CC BY
57
генетика поведения
УДК 575.21
© А. Н. Каминская1, 2 3,
Е. А. Никитина1, Т. Л. Паялина1, 2,
Д. А. Молотков1, Г. А. Захаров1, 2,
А. В. Попов3,
Е. В. Савватеева-Попова1, 2
1 Учреждение Российской академии наук Институт физиологии им. И. П. Павлова РАН
2 Санкт-Петербургский государственный университет
3 Учреждение Российской академии наук Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН
Ш LIMK1 — ключевой фермент сигнального каскада ремоделирования актина, обеспечивающий в нервной системе перестройку шипиков дендритов, необходимую для синаптической пластичности при обучении. В данной работе приведены результаты комплексного анализа поведения ухаживания при обучении и формировании среднесрочной памяти самцов линий Berlin, Oregon-R и аgnts3, полиморфных по гену limk1 Drosophila, с использованием 2 подходов: метода условно-рефлекторного подавления ухаживания и исследования звукопродукции самца при ухаживании в сопоставлении с оценкой содержания LIMK1 в мозге анализируемых линий.
Ш Ключевые слова: limkl, поведение ухаживания, звукопродукция, обучение, память.
Поступила в редакцию 26.07.2011 Принята к публикации 20.10.201 1
влияние соотношения изоформ LIMK1 на поведение ухаживания DROSOPHILA MELANOGASTER:
комплексный подход
ВВЕДЕНИЕ
С помощью условного рефлекса организм может диаметрально менять свои реакции на одни и те же факторы среды, сочетая и мобилизуя необходимые внутренние адаптивные процессы в ответ на реальные и ожидаемые события во внешнем мире соответственно опыту, приобретенному в индивидуальном развитии. Условный рефлекс выполняет следующие функции: 1) увеличивает размах нормы реакции онтогенетических функциональных адаптаций, чем способствует повышению роли индивидуального приспособления; 2) выводит организм из-под контроля элиминирующих факторов; 3) важен при подборе скрещивающихся пар, т. е. 4) может приводить к нарушению панмиксии — свободного скрещивания особей в популяции (Лобашев, 1961). Это ведет к репродуктивной изоляции, когда для особей разных популяций снижается вероятность оплодотворения ввиду различий в поведении, например, при ритуалах ухаживания и брачных песнях. И если издавна считалось, что эти процессы лучше всего изучать у птиц, то с развитием тонких методов анализа поведения стало ясно, что наиболее подходящим объектом являются насекомые, не только цикады и сверчки, но и Drosophila melanogaster. То обстоятельство, что за поведением Drosophila удобно наблюдать не столько в природе, сколько в лаборатории, обеспечило создание совершенно новых способов анализа как условного рефлекса (Siegel and Hall, 1979; Kamyshev et al., 1999), так и параметров звукопродукции при ритуале ухаживания (Попов и др., 2000). Сам ритуал начинается с того, что привлекаемый феромоном самки, афродизиаком, самец начинает осуществлять последовательные этапы ухаживания (ориентация/преследование, вибрация крылом — брачная песня, ликинг, попытка копуляции), каждый из которых служит для повышения рецептивности самки и замедления ее движений, т. е. для обеспечения копуляции. Оплодотворенная самка в течение 10—12 дней откладывает яйца и уклоняется от новых копуляций, при попытке которых выпячивает яйцевод, испуская отталкивающий феромон, антиафродизиак. Поэтому у самца возникает необходимость различения того, какая именно самка перед ним? При встрече с оплодотворенной самкой самец, основываясь на предыдущем индивидуальном опыте, вынужден остановить ритуал ухаживания, и именно такое его поведение легло в основу широко применяемого метода для изучения процессов обучения и формирования памяти, называемого условно-рефлекторным подавлением ухаживания (УРПУ). В лабораторных условиях самец, достигший половозрелости в возрасте 5 дней в отсутствии каких-либо контактов с другими особями, после пребывания с оплодотворенной самкой в течение 30 мин накапливает опыт отказов от копуляции. Память об этом, т. е. УРПУ, сохраняется в течение 1 часа, если последующая предъявленная самка будет девственной, и 8 часов — если оплодотворенной. Индекс ухаживания (ИУ) рассчитывается как процент времени, затраченного на исполнение всех элементов ухаживания. Индекс обучения (ИО) можно вычислить не только на основе учета всех элементов полового, но и неполового поведения
(двигательной активности, прининга (почесывания), отдыха), но и анализировать записанные этограммы поведения отдельно для каждого параметра (Kamyshev et al., 1999).
Важным компонентом ухаживания является брачная песня. Репертуар брачной песни самца Drosophila включает два типа звуковых сигналов — импульсную и синусоидальную песни, следующие друг за другом (Попов и др., 2000). Импульсная песня производится, когда самец вибрирует крыльями. Она несет основную семантическую нагрузку и выполняет триггерную функцию, запуская копуляцию (Schilcher, 1976a, b), а также является видоспецифичным сигналом, играющим важную роль в изоляции видов при выборе потенциального партнера (Ewing, 1989). Синусоидальная песня увеличивает восприимчивость самок (Schilcher, 1976a, b). Звукопродукция во время ухаживания, т. е. чередование импульсной и синусоидальной песни, требует четкого переключения программ работы двух моторных центров — импульсного и синусоидального пейсмейкеров (Попов и др., 2000). При генерации звуковых сигналов возникают их искажения. Процент искаженных импульсов характеризует стабильность работы пейсмейкеров пения, отражая частоту нарушений работы мышц крыла.
