверно увеличивается только количество треков класса 4. У линии agnts3 наблюдается уменьшение треков класса 2 и заметное возрастание количества треков класса 3.
Таким образом, каждая линия имеет свойственные ей дефекты локомоторного поведения. Для линии Berlin характерно снижение индекса активности и нарушение распределения треков. У линии Or-R наблюдается дефект спонтанной активности, что выражается в быстром падении индекса актив-
ности с течением времени. Мутанту agnts3 свойственно падение индекса активности при сохранении скорости движения. Все эти нарушения могут свидетельствовать о существенных дефектах зрительнопространственного ориентирования, проявляющихся у линий Berlin, Or-R и agnts3.
Изучение двигательной активности имаго и ее вклада в когнитивные способности
Регистрация поведения при условно-рефлекторном подавлении ухаживания позволяет вычислять индекс обучения (ИО) не только на основе учета всех элементов неполового (двигательная активность, прининг, отдых) и полового поведения (ориентация/ преследование, вибрация крылом - брачная песня, тэппинг, ликинг, попытка копуляции), но и анализировать записанные этограммы поведения отдельно для каждого параметра. Рис. 5 иллюстрирует, что, как показано ранее, не только у мутантов agnts3 [8], но и у самцов линии Oregon-R [13] драматически нарушены процессы обучения и формирования среднесрочной 3-часовой памяти.
■ 6 \
□ 5 О
4 Г
□ 3 Q
□ 2 &
■ Г е
CS
Berlin
Or-R
agnts
Рис. 4. Сравнение распределений треков по классам. 1 - отличие от CS; 3 - отличие адпк3 от Or-R. Парный /-критерий для долей, р < 0.05
2
3
4
5
6
3
і
<и
т
Ю
О
и
X
<и
ч
х
X
Обучение и среднесрочная память (все элементы ухаживания)
100
80 -60 40 20 0 -20
Berlin Oregon-R agn
і----------------------------1
ts3
Обучение и среднесрочная память (ориентация/преследование)
100
80
| 60
ю о
и 40
ш ч
^ 20 0
*
Л
CS
Berlin Oregon-R agn,!
■ Тест сразу после тренировки (обучение).
□ Тест через 3 ч после тренировки (память).
□ Тест сразу после тренировки (обучение). и Тест через 3 ч после тренировки (память).
Рис. 5. Дефекты ориентации и преследования при нарушениях обучения и памяти. * - отличия от CS, р < 0.05, двусторонний тест рандомизации
Если вычислить индекс обучения с учетом какого-либо одного элемента полового поведения, то можно определить, за счет чего возникают дефекты обучения и памяти. Оказалось, что основной вклад в общее подавление ухаживания вносит подавление ориентации/преследования. По данному параметру самцы Oregon-R и agnts3 оказались неспособными к обучению - сразу после тренировки выработки условнорефлекторного подавления ухаживания не происходило. Через 3 ч после тренировки индекс обучения сохранялся на том же уровне и также статистически значимо отличался от ИО у Canton-S. Из рис. 5 видно, что дефекты обучения и памяти у линий Oregon-R и agnts3 объясняются нарушениями ориентации/преследования.
Рассмотрим это подробнее, уделяя внимание такому показателю локомоторного поведения имаго при внутрипарном взаимодействии, как двигательная активность самцов, не зависящая от полового поведения. Как следует из рис. 6, в контроле, у наивных самцов линий Oregon-R и agnts3, двигательная активность статистически значимо выше, чем у линии дикого типа CS; сразу после тренировки и через 3 ч после нее уровни активности были сопоставимы с уровнями у самцов CS.
Что касается связанной с половой деятельностью активности - ориентации/преследования (внутри-парное взаимодействие самца и самки), то она в 2 раза меньше у самцов Berlin и Oregon-R, но в 2 раза выше
уровня дикого типа у самцов agnts3. Именно эта форма активности должна резко уменьшаться после тренировки, когда наблюдается условно-рефлекторное подавление ухаживания, проявляющееся в резком уменьшении доли связанной с половой деятельностью активности и резком же возрастании доли обычной двигательной активности. Это и наблюдается сразу после тренировки у самцов CS, Berlin и Oregon-R, но не у мутантов agnts3, у которых активность, связанная с половой деятельностью, четырехкратно превышает таковую у CS, что свидетельствует о дефектности обучения. Через 3 ч после тренировки, когда показатели ориентации/преследования могут слегка падать, как у CS, у agnts3 ориентация/преследование превышает уровень линии CS в 2 раза. При этом вклад данного компонента в традиционно рассчитываемые индексы ухаживания составляет у линии дикого типа CS 35% (обучение) и 42% (память), у линии дикого типа Berlin - 33% (обучение) и 34% (память), у линии дикого типа Oregon-R - 50% (обучение) и 40% (память), а у мутантов agnts3 - 85% (обучение) и 83% (память).
