CC BY
16
Reviews. — 2001. — V. 81, № 3. — P. 1031-1064.
35. Vincent AD, Wang XY, Parsons SP, Khan WI, Huizinga JD. Abnormal absorptive colonic motor activity in germ free mice is rectified by butyrate, an effect possibly mediated by mucosal serotonin // Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol. 2018 Aug 10. doi: 10.1152/ajpgi.00237.2017.
36. Wu W. C., Zhao, W., & Li, S. Small intestinal bacteria overgrowth decreases small intestinal motility in the NASH rats // World journal of gastroenterology. -2008, 14, №2: 313 -317.
37. Wu R. Y., Pasyk M., Wang B., Forsythe, P., Bienenstock, J., Mao, Y. K., Kunze, W. A. Spatiotemporal maps reveal regional differences in the effects on gut motility for Lactobacillus reuteri and rhamnosus strains // Neurogastroenterology & Motil^ - 2013, 25, №3: 205-214.
38. Yang H, Wang B, Wang T, Xu L, He C, Wen H, YanJ, Su H, Zhu X. Toll-Like receptor 4 prompts human breast cancer cells invasiveness via Lipopolysaccharide stimulation and is overexpressed in patients with lymph node metastasis // PLOS ONE.2014. e109980.
УДК 575.21
Медведева А.В.1, Никитина Е.А.1'2, Токмачева Е.В.1, Захаров Г.А.1, Васильева С.А.1, Журавлев А.В.1, Ермилова А.А.2, Савватеева-Попова Е.В.1
АПРОБИРОВАНИЕ МЕТОДОВ ЭКСПРЕСС-ДИАГНОСТИКИ ГЕНОМНЫХ БОЛЕЗНЕЙ НА МОДЕЛИ СИНДРОМА УИЛЬЯМСА У ДРОЗОФИЛЫ
1 Институт физиологии им. И.П. Павлова РАН, Санкт-Петербург 2Российский государственный педагогический университет им. А.И. Герцена, Санкт-Петербург avmed56@mail.ru
Резюме. В целях разработки методов ранней диагностики геномных заболеваний, в частности обусловленных вариациями генетического материала (genomic copy number variants (CNVs)), было проведено 4Cseq исследование пространственной организации ядер нервного ганглия в области локализации гена limk1. Ген limk1, кодирует LIM kinase 1 - регулятор динамики актина. Каскад ремоделирования актина является связующим звеном мультифакторных синдромов и ответственен за нейрокогнитивное фенотипическое проявление.
1024
Создана модель Williams Beuren Syndromes (WBS) у дрозофилы — мутант по гену limk1 agnts3, содержащий инсерции в районе локализации гена. Выявленные совместно локализованные с limk1 гены вносят вклад в широкий спектр биологических процессов характерных для мутанта agnts3, в том числе, в процессы клеточного деления, репарации двухцепочечных разрывов посредством рекомбинации, что является основным механизмом формирования CNVs синдромов, а также перестроек, которые в анафазе митоза выглядят, как мосты. В связи с этим предлагается использовать именно ана-телофазный метод для раней диагностики геномных заболеваний.
Ключевые слова: геномные болезни, пространственная организация ядра, ремоделирование актина.
Summary. Medvedeva A.V., Nikitina E.A., Tokmacheva E.V., Zacharov G.A., Gorohova C.A., Zhuravlev A.V., Ermilova A.A., Savvateeva-Popova E.V. Approving the methods of express diagnostics of genomic diseases in a model of Williams syndrome in drosophiles.
In order to develop methods for the early diagnosis of genomic diseases, in particular due to genomic copy number variants (CNVs) was held the 4Cseq investigation of the spatial organization of the cell nucleus of the nerve ganglies in the site of gene limk1 localization. Gene limk1 encodes the LIM kinase 1-actin dynamics regulator. The actin remodeling cascade is a link between multifactorial syndromes and responsible for neurocognitive phenotypic manifestation. Model of the Williams Beuren Syndromes (WBS) is created in drosophila — mutation for the gene limk1 agnts3containing insertions in the region of gene localization. Identified jointly localized with limk1 genes contribute to a wide range of biological processes characteristic of the mutant agnts3 including the processes of cell division, repair of double-stranded breaks through recombination, which is the main mechanism of the CNVs syndroms formation and also rearrangements that look like bridges in anaphase of mitosis. In this regard, it is proposed to use an ana-telophase method for early diagnosis of genomic diseases.