Имея в распоряжении обе эти методики, мы задались вопросом — возможно ли увидеть УРПУ при учете одного только элемента ухаживания — того, что при визуальной регистрации поведения называется «вибрация», а при автоматизированной — «звукопродукция»? Если да, то изменение каких параметров звукопродукции быстро и надежно указывает на нарушения процесса формирования памяти? Выделение такого параметра открывает возможность экспресс-скрининга терапевтических средств при условии знания ключевых компонентов биохимических путей процессов формирования памяти в норме и при патологии. Один из самых изучаемых — это каскад ремоделирования актина: рецепторы нейромедиаторов — малые ГТФазы Rho-семейства — LIM-киназа 1 (LIMK1) — кофилин — актин. LIMK1, ключевой фермент каскада, фосфорилирует кофилин, тем самым блокируя деполимеризацию актина (Yang et al., 2000; Bamburg and Bloom, 2009). Это вызывает перестройку шипиков дендритов, обеспечивая сина-птическую пластичность. LIMK1 в клетке представлена двумя изоформами, различающимися по функциональной активности. Изоформа С представляет собой полноразмерный белок, содержащий 1257 аминокислотных остатков (140 кД), включает два LIM и PDZ домены, которые отсутствуют в изоформе D, содержащей 1052 аминокислотных остатка (119 кД). D-изоформа LIMK1 обладает более высокой киназной активностью, чем С-изоформа, поскольку LIM- и PDZ-домены участвуют в инактивации киназной активности LIMK1 (Nagata et al., 1999). Наличие нескольких изоформ LIMK1 предполагает, что они могут быть по-разному использованы для реализации в популяции различных стратегий поведения, однако исследований такого рода не проводилось. Считается, что дисфункция LIMK1 вызывает нарушения когнитивных функций у па-
циентов с болезнью Альцгеймера (Masliah et al., 2000) вследствие дисрегуляции «актинового каскада». При этом в нейронах мозга этих пациентов происходит образование цитоплазматических включений, окруженных комплексами актин — кофилин (Maloney et al., 2007; Bamburg et al. 2010). Кроме того, при «геномных болезнях», таких как сицдром Уильямса человека, делеции, приводящие к геми-зиготности по гену limkl, вызывают когнитивные нарушения зрительно-пространственного ориентирования. Деле-ции возникают спонтанно за счет неравной рекомбинации в районе хромосомы со специфической архитектурой. В обоих случаях правила установления баланса различных изо-форм LIMK1, реализуемые на уровне поведения, до конца неясны. Выяснению этого вопроса способствует то, что у Drosophila melanogaster ген limkl также расположен в районе со специфичной архитектурой хромосомы, в локу-се agnostic: наличие А/Т-богатых областей вблизи локуса предрасполагает к встройке мобильных элементов, возникновению спонтанных перестроек в разных природных популяциях. Так, структура гена изменена у линий дикого типа Oiegon-R и Berlin, а также у мутантной линии agnts3 (Медведева и др., 2008). И если у мутантной линии agnts3 с повышенной активностью LIMK1 и кофилина были детектированы значительные нарушения обучения/памяти и амилоидогенез, характерные особенности звукопродукции (Попов и др., 2009), то ничего неизвестно о том, как в остальных случаях измененная структура гена сказывается на активности его продукта и каким образом это реализуется на уровне поведения.
Поэтому настоящая работа посвящена выявлению того, как соотношение изоформ LIMK1 у спонтанных и мутантного вариантов локуса agnostic предопределяет условно-рефлекторную деятельность при реализации ритуала ухаживания у дрозофилы.
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В работе использовали линии D. melanogaster, проявляющие полиморфизм по гену limk1, обнаруженный в районе локуса agnostic (Х-хромосома, 11AB):
1) Canton-S — контрольная линия дикого типа.
2) Berlin — выделена из дикой популяции города Берлина и широко используется в поведенческих исследованиях в Европе. У данной линии при ПЦР-кар-тировании гена limk1 было обнаружено отсутствие ПЦР-фрагментов в области 3, 4 и частично 5 экзонов, а также 2, 3 и 4 интронов (Медведева и др., 2008).
3) Oregon-R — линия из дикой популяции штата Орегон, США. На генетическом фоне этой линии дикого типа существуют многие известные линии-маркеры и балансеры. При ПЦР-картировании гена limk1 у данной линии наблюдалось отсутствие ПЦР-фрагментов в области 2 экзона,1 и 2 интронов (Медведева и др., 2008).
4) Линия agnts3 несет температуро-чувствительную (ts) мутацию, полученную и поддерживаемую на генети-
ческом фоне линии Canton-S. При ПЦР-картирова-нии гена для limkl у данной линии была обнаружена инсерция 1,7 т. п. н. на расстоянии около 1 т. п. н. от 3'-UTR (Медведева и др., 2008). Мух выращивали в стаканчиках объемом 160 мл на стандартной изюмно-дрожжевой среде при +25 ± 0,5 °С, 60 % влажности и свето-темновом цикле 12 : 12 ч. Вылупившихся насекомых без наркотизации сортировали по полу. Отбирали самцов анализируемой линии и помещали их поодиночке в стаканчики со средой. В качестве объектов ухаживания для самцов всех анализируемых линий использовали виргинных и оплодотворенных за сутки до опыта самок линии Canton-S. Исследования проводили на взрослых мухах в возрасте 5 дней, при температуре +25 ± 0,5 °С, в первой половине дня.
подготовка образцов для электрофореза в пааг
Для экстракции белков отбирали 30-40 голов 5-су-точных самцов для каждой линии D. melanogaster. Головы гомогенизировали на льду в 40 мкл раствора ингибитора протеаз (Sigma, США). Полученный гомогенат центрифугировали при 13 000 об/мин в течение 2 мин. Отбирали надосадочную жидкость. К 30 мкл гомогената добавляли 10 мкл 4 х буфера Леммли для электофоре-за. Приготовленные таким образом пробы хранили при -20 °С. Определения в образцах концентрации белка проводили по методу Бредфорд (Bradford, 1976). Концентрации белка с учетом данных фотометрирования выравнивали с использованием спектрофотометра (Eppendorf BioPhotometer, Германия).
электрофорез белков в полиакриламидном геле
Разделение белков по молекулярной массе проводили методом диск-электрофореза в полиакриламидном геле, с концентрирующим (5 % акриламид/бис-акрил-амид, pH = 6,8) и разделяющим (10 % акриламид/бис-акриламид, pH = 8,8) гелями. Гель заливали в камеру для вертикального электрофореза Mini Protean Tetra Cell (BioRad, Италия) размером 10 х 8 см. В каждый кармашек добавляли по 10 мкл образца. Разделение проводили в течение 120 минут при силе тока 35 мА и напряжении 120 В в трис-глициновом буфере (pH = 8,3). Контрольный гель окрашивали реагентом Кумасси G-250 (Pierce, США) для оценки степени выравненное™ концентраций белка на дорожках.
вестерн-блоттинг и блот-гибридизация
После электрофоретического разделения белки из геля переносили на нитроцеллюлозную мембрану PROTRAN (Schleicher&Schuell, Германия) на блоттере Fastblot B 34
(Biometra, Германия) полусухим переносом в течение 1 ч. Затем мембрану инкубировали 12 ч в 5 % растворе обезжиренного сухого молока на буфере TBST (pH = 7,6), при +4 °С. После этого мембрану помещали в раствор первичных антител (SantaCruz, США), в разведении 1 : 400 и инкубировали в течение 1 ч при +22 °С, затем инкубировали с биотин-мечеными вторичными антителами (Santa Cruz, США), в разведении 1 : 2000 в течение 1 ч при +22 °С. Затем инкубировали с раствором ABC (авидин, конъюги-рованный с пероксидазой хрена) (Vectastain ABC Elite kit, Vector peroxidase substrate kit, Vector, США) в течение 1 ч при +22 °С. Мембрану помещали в раствор Vector Nova Red substrate kit for peroxidase (Vector laboratories, США) и инкубировали в течение 10—15 мин до развития окраски. Изображение регистрировали с помощью сканера (Epson® ScanPriza) с разрешением 300 dpi. Полученный JPEG-файл анализировали с использованием программного обеспечения Gel analyzer-1.0 (Литех, Россия).