Таким образом, каждая линия проявляет свойственное ей соотношение двух форм активности. По-видимому, это дает хорошую возможность для тестирования диагностического признака из триады когнитивных отклонений при синдроме Уильямса -пристальной фиксации на лицах, в данном случае на объекте ухаживания. Кроме того, такой способ
*
*
*
Контроль
Тест сразу после тренировки
80
60
40-
20
0
100
80
60
40
20
0
Тест через 3 ч после тренировки
100
80 -
60
і—
40
20
. 0
CS Berlin Or-R agnts
CS Berlin Or-R agnts
CS Berlin Or-R agnh
□ Двигательная активность, не связанная с половым поведением.
□ Ориентация/преследование (двигательная активность, связанная с половым поведением).
Рис. 6. Доли двигательной активности, связанные и не связанные с половым поведением сразу и через 3 ч после тренировки. * - отличие от CS, aR < 0.05, односторонний тест рандомизации
анализа позволяет учитывать и компонент обучения (индивидуального опыта). Напомним, что при синдроме Уильямса повышенная гиперсоциализация -фиксация взгляда на лицах незнакомцев - не служит установлению прочных контактов с ровесниками, товарищами по школе, обретению друзей. Иными словами, происходит постоянное обращение к одному и тому же стимулу - лицу, без правильной интерпретации ответных реакций.
Полученные нами результаты позволяют утверждать, что у самцов Oregon-R и agnts3 выявлены когнитивные дефекты, обусловленные недостаточным подавлением ориентации/преследования (взаимодействия с партнером). Дефекты ориентации проявляются уже на стадии личинки, у личинок самцов при исследовании окружающей среды наблюдаются резкие нарушения траекторий движения в пространстве и временной динамики индекса активности и частоты побежек личинок.
заключение
Линии дрозофилы, несущие разные варианты локу-са agnostic с изменениями в регуляторных и структурных районах гена, кодирующего LIM-киназу 1 (LIMK1), использованы для моделирования делеци-онного синдрома Уильямса человека, при котором, как считается, гемизиготность по гену limkl приводит к нарушению моторных функций, когнитивным дефектам зрительно-пространственного ориентирования и повышенной фиксации взгляда на партнере [2].
Моделирование этого синдрома с привлечением мутантных и спонтанных вариантов локуса agnostic позволило выявить влияние изменения структуры гена limkl на локомоторные и когнитивные проявле-
ния. Среди них изменения параметров двигательной активности личинок и резкие нарушения траекторий движений при ориентации в пространстве у самцов Oregon-R и agnts3. У имаго этих же линий наблюдаются сильные дефекты обучения и памяти при условнорефлекторном подавлении ухаживания за счет резко повышенной ориентации по отношению к партнеру и его преследованию.
Основываясь на результатах проведенного нами секвенирования гена limkl линий Canton-S, Berlin, Oregon-R, agnts3 (международная база генетических данных GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Genbank/, номера Dlimk1_allforGenbank.asn.1 dmel-limkl-CantonS JX987486 Dlimk1_allforGenbank.asn.1 dmel-limkl-agnosticts3 JX987487; Dlimk1_allforGenbank. asn.1 dmel-limk1-Oregon-R JX987488; Dlimk1_ allforGenbank.asn.1 dmel-limk1-Berlin JX987489; Dlimk1_allforGenbank.asn.1 dmel-limk1-cantonS JX987486; Dlimk1_allforGenbank.asn.1 dmel-limk1-agnosticts3 JX987487; Dlimk1_allforGenbank. asn.1 dmel-limkl-Oregon-R JX987488; Dlimk1_ allforGenbank.asn.1 dmel-limkl-Berlin JX987489), можно предполагать, что нарушение LIM- и PDZ-доменов у мух линии Oregon-R сопровождается изменениями локомоторного поведения и резкими когнитивными нарушениями. Также изменения в LIM- и PDZ-доменах LIMK1 снижают способность не только к зрительно-пространственному ориентированию, но и к обучению. Инсерция S-транспозона в З'-нетранслируемую область гена limkl у мутанта agnts3 также приводит к весьма любопытным эффектам. У мутанта agnts3 выявлены дефекты в способности к ориентированию и значительные нарушения
в когнитивной сфере, что сопровождается сверхэкспрессией LIMK1 [8, 14].