Keywords: genomic diseases, spatial organization of the cell nucleus, actin remodeling.
Существование в геноме «горячих точек», областей, содержащих повторяющиеся последовательности, является фактором риска в связи с тем, что способность повторов к неаллельной гомологичной рекомбинации приводит
1025
к появлению так называемых вариаций числа копий генов (genomic copy number variants (CNVs)) и малых, иногда менее 10 bp, инсерций и делеций (INDELs). Оказалось, что именно изменение организации ядра в связи с наличием CNVs, влияет на экспрессию пограничных генов, находящихся дистальнее точек разрыва и воссоединения ДНК. 4Cseq исследования показали, что гены, локализованые в этих районах, формируют хроматиновую петлю, при CNVs в одном из районов наблюдается изменение организации хромосомы и, соответственно экспрессии, в том числе, пограничных генов [1, 2]. Одним из синдромов, вызванных CNVs, является Williams Beuren Syndromes (WBS), проявлением которого является эльфоидная внешность, кардио-васкулярная патология, гиперсоциальность, визуально-пространственный дефект [3]. В лаборатории создана модель WBS на дрозофиле с мутационным повреждением гена limkl — agnostic (agnts3). Мутант agnts3 содержит вставку 28 п.н. в интрон 1 гена limkl, а также инсерцию мобильного S-элемента семейства Tc1/mariner на расстоянии 460 п.н. от 3'UTR limkl [4]. Транспозоны семейства Tc1/mariner часто ассоцируются с горячими точками неаллельной гомологичной рекомбинации, в случае WBS неалельная рекобинация наблюдается по длинным повторам, содержащим элемент Hsmar2. Для синдрома характерно зеркальное фенотипическое проявление: делеция 25 генов в 7q11.23 вызывает гиперобщительность пациентов, в то время как дупликация соответствующего района приводит к аутизму и шизофрении [5]. В работах B. M. vonHoldt показано, что в случае инсерции транспозона вблизи генов, гемизиготное состояние которых приводит к WBS (WBSCR17, LIMK1, GTF2I, WBSCR27, BAZ1B, and BCL7B), наблюдается гиперсоциальный, доместикационный эффект [6]. При изучении формирования памяти в парадигме условно-рефлекторного подавления ухаживания, оказалось, что мутант демонстрирует поведение, сходное с гиперсоциальным у доместицированных животных [7, 8]. В связи с этим возможно использование данной модели для поиска диагностических тестов и терапии «зеркальных нейропатологий», обусловленных, в том числе наличием мобильных элементов. Районом цитологической локализации agnostic является 11АВ Х хромосомы, принадлежащий к интеркалярному гетерохроматину, для которого характерна недорепликация, наличие палиндромов, эктопическая конъюгация. Эктопические контакты отражают совместную локализацию в ядре контактирющих районов хромосом. Было показано, что район 11АВ линии agnts3 в 3 раза чаще формирует негомологичные контакты по сравнению с
1026
линией дикого типа. C помощью метода 4C-seq нам удалось выявить гены дрозофилы, формирующие пространственные контакты с limk1 [9]. Оказалось, что каждый ген, взаимодействующий с limk1, вносит вклад в широкий спектр биологических процессов от гена к поведению, выявленных на основе анализа мутанта agnts3. Множественная фенотипическая манифестация дупликационно-делеционных синдромов, по-видимому, связана не только с нарушением экспрессии отдельных затронутых перестройкой генов, но и с повреждением функции всех, совместно локализованных в пространстве ядра. В целях разработки методов ранней диагностики геномных заболеваний, наибольший интерес представляют гены, совместно локализованные с limk1, которые отвечают за процессы клеточного деления, организацию хромосом, репарацию двухцепочечных разрывов. То есть те из них, фенотипическое проявление которых удобно использовать для экспресс-диагностики. К таким генам, в частности, относятся Dmel\CG5270 (цитологическая локализация 86E5-86E5) - продукт гена вовлечен в репарацию двухцепочечных