регистрация параметров ухаживания самцов
Для регистрации параметров ухаживания самца изучаемой группы и виргинную самку помещали в камеру диаметром 15 мм и высотой 5 мм, изготовленную из оргстекла. Продолжительность наблюдения за ухаживанием самца составляла 10 мин.
Фиксировали латентный периоддо ухаживания и время начала копуляции. Длительность ухаживания рассчитывали как разность времени копуляции и начала ухаживания. Эффективность ухаживания вычисляли как процент пар, копулировавших в течение периода наблюдения. В каждой линии тестировали не менее 20 пар мух.
Параметры ухаживания для Canton S были взяты из работы (Попов и др., 2006).
регистрация параметров звукопродукции при ухаживании самцов
Для регистрации звуковых сигналов самца и оплодотворенную самку помещали в камеру диаметром 8 и высотой 4 мм, изготовленную из оргстекла. Для одновременной регистрации пения четырех пар мух четыре микрофона были установлены внутри бокса из пенопласта (25 х 25 х 30 см) с толщиной стенок 3,7 см, расположенного в звукоизолирующей камере. Для гашения вибрации бокс устанавливали на поролоновой подушке толщиной 2 см. Встроенные электронные фильтры позволяли ограничить частотную полосу записи канала в пределах 100—800 Гц, для избежания посторонних шумов. На уровне микрофона устанавливали датчик электронного термометра (Greisinger electronic GTH 175/МО, Германия). Продолжительность регистрации звуков составляла 300 с. Регистрацию звуковых сигналов проводили с помощью аналого-цифрового преобразователя и записывали как
звуковые файлы с использованием программы Н. Г. Камышева. Анализ звуковых сигналов проводили с использованием программы Fly43, разработанной Н. Г. Камышевым и П. В. Озерским (Попов и др. 2000, 2006).
Проводили детальный анализ импульсной и синусоидальной песен звукопродукции самца при ухаживании по отдельным параметрам. В каждой линии тестировали не менее 12 пар мух.
При анализе параметров импульсного сигнала в каждой пятиминутной записи последовательно измеряли все посылки и межимпульсные интервалы. Интервалы короче 80 мс рассматривали как межимпульсные, а интервалы более 80 мс — как межпосылочные. Оценивали дисперсию межимпульсного интервала, процент искаженных импульсов, среднюю длительность импульсных посылок.
При оценке синусоидальной песни учитывали длительность синусоидальных отрезков, основную частоту синусоидальной песни и суммарное число пульсов. В анализ брали синусоидальные отрезки по длительности не менее 100 мс.
Параметры звукопродукции для Canton S были взяты из работы (Попов и др., 2006).
оценка способности к обучению
самцов D. MELANOGASTER
Оценку способности к обучению проводили, основываясь на методе условно-рефлекторного подавления ухаживания. Для этого самца тестируемой линии, не имеющего опыта полового поведения, помещали в экспериментальную камеру вместе с оплодотворенной самкой Canton S и оставляли на 30 минут. Обучение тестировали через разные интервалы времени: сразу после тренировки и через 3 часа. В качестве контроля использовали самцов, не имеющих опыта полового поведения. В каждой группе (контрольной, сразу после тренировки и через 3 часа после тренировки) тестировали не менее 20 пар мух.
Использовали два подхода: 1) метод условно-рефлекторного подавления ухаживания
Для выработки условно-рефлекторного подавления ухаживания (тренировки) пятисуточного самца тестируемой линии, не имеющего опыта полового поведения, помещали в экспериментальную камеру диаметром 15 и высотой 5 мм, изготовленную из оргстекла, вместе с оплодотворенной пятисуточной самкой Canton S и оставляли на 30 минут. В качестве контроля использовали самцов, не имеющих опыта полового поведения. Этограмму поведения самца регистрировали в течение 300 секунд, фиксируя время начала отдельных элементов ухаживания (ориентация и преследование, вибрация, лизание, попытка копуляции), а также время выполнения элементов, не связанных с ухаживанием (побежка, прининг, по-
кой). Регистрацию начинали через 45 секунд после помещения мух в камеру. Для расшифровки и анализа данных использовали специально разработанные компьютерные программы (автор программ — Н. Г. Камышев).
Для каждого самца вычисляли индекс ухаживания (ИУ), т. е. время ухаживания самца за самкой, выраженное в процентах от общего времени наблюдения. Для количественной оценки результатов обучения вычисляли индекс обучения (ИО) по следующей формуле:
ИО = [(ИУН — ИУТ)/ИУН] х 100% = (1 — ИУТ/ ИУН) х 100%,
где ИУН и ИУТ — средние индексы ухаживания для независимых выборок самцов, не имеющих опыта полового поведения, и самцов, прошедших тренировку. 2) регистрация звукопродукции при ухаживании
Для оценки способности к обучению самцов Drosophila с использованием установки записи звуковых сигналов ухаживания регистрировали импульсную и синусоидальную песни ухаживания самцов, не имеющих опыта полового поведения, сразу после обучения и спустя 3 часа после обучения. Индекс ухаживания (ИУ) рассчитывали как процент времени, затраченного самцом на звукопродукцию импульсной и синусоидальной песен. Индекс обучения (ИО) — как разницу ИУ до тренировки и ИУ после тренировки. Для оценки вклада в обучение компонентов песни ухаживания — импульсной и синусоидальной составляющих — значения индексов импульсной (И) и синусоидальной (С) песен вычисляли по следующим формулам: И = Т/Т„ ,
и общ'
С =Т/Тб ,
с общ'
где Т и Т — время, затраченное самцом на звукопро-дукцию импульсной и синусоидальной компоненты песни ухаживания; Тобщ — общее время тестирования.
Затем находили отношение И/С отдельно для каждого самца и рассчитывали среднее значение для каждой группы до и после обучения.
СТАТИСТИЧЕСКАЯ ОБРАБОТКА ПОЛУЧЕННЫХ РЕЗУЛЬТАТОВ
Статистическую обработку полученных значений проводили с помощью программного обеспечения GraphPad Instat 3 и Statistica 6.0. Использовали тест Манн—Уитни для длительности импульсных посылок; критерий Фишера для эффективности ухаживания; тест Левина для дисперсии МИИ; рандомизационный анализ для соотношения индексов импульсной и синусоидальной песен, а также для оценки способности к обучению при помощи метода условно-рефлекторного подавления ухаживания и исследования звукопродукции самца при ухаживании. Дисперсионный анализ использовали при оценке значений интенсивности окрашивания белковых полос ЫМК1. В остальных случаях применяли непарный ^критерий Стьюдента.