Следует отметить, что результаты нашей работы создают предпосылки для разработки метода экспресс-оценки действия различных фармакологических агентов на локомоторные и когнитивные способности дрозофилы. Предложенные методики регистрации поведения личинок и имаго дрозофилы можно использовать для поиска лекарственных препаратов, корректирующих локомоторные и когнитивные нарушения. Большая скорость и сравнительно невысокая цена исследований на дрозофиле делают ее практически идеальным объектом для предварительного экспериментального тестирования тера-
певтических средств. Препараты, прошедшие отбор на такой системе, можно переводить на следующий этап тестирования с использованием более близких к человеку позвоночных животных.
Выявленная связь мутационного повреждения гена agnostic и нарушений в локомоторной и когнитивной сфере позволяет использовать данную модель для изучения геномных заболеваний и, в частности, синдрома Уильямса. •
Работа поддержана РФФИ (грант № 12-04-01737-а), программами Президиума РАН (№ 7 и 30).
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Bellugi U., Adolphs R., Cassady С., Chiles M. // Neuroreport. 1999. V. 10. № 8. P. 1653-1657.
2. Jarvinen-Pasley A., Bellugi U., Reilly J., Mills D.L., Galaburda A., Reiss A.L., Korenberg J.R. // Dev. Psychopathol. 2008.
V. 20. № 1. P 1-35.
3. Pober B.R., Johnson M., Urban Z. // J. Clin. Invest. 2008.
V. 118. № 5. P 1606-1615.
4. Савватеева Е.В., Камышев Н.Г., Розенблюм С.Р // Докл. АН СССР 1978. Т. 240. С. 1443-1445.
5. Savvateeva E.V., Kamyshev N.G. // Pharmacol. Biochem. Behavior. 1981. V. 14. P. 603-611.
6. Савватеева-Попова Е.В., Переслени А.И., Шарагина Л.М., Токмачева Е.В., Медведева А.В., Камышев Н.Г., Попов А.В., Озерский П.В., Баричева Е.М., Карагодин Д. и др. // Журн. эвол. биохим. физиол. 2002. Т. 38. № 6. С. 557-577.
7. Савватеева-Попова Е.В., Переслени А.И., Шарагина Л.М., Медведева А.В., Корочкина С.Е., Григорьева И.В., Дюжи-кова Н.А., Попов А.В., Баричева Е.М., Карагодин Д. и др. // Генетика. 2004. Т. 40. № 6. С. 749-769.
8. Медведева А.В., Молотков Д.А., Никитина Е.А., Попов А.А., Карагодин Д.А., Баричева Е.М., Савватеева-Попова Е.В. // Генетика. 2008. Т. 44. № 6. С. 669-681.
9. Брагина Ю.В., Молотова Н.Г., Камышева Е.А., Соболева С.А., Камышев Н.Г. // Информ. вестник ВОГиС. 2007. Т. 11.
№ 2. С. 436-444.
10. Kamyshev N.G., Iliadi K.G., Bragina J.V. // Learn. Mem. 1999. V. 6. № 1. P. 1-20.
11. Камышев Н.Г., Илиади К.Г., Брагина Ю.В., Савватеева-Попова Е.В., Токмачева Е.В., Преа Т. // Физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 1999. Т. 85. № 1. С. 84-92.
12. Sokal R.R., Rohlf F.J. Biometry: the principles and practice of statistics in biological research. New York: Freeman W.H., 1995. 887 p.
13. Каминская А.Н., Никитина Е.А., Паялина Т.Л., Молотков Д.А., Захаров Г.А., Попов А.В., Савватеева-Попова Е.В. // Экологическая генетика. 2011. Т. 9. № 4. С. 3-14.
14. Medvedeva A.V., Zhuravlev A.V., Savvateeva-Popova E.V. // Horizons in Neuroscience Research. 2010. V. 1. Ch. 4. P. 161-193.