разрывов через гомологичную рекомбинацию, принимает участие в цитокинезе; Dmel\CG3339 (97F1-97F2) — тяжелая цепь динеина, участвует в захвате хромосом, контроле сборки митотического веретена деления и присоединении микротрубочек к кинетохору и др. [10, 11], совместно с актином и миозоном динеин участвует в организации хромосомных территорий [12]; Dmel\Xpd -Xeroderma pigmentosum D (57C7-57C7) - АТФ-зависимая ДНК хеликаза. Xpd входит в состав коровой субъединицы многофункционального комплекса TFIIH, сочетающего регуляцию транскрипции (XPD and XPB ATPases/DNA helicases) и эксцизионую репарацию (p62, p52, p44, p34, and p8), также в его состав входят субъединицы, контролирующие клеточный цикл (cyclin-dependent kinase CDK7, cyclin H, MAT1), что обусловливает регуляцию веретена деления и расхождения хромосом в ана-телофазе [13] и регуляцию двунитевых разрывов ДНК, падение экспрессии Xpd снижает уровень фосфорилирования H2Av [14]. Совместная локализация этих генов и limk1 позволяет объяснить результаты исследования нарушений митоза в нервных ганглиях личинок дрозофилы ана-телофазным методом у мутанта agnts3 и линии дикого типа CS, и их реципрокных гибридов. Для того, чтобы выявить роль Х-хромосомы, содержащей мутантную аллель agnts3 были проанализированы реципрокные гибриды, различающиеся только по генетическому материалу половых хромосом. Анализ профиля и частоты перестроек показал, что наличие дополнительного генетического материала приводит к различного рода
1027
нарушениям клеточных делений. Так у самок agnts3 наблюдается достоверное увеличение частоты перестроек, что возможно связано с наличием у agnts3 множества сайтов, способствующих альтернативной конформации ДНК, в центре которых формируются двухцепочечные разрывы, что приводит к формированию фрагментов и, в ряде случаев, мостов [4]. Гетеро- и гемизиготное состояние аномального локуса (самцы agnts3, самцы F1 от скрещивания agnts3xCS, самки F1 от скрещивания agnts3xCS и CSxagnts3) способствует формированию мостов. По-видимому, в отличие от гомозиготного состояния у самок agnts3, отсутствие гомолога вызывает нарушение конъюгации хромосом, «выпетливание» дополнительного материала хромосомы в соседний компартмент, что способствует межхромосомным контактам и формированию транслокаций. Транслокации являются, в том числе, результатом ошибок репарации и особенностей межхромосомных взаимодействий, обеспечиваемых динеиновым мотором [12]. Мосты могут появляться и при сохраняющейся когезии сестинских хроматид наряду с расхождением центромер к разным полюсам [15,16]. Во всех вышеперечисленных случаях наблюдается увеличение числа отставших хромосом. Отставание хромосомы происходит в результате присоединения микротрубочек противоположных полюсов к одному и тому же кинетохору [17]. По-видимому, именно дисфункция динеина обусловливает отставание хромосом. Динеин не только участвует в перемещении хромосом по веретену деления, но и является компонентом контрольной точки сборки веретена деления (spindle assembly checkpoint (SAC) signaling) и присоединения микротрубочек к кинетохору [18, 19]. Все перечисленные перестройки не всегда сопровождаются гибелью клетки, но приводят к различным типам анеу- и полиплоидии, с которыми связаны большинство когнитивных дисфункций [20, 21]. Низкий уровень перестроек характерен только для особей, не содержащих инсерций в локусе agnostic — самцов F1 от скрещивания CSxagnts3. Результаты исследования позволяют предложить для ранней диагностики геномных заболеваний ана-телофазный метод исследования делящихся тканей, в частности буккального эпителия.
Список литературы
1. Gheldof N., Witwicki R., Migliavacca E., Leleu M., Didelot G., Harewood L., Rougemont J., Reymond A. Structural Variation-Associated Expression Changes Are Paralleled by Chromatin Architecture Modifications. PLoS One. 2013. 8(11): e79973.