Рис. 1. Вестерн-блот анализ LIMK1 у самцов линий Canton-S, Berlin, Oregon-R и agnts3: а) С- и D-изоформы LIMK1; б) содержание D- и C-изоформ; в) соотношение количества изоформ D/C. * — достоверные отличия от Canton-S (дисперсионный анализ, р < 0,05)
результаты
определение количества limk1 в мозге самцов d. melanogaster
С использованием метода иммуноблоттинга и последующей гибридизацией антител к С-концу LIMK1 был проведен количественный анализ содержания D- и C-изоформ LIMK1 в мозге самцов линии Canton-S, Berlin, Oregon-R и agnts3 (рис. 1 а).
Соотношение между изоформами D и C LIMK1 и их количество в мозге самцов между анализируемыми линиями варьировало. Так, количество D- и C-изоформ LIMK1 у agnts3 в 3 раза превышало таковое у Canton-S (рис. 1 б), в то время как их соотношение у agnts3 не отличалось от такового у Canton-S (рис. 1 в). Количество D-изоформы у Berlin в 2 раза превышало таковое у Canton-S, а у Oregon-R было в 2 раза меньше, чем у Canton-S (рис. 1 б). Для линий дикого типа характерно различное соотношение D- и C-изоформ (рис. 1 в). Таким образом, в ходе наших экспериментов было впервые выявлено неодинаковое содержание и соотношение изоформ LIMK1 у линий дикого типа Berlin, Oregon-R и Canton-S и мутант-ной линии agnts3, что, возможно, вызвано разными регуля-торными механизмами сплайсинга у каждой линии.
характеристика поведения ухаживания самцов d. melanogaster
Сравнительный анализ по трем параметрам поведения ухаживания: 1) латентному периоду ухаживания (ЛПУ),
2) длительности ухаживания (ДУ) и 3) эффективности ухаживания (ЭУ) самцов линии agnts3, Berlin и Oregon-R выявил следующие особенности этих линий (табл. 1). ЛПУ у Oregon-R и у agnts3 достоверно был увеличен относительно такового у Canton-S, что не оказало влияния на эффективность ухаживания, которая у линий agnts3 и Oregon-R была сопоставима с таковой у Canton-S. В то же время увеличение ЛПУ у Berlin в 4 раза по сравнению с Canton-S сопровождается достоверным снижением величины эффективности ухаживания. ДУ Berlin и Oregon-R достоверно превышала таковую у Canton-S, в то время как для agnts3 статистически значимых различий выявлено не было.
Таблица 1
Параметры ухаживания самцов линии Canton-S, Berlin и Oregon-R и agnts3
Линия n ЛПУ, с ДУ, с ЭУ, %
Canton-S 63 22 ± 3 145 ± 17 87
Berlin 66 80 ± 12* 324±28* 50*
Oregon-R 61 54 ± 9* 264±21* 77
agnts3 51 55 ± 9* 162 ± 19 86
п — число тестированных самцов
ЛПУ — латентный период ухаживания
ДУ — длительность ухаживания
ЭУ — эффективность ухаживания
* — достоверные отличия от Canton-S (непарный
критерий Стьюдента, для ЭУ — сравнение долей
по Фишеру, р < 0,05).
В
-^^l1————»y^—'—^yyi-——-—___^VJV^——'ViV4^^—____
Рис. 2. Осциллограммы сигналов ухаживания самцов В. melanogasterсинусоидальной песни (а) и импульсной песни с нормальными (б) и искаженными пульсами (в, г). Длительность каждой осциллограммы 500 мс
25 20 15 10 5 О
Индекс пенпя
JL.
Canton-S Berlin Огедоп-R agrit3
40 38 36 34 32 30
Межимпульсный интервал
*
Canton-S Berlin Огедоп-R agrP3
Основная частота синусоидальной песни
185 175 Н if 165 -155 -145
Canton-S Berlin Огедоп-R agrf3
%
35 28 H 21 14 7 О
Процент искаженных пульсов
*
dm
«
Canton-S Berlin Огедоп-R agn's3
Рис. 3. Параметры звуковых сигналов самцов линий Canton-S, Berlin, Oregon-R и agnts3: а) индекс пения; б) межимпульсный интервал; в) основная частота синусоидальной песни; г) процент искаженных импульсов. * — достоверные отличия от Canton-S (непарный t-критерий Стьюдента, p < 0,05)
характеристика звуковых сигналов ухаживания самцов D. MELANOGASTER
С использованием установки автоматической регистрации звукопродукции самцов Drosophila был проведен сравнительный анализ звуковых сигналов ухаживания самцов agnts3, Berlin и Oregon-R в сопоставлении с Canton-S. На рисунке 2 приведены осциллограммы сигналов ухаживания самцов: синусоидальной песни (рис. 2 а) и импульсной песни с нормальными (рис. 2 б) и искаженными (рис. 2 в, г) импульсами. Оценивали 4 параметра звуковых комму-
никационных сигналов: индекс пения, межимпульсный интервал, основную частоту синусоидальной песни и процент искаженных импульсов.
Основным параметром звуковых сигналов, характеризующим уровень половой мотивации, является индекс пения (ИП). ИП у agnts3 и Oregon-R не отличались от таковых у Canton-S, в то время как для Berlin было характерно почти трехкратное снижение этого параметра (рис. 3, а). Наиболее значимым параметром для распознавания самкой сигнала ухаживания самца своего вида является межимпульсный интервал (МИИ). У самцов agnts3 МИИ короче, чем
Рис. 4. Оценка способности к обучению и формированию среднесрочной памяти самцов линий Canton-S, Berlin, Oregon-R и agnts3. Метод условно-рефлекторного подавления ухаживания: а) обучение и среднесрочная память (все элементы ухаживания); б) обучение и среднесрочная память (параметр вибрации). Метод регистрации звукопродукции при ухаживании: в) обучение и среднесрочная память (импульсная и синусоидальная песни ухаживания). 0 — индекс обучения сразу после тренировки 180 — индекс обучения через 3 часа после тренировки
* — достоверные отличия от Canton-S (двусторонний тест рандомизации, p < 0,05)
у самцов Canton-S, что свидетельствует о более высоком ритме пения самцов agnts3. Для Berlin и Oregon-R, напротив, характерно увеличение этого параметра (рис. 3 б). Основная частота (ОЧ) синусоидальной песни анализируемых линий также отличается от таковой у Canton-S. Так, для agnts3 и Oregon-R характерно увеличение значения этого параметра, в то время как у самцов Berlin ОЧ короче, чем у Canton-S (рис. 3 в). При генерации звуковых сигналов в процессе ухаживания возникают искажения формы звуковых импульсов, в том числе и у мух дикого типа. Искажения с увеличенной длительностью импульса наиболее часто встречаются у самцов Berlin и Oregon-R, в то время как у agnts3 они возникают реже. У самцов agnts3 наиболее часто возникают искажения с полициклическими импульсами, вызванные, по-видимому, тремором мышц пения. Процент искаженных импульсов (% ИП) характеризует стабильность работы пейсмейкеров пения, отражая частоту нарушений режима работы крыловых мышц. agnts3 по этому параметру не отличается от Canton-S. Berlin и Oregon-R демонстрируют более высокие уровни ИП (рис. 3 г).
оценка способности к обучению при условно-рефлекторном подавлении ухаживания самцов D. MELANOGASTER
Условно-рефлекторное подавление ухаживания является естественной формой обучения у дрозофилы, т. е. после ухаживания за нерецептивной оплодотворенной самкой (тренировки) у самца снижается интенсивность ухаживания за всеми последующими самками. На этом основана оценка способности к обучению самцов D. melanogaster. У исследуемых линий была изучена динамика сохранения условно-рефлекторного подавления ухаживания (рис. 4 а).
У линий Canton-S и Berlin индекс обучения длительное время сохранялся на уровне, достигнутом сразу после окончания тренировки, что свидетельствует о нормальном протекании процессов обучения и формирования среднесрочной памяти.
У линии Oregon-R выработки условно-рефлекторного подавления ухаживания не наблюдалось, при тестировании
Компоненты песни ухаживания импульсной и синусоидальной составляющих при обучении
■ импульсная песня □ синусоидальная песня
Соотношение импульсной и синусоидальной песен ухаживания
Canton-S
Berlin
Oregon-R
agn*3
ИКС 0 13180
Рис. 5. Покомпонентный анализ песни ухаживания при обучении: а) компоненты песни ухаживания (импульсная и синусоидальная составляющие); б) соотношение импульсной и синусоидальной песен к — контрольная группа (самцы, не имеющие опыта полового поведения) 0 — тест сразу после тренировки (обучение) 180 — тест через 3 часа после тренировки (память)
* — достоверные отличия от Canton-S (двусторонний тест рандомизации, p < 0,05).
# — достоверные отличия от контрольной группы, (двусторонний тест рандомизации, p < 0,05)
сразу после тренировки значимый индекс обучения получен не был. Таким образом, исследуемая линия оказалась неспособной к обучению. Через 3 часа после тренировки подавления ухаживания также не наблюдалось, напротив, индекс обучения принимал отрицательное значение и статистически достоверно отличался от такового у Canton-S.
У мутантной линии agnts3 выработки условно-рефлекторного подавления ухаживания не происходило, при тестировании сразу после тренировки значимый индекс обучения получен не был. Таким образом, исследуемая линия оказалась неспособной к обучению. Через 3 часа после
тренировки также не наблюдалось подавления ухаживания. Полученные результаты свидетельствуют в пользу того, что у agnts3 по сравнению с Canton-S снижены не только 3-часовая память, но и способность к обучению.
Был проведен поэлементный анализ поведения ухаживания у исследуемых линий Drosophila, в частности, был проанализирован такой важный элемент ухаживания как вибрация (рис. 4, б).
У линий Canton-S и Berlin был выявлен значимый индекс обучения, который в течение 3 часов сохранялся на уровне, достигнутом сразу после окончания тренировки. По
компоненту вибрации у самцов линии Berlin статистически значимых отличий от линии Canton-S обнаружено не было.
У линии Oregon R при тестировании сразу после тренировки индекс обучения достоверно не отличался от такового у Canton-S — по параметру вибрации исследуемая линия оказалась способной к обучению. Напротив, через 3 часа после тренировки индекс обучения принимал отрицательное значение.
У мутантной линии agnts3 при тестировании как сразу, так и через 3 часа после тренировки индекс обучения достоверно не отличался от такового у линии Canton-S — исследуемая линия оказалась способной к обучению и сохранению памяти по параметру вибрации.
обучение самцов с использованием установки для регистрации звукопродукции при ухаживании самцов D. MELANOGASTER
С целью проведения детального анализа способности к обучению самцов Drosophila был применен метод оценки данного показателя с использованием установки записи звуковых сигналов ухаживания, автоматически регистрирующей звукопродукцию при ухаживании — вибрацию, соответствующую импульсной и синусоидальной песням.
У линии Canton-S наблюдалось условно-рефлекторное подавление ухаживания, и индекс обучения длительное время сохранялся на уровне, достигнутом сразу после окончания тренировки (рис. 4, в).
У самцов линии Berlin, Oregon-R и agnts3 при тестировании сразу после тренировки условно-рефлекторного подавления ухаживания не наблюдалось, значимый индекс обучения получен не был. Индекс обучения принимал отрицательные значения и статистически значимо отличался от такового у линии Canton-S (рис. 4, в).
Спустя 3 часа после тренировки индекс обучения у самцов линии Berlin и Oregon-R, также принимал отрицательные значения и достоверно отличался от такового у линии Canton-S, чего не наблюдалось у линии agnts3 (рис. 4, в).
Далее нами были проанализированы отдельные компоненты песни ухаживания импульсной и синусоидальной составляющих после обучения (рис. 5, а). У самцов линии Canton-S как сразу, так и через 3 часа после тренировки отмечалось снижение импульсной и синусоидальной песен в 3 раза. У остальных линий не наблюдалось снижения индекса ни импульсной, ни синусоидальной составляющих песни ухаживания, за исключением варианта эксперимента через 3 часа после тренировки у линии Oregon-R (рис. 5, а).
Было проанализировано соотношение индексов импульсной и синусоидальной песен (И/С) для каждой линии (рис. 5, б). Для самцов линии Canton-S в контроле характерно преобладание импульсной над синусоидальной песней. Сразу после тренировки для самцов этой линии было характерно увеличение И/С, которое достоверно отличалось от контроля, подобное превалирование импульсной над синусоидальной песней сохранялось и при тестировании через 3
часа. У самцов линий Berlin и Oregon в контрольных группах импульсная песня преобладала над синусоидальной, И/С достоверно отличалось от Canton-S. Однако сразу после тренировки у линий Berlin и Oregon происходило значительное снижение И/С, а спустя 3 часа — восстановление до значений контроля. И/С самцов линии agnts3 в контрольной группе достоверно не отличалось от такового у Canton-S. Однако после тренировки у agnts3 наблюдалось достоверное снижение И/С. Через 3 часа после тренировки у agnts3 достоверных изменений зарегистрировано не было.