doi: 10.1371/journal.pone.0079973),
2. Loviglio M., Leleu M., [...], Reymond A. Chromosomal contacts connect loci associated with autism, BMI and head circumference phenotypes. Molecular Psychiatry. 2017. 22: 836-849
3. Hoogenraad C., Akhmanova A., Galjart N., De Zeeuw C. LIMK1 and CLIP-115: linking cytoskeletal defects to Williams syndrome. Bioessays. 2004. 26(2):141-50
4. Savvateeva-Popova et al., Drosophila Model for the Analysis of Genesis of LIM-kinase 1-Dependent Williams-Beuren Syndrome Cognitive Phenotypes: INDELs, Transposable Elements of the Tc1/Mariner Superfamily and MicroRNAs. Frontiers in Genetics. Section Behavioral and Psychiatric Genetics. 2017. doi: 10.3389/fgene.2017.00123
5. Medrano-Fernandez A., Barco A. Nuclear organization and 3D chromatin architecture in cognition and neuropsychiatric disorders. Mol Brain. 2016, 9: doi:10.1186/s13041-016-0263-x
6. Von Holdt et al. Structural variants in genes associated with human Williams -Beuren Syndrome underlie stereotypical hypersociability in domestic dogs. Sci Adv. 2017 3(7):e1700398
7. Никитина Е.А., Медведева А.В., Захаров Г.А., Савватеева-Попова Е.В. Синдром Уильямса как модель изучения пути гены - мозг - когнитивные функции: генетика и эпигенетика. Acta Naturae. 2014. Т.6. №1 (20). С. 9-23.
8. Никитина Е.А., Медведева А.В., Захаров Г.А., Савватеева-Попова Е.В. Локус agnostic дрозофилы: вовлеченность в становление когнитивных нарушений при синдроме Уильямса. Acta Naturae. 2014. Т.6. №2 (21). С. 58-66
9. Е.А. Никитина, А.В. Медведева, А.В. Журавлев, С.А. Васильева, Е.В. Токмачева, Г.А. Захаров, Е.В. Савватеева-Попова. Роль гена limk1 дрозофилы в формировании пространственной организации ядра. Цитология, 2018, (в печати)
10. Raaijmakers JA, Medema RH. Function and regulation of dynein in mitotic chromosome segregation. Chromosoma. 2014 0ct;123(5):407-22. doi: 10.1007/s00412-014-0468-7
11. Simoes PA, Celestino R, Carvalho AX, Gassmann R. NudE regulates dynein at kinetochores but is dispensable for other dynein functions in the C. elegans early embryo. J Cell Sci. 2018. 8;131(1). pii: jcs212159. doi: 10.1242/jcs.212159
12. Maizels Y, Gerlitz G.Shaping of interphase chromosomes by the microtubule network. FEBS J. 2015; 282(18):3500-24. doi: 10.1111/febs.13334. Epub 2015 Jun 19.
13. Li X, Urwyler O, Suter B. Drosophila Xpd regulates Cdk7 localization, mitotic kinase activity, spindle dynamics, and chromosome segregation. PLoS Genet. 2010. 12; 6(3):e1000876. doi: 10.1371/journal.pgen.1000876
14. Eunbyul Yeom, Sung-Tae Hong, and Kwang-Wook Choi. Crumbs and Xpd in mitosis. Oncoscience. 2015; 2(10): 821-822.
15. Daniela Cimini, Marta Mattiuzzo, Liliana Torosantucci, Francesca Degrassi, Histone Hyperacetylation in Mitosis Prevents Sister Chromatid Separation and Produces Chromosome Segregation Defects, Mol Biol Cell. 2003. 14(9): 3821-3833
16. Grasiella A. Andriani, Jan Vijg, Cristina Montagna, Mechanisms and consequences of aneuploidy and chromosome instability in the aging brain, Mech Ageing Dev. 2017; 161(Pt A): 19-36.
17. Juraj Gregan, Silvia Polakova, Lijuan Zhang, Iva M. Tolic-N0rrelykke, Daniela Cimini, Merotelic kinetochore attachment: causes and effects, Trends Cell Biol. 2011; 21(6): 374-381
18. Barisic M, Maiato H. Dynein prevents erroneous kinetochore-microtubule attachments in mitosis. Cell Cycle. 2015; 14(21):3356-61. doi: 10.1080/15384101.2015.1089369;
19. McHugh T, Welburn JP. Dynein at kinetochores: Making the connection. J Cell Biol. 2017; 216(4):855-857. doi: 10.1083/jcb.201703054
20. Neil J Ganem, David Pellman, Linking abnormal mitosis to the acquisition of DNA damage, J Cell Biol. 2012;199(6):871-81. doi: 10.1083/jcb.201210040.
21. Yurov YB, Iourov IY, Vorsanova SG, Liehr T, Kolotii AD, Kutsev SI, Pellestor F, Beresheva AK, Demidova IA, Kravets VS, Monakhov VV, Soloviev IV. Aneuploidy and confined chromosomal mosaicism in the developing human brain. PLoS One. 2007; 2(6):e558.