ОБСУЖДЕНИЕ
М. Е. Лобашев сформулировал определение роли условного рефлекса как возможности животного «диаметрально менять свои реакции на одни и те же факторы среды, сочетая и мобилизуя необходимые внутренние адаптивные процессы в ответ на реальные и ожидаемые события во внешнем мире» (Лобашев, 1961). Эта формулировка как нельзя более подходит к описанию сущности условно-рефлекторного подавления ухаживания. Действительно, в природных популяциях при каждой встрече самцов и самок дрозофилы к ожидаемому самцом событию относится то, что самка является девственной, а к реальному — то, что в популяции многие самки уже оплодотворены. В любом случае высокая мотивация самца запускает ритуал ухаживания, при исполнении которого ему предстоит убедиться в том, может ли эта самка оставить потомство и, если нет, с учетом предыдущего опыта, прекратить ухаживание. А что же является сочетанием и мобилизацией «необходимых внутренних адаптивных процессов в ответ на реальные и ожидаемые события во внешнем мире»?
Все более возрастающее внимание нейробиологов и клиницистов к каскаду ремоделирования актина, объединение разных по этиологии, зонам поражения мозга ней-родегенеративных заболеваний под названием «болезни актинового цитоскелета», или кофилинопатии, указывают на широкий спектр внутренних адаптационных процессов, сопряженных с тем или иным уровнем функционирования этого каскада. Ключевой фермент ремоделирования актина, LIMK1, оказывается на перекрестке многих регуля-торных путей, так как содержит LIM и PDZ домены для осуществления межмолекулярных белок-белковых взаимодействий (Edvards, Gordon, 1999). LIMK1 влияет на транскрипцию через активацию CREB (Yang et al., 2004), участвует в перестройках актинового цитоскелета в де-ндритах (Endo, Ohashi, Mizuno, 2007). Активность LIMK1 регулируется микроРНК — miRNA-134, которая связывается с 3'-UTR мРНК для LIMK1, и этот комплекс транспортируется к синапсам дендритов, где в ответ на стимуляцию экстраклеточными нейротрофическими факторами происходит мРНК LIMK1 локальная трансляция (Schratt et al., 2006). Гиперэкспрессия miRNA-134 подавляет транскрипцию CREB, тем самым нарушая синаптическую пластичность, процессы обучения и формирования памя-
ти (Gao et al., 2010). Ранее при ПЦР-картировании гена limkl дрозофилы мы показали, что линиям дикого типа Oregon-R и Berlin, а также мутантной линии agnts3 свой ственны определенные модификации либо в структурной, либо в регуляторной областях гена (Медведева и др., 2008). Поэтому интересно проследить возможную взаимосвязь между содержанием и соотношением изоформ LIMK1, наблюдаемых у каждой из проанализированных линий, с организацией полового поведения.
Первое, что обращает на себя внимание при рассмотрении результатов вестерн-блот анализа — содержание D-изоформы у линии дикого типа Berlin двукратно превышает уровень Canton-S. Для этой линии также свойственно уникальное 5-кратное увеличение соотношения D/C изоформ. Наоборот, для линии дикого типа Oregon-R характерно 5-кратное уменьшение соотношения D/C изоформ относительно Canton-S. И только мутант agnts3 проявляет повышенное содержание обеих изоформ в 2,5 раза, хотя их соотношение сопоставимо с наблюдаемым у Canton-S.
Каковы последствия этого на уровне поведения? Первое, что важно с популяционной точки зрения — это эффективность ухаживания, резко нарушенная, как ни странно, у линии дикого типа Berlin. Для того, чтобы реализовалось это нарушение, по-видимому, важна длительность латентного периода ухаживания. Действительно, у всех линий этот параметр выше, чем у Canton-S, причем у линии Berlin в четыре раза. По-видимому, сама длительность ухаживания не столь критична для итоговой его эффективности, в то время как резкое, почти 3-кратное снижение индекса пения при исполнении брачной песни, отличающее эту линию от всех других, в наибольшей мере сказывается на эффективности ухаживания. Отражаются ли все эти характерные особенности линии Berlin на ее способности к обучению и сохранению памяти? Они незначительны при визуальной регистрации как всех элементов ухаживания, так и отдельно вибрации крыла, однако тут же дают о себе знать при переходе к более точному уровню анализа с использованием установки для автоматической регистрации звукопродукции, приводя к парадоксальному, отрицательному значению индекса обучения как сразу, так и через 3 часа после тренировки. По-видимому, это является результатом других характерных особенностей звукопродукции данной линии — уменьшение основной частоты синусоидальной песни наряду с повышением такого семантического компонента, как межимпульсный интервал.
К чему приводит дисбаланс изоформ LIMK1 в пользу более длинной и менее активной изоформы C у линии дикого типа Oregon-R?? И эффективность ухаживания, и индекс пения у нее такие же, как у Canton-S, хотя и межимпульсный интервал, и основная частота синусоидальной песни значимо отличаются. Но уже при визуальной регистрации обнаруживается нарушение среднесрочной памяти как при учете всех элементов ритуала ухаживания, так и при учете только вибрации крыла. При использовании установки для автома-
тической регистрации звукопродукции выявляется также и неспособность к обучению сразу после тренировки.
Повышение содержания обеих изоформ LIMK1 в 2.5 раза у мутантной линии agnts3 при их сопоставимом с наблюдаемым у Canton-S соотношении, также не сказывается на эффективности ухаживания и индексе пения, хотя межимпульсный интервал наименьший из наблюдаемых, а основная частота синусоидальной песни наибольшая. И обучение, и среднесрочная память сильно нарушены, что вызвано не изменениями при генерировании вибрации, а модификациями другого компонента ритуала ухаживания — ориентации/преследования (неопубликованные данные). Применение установки для автоматической регистрации звукопродукции позволяет выявить нарушение обучения.
Анализ динамики импульсной и синусоидальной песен, а также их соотношения в норме, сразу после тренировки и через 3 часа интересен для сопоставления двух методик. Действительно, для Canton-S свойственно рефлекторное подавление ухаживания, что видно и при рассмотрении его динамики с учетом как всех элементов ухаживания, так и отдельно вибрации. Визуально регистрируемая вибрация крыла самца дрозофилы отражает импульсную песню, в связи с чем вполне закономерны ее изменения при обучении, а отклонения при звукоизлучении будут свидетельствовать о нарушениях условно-рефлекторного подавления ухаживания, что мы и видим для линии дикого типа Oregon-R. Одни и те же закономерности выявляются обеими методиками и для мутантной линии agnts3. Только автоматическая регистрация звукопродукции, как более тонкий и точный способ анализа поведения, выявляет снижение способности к обучению, связанное, по-видимому, с серьезными нарушениями параметров ухаживания. По всей видимости, обнаруженное своеобразие линии Oregon-R, является результатом уникального, 5-кратного уменьшения относительно Canton-S соотношения D/C изоформ LIMK1.
Выявляемое нами изменение соотношения изоформ LIMK1 в мозгу самцов Berlin и Oregon-R, возможно, является результатом изменений альтернативного сплайсинга гена limkl, причиной которого, по всей видимости, служат точковые мутации — трансверсии и трансцизии, а также инсерции и делеции у этих линий, выявляемые нами при проводимом секвенировании гена limkl (неопубликованные данные).
При сохранении баланса изоформ в мозгу самцов agnts3 отмечается высокий уровень LIMK1. Повышенный уровень содержания LIMK1 у самцов линии agnts3, возможно, связан с наличием в 3'-некодирующей области гена limkl инсерции (Медведева и др., 2008), которая может изменять его регуляцию.
По современным представлениям, один ген может регулироваться несколькими миРНК, а одна миРНК способна регулировать большое число генов (Medvedeva, Zhuravlev, Savvateeva-Popova, 2010). Кроме уже упомянутой miRNA-
134, регулирующей активность LIMK1, обнаружены miRNA-103 и miRNA-107, связывающиеся с 3'-UTR кофи-лина, основного субстрата LIMK1 (Yao et al., 2010). Репрессию ряда миРНК детектируют как на пресимптоматической стадии развития болезни Альцгеймера, так и непосредственно при выявлении симптомов (Schonrock et al., 2010).
miRNA-134 была обнаружена при использовании программы для биоинформационного анализа MicroInspector (Rusinov et al., 2005), мы решили обратиться именно к такому способу анализа. В этой связи был поставлен вопрос — несет ли район 3'-UTR гена limkl дрозофилы, содержащий вставку транспозона, сайты связывания микроРНК, регулирующих активность LIMK1. С использованием программы MicroInspector было выявлено 13 сайтов связывания мик-роРНК (Medvedeva, Zhuravlev, Savvateeva-Popova, 2010).
заключение
Созданная модель позволяет обратиться к экспериментальному изучению процессов регуляции с участием микроРНК на примере Drosophila melanogaster (Botella et al., 2009; Moloney et al., 2009; Rincon-Limas et al., 2010). Нервные сети насекомых устроены существенно проще, чем у млекопитающих, но обладают сходными функциональными возможностями и их работа основана на использовании общих молекулярных компонентов, кодируемых гомологичными генами (параллелизм функций по Л. А. Орбели и М. Е. Лобашеву).
благодарности
Работа поддержана грантом Российского фонда фундаментальных исследований №09-04-01208, проектом ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России» на 2009—2013 годы, Программой РАН Биологическое разнообразие и Госконтрактом с Минобрнауки НИР №1.37.124.2011.
литература
1. Лобашев М. Е., 1961. Сигнальная наследственность // Исследования по генетике. Л.: изд-во ЛГУ. Под редакцией М. Е. Лобашева. Т. 1. С. 3-11.
2. Медведева А. В., Молотков Д. А., Никитина Е. А., Попов А. А., Карагодин Д. А., Баричева Е. М., Савватеева-Попова Е. В. 2008. Системная регуляция генетических и цитогенетических процессов сигнальным каскадом ремо-делирования актина: локус agnostic дрозофилы // Генетика. Т. 44. № 6. С. 669-681.
3. Попов А. В., Каминская А. Н., Савватеева-Попова Е. В., 2009. Поведение ухаживания, коммуникационное звуко-излучение и устойчивость к стрессу мутантов дрозофилы Drosophila melanogaster по гену agnostic, кодирующему LIMK1 // Журнал эволюционной биохимии и физиологии. Т. 45. № 2. С. 184-190.
4. Попов А. В., Переслени А. И., Комарова А. Ю., Сав-ватеева-Попова Е. В., 2006. Устойчивость характеристик поведения ухаживания и коммуникационного звукоизлучения самцов Drosophila melanogaster к стрессорным воздействиям на разных стадиях онтогенеза // Сенсорные системы. Т. 20. №2. С. 131-140.
5. Попов А. В., Савватеева-Попова Е. В., Камышев Н. Г., 2000. Особенности акустической коммуникации у плодовых мушек Drosophila melanogaster // Сенсорные системы. Т. 14. С. 60-74.
6. Bamburg J. R., Bloom G. S., 2009. Cytoskeletal pathologies of Alzheimer disease // Cell Motil Cytoskeleton. Vol. 66. № 8. P. 635-649.
7. Bamburg J. R., Zheng J. Q., 2010. ADF/cofilin-mediat-ed actin dynamics regulate AMPA receptor trafficking during synaptic plasticity // Nat Neurosci. Vol. 13. № 10. P. 1208-1215.
8. Botella J. A., Bayersdorfer F., Gmeiner F., Schneuw-ly S., 2009. Modelling Parkinson's disease in Drosophila // Neuromolecular Med. Vol. 11. № 4. P. 268-80.
9. Edwards D. C., Gill G. N., 1999. Structural features of LIM kinase that control effects on the actin cytoskel-eton // J. Biol. Chem. Vol. 274. № 16. Р. 1135211361.
10.Endo M., Ohashi K., Mizuno K., 2007. LIM kinase and slingshot are critical for neurite extension // J. Biol. Chem. Vol. 282. № 18. Р. 13692-13702.
11.Ewing A. W., 1989. Arthropod bioacoustics: neurobiology and behavior // N. Y.: Cornel University Press.
12. Gao J., Wang W. Y., Mao Y. W., Graff J., Guan J. S., Pan L., Mak G., Kim D., Su S. C., Tsai L. H., 2010. A novel pathway regulates memory and plasticity via SIRT1 and miR-134 // Nature. Vol. 466. № 7310. P. 1105-1114.
13.Kamyshev N. G., Iliadi K. G., Bragina J. V. 1999. Dros-ophila conditioned courtship: two ways of testing memory // Learn Mem. Vol. 6 № 1. P. 1-20.
14.Maloney M. T., Bamburg J. R., 2007. Cofilin-mediated neurodegeneration in Alzheimer's disease and other am-yloidopathies // Mol Neurobiol. Vol. 35. №1. P 21-44.
15. Masliah E., 2000. The role of synaptic proteins in Alzheimer's disease // Ann N Y Acad Sci. Vol. 924. P. 68-75.
16.Medvedeva A. V., Zhuravlev A. V., Savvateeva-Popo-va E. V., 2010. LIMK1, the key enzyme of actin remodeling bridges spatial organization of nucleus and neural transmission: from heterochromatin via non-coding RNAs to complex behavior. In: Horizons in Neuroscience Research. Vol. 1. Ch. 4. P. 161-193.
17. Moloney A., Sattelle D. B., Lomas D. A., CrowtherD. C., 2010. Alzheimer's disease: insights from Drosophila melanogaster models // Trends Biochem Sci. Vol. 35. N 4. P. 228-235.
18. Nagata K, Ohashi K, Yang N., Mizuno K, 1999. The N-terminal LIM domain negatively regulates the kinase activity of LIM-kinase 1 // Biochem. J. Vol. 343 Pt1. P 99-105.
19. Rincon-Limas D. E., Casas-Tinto S., Fernandez-Funez P., 2010. Exploring prion protein biology in flies: genetics and be -yond // Prion. Vol. 4. № 1. P 1 -8.
20. Rusinov V., Baev V., Minkov I. N., TablerM., 2005. Micro-Inspector: a web tool for detection of miRNA binding sites in an RNA sequence // Nucleic Acids Res. Vol. 33 (Web Server issue): W 696-700.
21. Schilcher F von., 1976a. The role of auditory stimuli in the courtship of Drosophila melanogaster // Anim. Behav. Vol. 24. P 18-26.
22. SchilcherF. von., 1976b. The function of pulse song and sine song in courtship of Drosophila melanogaster // Anim. Behav. Vol. 24. P 622-625.
23. Schonrock N, Ke Y. D, Humphreys D, Staufenbiel M, Ittner L. M, Preiss T, Götz J., 2010. Neuronal micro RNA deregulation in response to Alzheimer's disease amyloid-beta // PLoS One. Vol. 5. №6. P e11070.
24. Schratt G. M, Tuebing F., Nigh E. A., Kane C. G, Sabatini M. E., Kiebler M., Geenberg M. E., 2006. A brain-specific microRNA regulates dendritic spine development // Nature. Vol. 439. №7074. P 283-289.
25. Siegel R. W., Hall J. C., 1979. Conditioned responses in courtship behavior of normal and mutant Drosophila // Proc. Natl. Acad. Sci. USA. Vol. 76. № 1. P 3430-3434.
26. Yang C, Huang M., DeBiasio J., Pring M., Joyce M., Miki H, Takenawa T, Zigmond S. H, 2000. Profilin enhances
Cdc42-induced nucleation of actin polymerization // J Cell Biol. Vol. 150. №5. P 1001-1012. 27. Yao Jiaqi, Hennessey Tom, Flynt Alex, Lai Eric, Beal M. Flint, Lin Michae T., 2010. MicroRNA-Related Cofilin Abnormality in Alzheimer's Disease // PLoS ONE. Vol. 5. №12. P 1554615554.
EFFECT OF LIM KINASE 1 ISOFORM RATIO ON DROSOPHILA MELANOGASTER COURTSHIP BEHAVIOR: A COMPLEX APPROACH
A. N. Kaminskaya, E. A. Nikitina, T. L. Payalina, D. A. Molotkov, G. A. Zakharov, A. V. Popov, E. V. Savvateeva-Popova
■ SUMMARY: LIMK1 — is the key enzyme of actin remodeling which controls dendritic spine morphology necessary for synaptic plasticity during learning and memory formation. Conditioned courtship suppression paradigm and a set-up for communicative sound production during courtship were used to asses learning acquisition and memory formation in four Drosophila strains polymorphic for the limk1 gene harbored by the agnostic locus: the wild type strains Canton-S, Berlin, Oregon-R and the mutant аgn,s3. Behavioral performances were compared to the brain content and ratio of two LIMK1 isoforms in these Drosophila strains.
■ KEY WORDS: limkl; courtship; sound production; learning; mem.
Ф Информация об авторах Каминская Алена Николаевна — м. н. с.
Институт Физиологии им. И. П. Павлова, РАН, лаб. нейрогенетики. Санкт-Петербург, 199034 наб. Макарова, д.6, Россия. E-mail: kaminskayaan@mail.ru.
Никитина Екатерина Александровна — м. н. с.
Институт Физиологии им. И. П. Павлова, РАН, лаб. нейрогенетики. Санкт-Петербург, 199034 наб. Макарова, д.6, Россия. E-mail: 21074@mail.ru.
Паялина Татьяна Львовна — ст. лаб.
Институт Физиологии им. И. П. Павлова, РАН, лаб. нейрогенетики. Санкт-Петербург, 199034 наб. Макарова, д.6, Россия. E-mail: payalina@mail.ru.
Молотков Дмитрий Андреевич — ст. лаб.
Институт Физиологии им. И. П. Павлова, РАН, лаб. нейрогенетики. Санкт-Петербург, 199034 наб. Макарова, д.6, Россия. E-mail: momitek@mail.ru.
Захаров Геннадий Александрович — м. н. с.
Институт Физиологии им. И. П. Павлова, РАН, лаб. нейрогенетики. Санкт-Петербург, 199034 наб. Макарова, д.6, Россия. E-mail: Gennadiy.Zakharov@gmail.com.
Попов Андрей Владимирович — д. б. н., зав. лаб. Институт Эволюционной Физиологии и Биохимии им. И. М. Сеченова, РАН, лаб. нейроэтологии насекомых. 194223 Санкт-Петербург, пр. Тореза, д. 44, Россия. E-mail: office@iephb.ru.
Савватеева-Попова Елена Владимировна — д. б. н., зав. лаб. Институт Физиологии им. И. П. Павлова, РАН, лаб. нейрогенетики. Санкт-Петербург, 199034 наб. Макарова, д.6, Россия. E-mail: esavvateeva@mail.ru.
Kaminskaya Alena Nikolaevna — junior research worker. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Lab. of neurogenetics. Saint-Petersburg, 199034 Makarova emb., 6, Russia. E-mail: kaminskayaan@mail.ru.
Nikitina Ekaterina Alexandrovna — Ph.D., senior research worker. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Lab. of neurogenetics. Saint-Petersburg, 199034 Makarova emb., 6, Russia. E-mail: 21074@mail.ru.
Payalina Tatyana Lvovna — senior laboratory assistant. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Lab. of neurogenetics. Saint-Petersburg, 199034 Makarova emb., 6, Russia. E-mail: payalina@mail.ru.
Molotkov Dmitry Andreevich — senior laboratory assistant. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Lab. of neurogenetics. Saint-Petersburg, 199034 Makarova emb., 6, Russia. E-mail: momitek@mail.ru.
Zakharov Gennady Aleksandrovich — senior laboratory assistant. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Lab. of neurogenetics. Saint-Petersburg, 199034 Makarova emb., 6, Russia. E-mail: Gennadiy.Zakharov@gmail.com.
Popov Andrey Vladimirovich — Head of the laboratory. Sechenov Institute of Evolutionary Physiology and Biochemistry of the Russian Academy of Sciences, Lab.of Neuroethology of Insects. 194223, Saint-Petersburg, pr. Torez 44, Russia. E-mail: office@iephb.ru.
Savvateeva-Popova Elena Vladimirovna — senior laboratory assistant. Pavlov Institute of Physiology, RAS, Lab. of neurogenetics. Saint-Petersburg, 199034 Makarova emb., 6, Russia. E-mail: esavvateeva@mail.ru.
