CC BY
27
ЛОКАЛЬНАЯ ЛИМФОЦИТАРНАЯ РЕГУЛЯЦИЯ ВОССТАНОВЛЕНИЯ КРОВЕТВОРНОЙ ТКАНИ ОБЛУЧЕННЫХ
РЕЦИПИЕНТОВ МИЕЛОТРАНСПЛАНТАТА НА УРОВНЕ ИХ
КОСТНОГО МОЗГА
Н-Н. Попов1, Е.А. Романова2, С.Б. Лавелин1
Харьковский национальный университет имени В.Н. Каразина
2Институт микробиологии и иммунологии имени И.И. Мечникова АМН Украины, г. Харьков РЕЗЮМЕ
После тотального облучения в дозе 9 Гр мышей линии (CBAxC57BL)F1 и последующей сингенной миело- и лимфомиелотрансплантации на 30-е сутки исследования отмечена высокая супрессия лимфоцитами костного мозга реципиентов пролиферации стимулированных спленоцитов in vitro. Более выраженная супрессорная активность наблюдалась у лимфоцитов реципиентов лимфомиелотранспла-нтата по сравнению с клетками животных, получавших миелокариоцити рег se. Фенотипическое исследование Т-истощенной фракции лимфоцитов костного мозга обнаружило, что супрессорными свойства обладают клетки фенотипа ноль-лимфоцитов и клетки, экспрессирующие sIg-молекулы.
КЛЮЧЕВЫЕ СЛОВА: трансплантация, костный мозг, лимфоциты, регуляция
Трансплантация костного мозга является эффективным способом лечения гипо- и аплазий кроветворной ткани, тяжелых им-мунодефицитных состояний, лимфо- и мие-лопролиферативных заболеваний [1, 2]. Однако, экспериментальные и клинические данные свидетельствуют о том, что наиболее значимой в период ранней послетрансплан-тационной реконституции предстает проблема ее задержки для лимфомиелоидных органов, следствием чего часто становятся инфекционные и неинфекционные осложнения, способные в ряде случаев приводить к фатальному исходу [3, 4]. Принимая во внимание участие лимфоцитов в процессах ге-мопоэза, пролиферации и дифференцировки кроветворных предшественников [5], а также в процессах репаративной регенерации разнообразных тканей [6], особый интерес представляет усовершенствование трансплантата костномозговых клеток путем обогащения его лимфоидными клетками с целью повышения эффективности для восстановления гематологического и иммунного статуса реципиентов с дефицитом кроветворения.
Первостепенную значимость для оценки полноценности восстановления костного мозга у реципиентов такого комбинированного трансплантата приобретает определение локальных механизмов, контролирующих и регулирующих процессы реконституции гемопоэтической ткани на уровне стволовых кроветворных клеток и их миелоид-ных и лимфоидных потомков, что и явилось целью настоящей работы.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Исследования были проведены на самцах мышей линии (СБАхС57БЬ)Р1 6-10 - недельного возраста, массой 20-22 г. Живот-
ных подвергали тотальному рентгеновскому облучению в дозе 9 Гр с помощью установки РУМ-17. Через 6-8 часов после облучения животным 1-й группы проводили сингенную трансплантацию, внутривенно вводя 5х106 костномозговых клеток на мышь; животным 2-й группы - 5х106 клеток костного мозга совместно с 20x106 тимоцитов на мышь внутривенно в одном шприце. Контрольной группой служили интактные животные той же линии, возраста, пола и веса, что и в двух опытных группах. Для определения каждого показателя от каждой группы было использовано по 20 животных.
Супрессорную активность лимфоцитов костного мозга и их отдельных популяций у облученных животных, защищенных миело-кариоцитами per se и лимфомиелотранс-плантатом, определяли по коэффициенту супрессии (Ks) стимулированных ЛПС ("Sigma") и ФГА ("Difko") нормальных мышиных клеток селезенки на модели Атаул-лаханова [7].
Чистую популяцию sIg+ и ноль-клеток из суспензии Т-истощенных лимфоцитов костного мозга получали методом пеннинга на чашках Петри, нагруженных IgG-фракцией антииммуноглобулиновой сыворотки [8]. Популяции FcR+ и C3R- клеток получали методами ЕА- и ЕАС-розеткообразования [9, 10] с дальнейшим седиментационным разделением клеток в градиенте плотности 1,096 фиколла-верографина. Лизис эритроцитов проводили в 0,83%-ом растворе NH4C1 в трис-буфере.
Статистическую обработку результатов проводили с использованием пакета программ Microsoft Excel 97.
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ
Изучение функциональной активности
лимфоцитов костного мозга показало, что с 20-х суток в бедренной кости облученных реципиентов как лимфомиелотрансплантата, так и миелотрансплантата, появляются лимфоциты, супрессирующие включение 3Н-тимидина в стимулированные ФГА и ЛПС сингенные клетки селезенки нормальных (интактных) мышей. В этот период супрессорная активность лимфоцитов облученных реципиентов как 1-й, так и 2-й групп достигает уровня значений, присущего клеткам нормального костного мозга, а с 30-х пострадиационных суток превышает его в 1,31,8 раз до конца третьего месяца исследования - в 1-й и до конца второго - во 2-й группе (табл. 1, 2).
Таблица 1
Коэффициент супрессии (Кз) включения 3Н-тимидина в стимулированные ЛПС клетки селезенки нормальных мышей лимфоцитами бедренной кости облученных реципиентов миелотрансплантата (1) и лимфомиелотранс-плантата (2) (М±т)
1. Супрессорная активность (Кб) лимфоцитов костного мозга нормальных животных по отношению к нормальным клеткам селезенки, стимулированным ЛПС, составляет 2,0±0,10 отн.ед.
2. *-достоверность отличий по сравнению с нормой (р<0,05); ** - достоверность отличий показателей животных группы 2 по сравнению с показателями животных группы 1 (р<0,05).
Табли3ца 2
Коэффициент супрессии (К«) включения 3Н-тимидина в стимулированные ФГА клетки селезенки нормальных животных лимфоцитами бедренной кости облученных реципиентов миелотрансплантата (1) и лимфомие-лотрансплантата (2) (М±т)
1. Супрессорная активность (Кб) лимфоцитов костного мозга нормальных животных по отношению к нормальным клеткам селезенки, стимулированным ФГА, составляет 2,4 + 1,3
отн. ед.
2. *-достоверность отличий по сравнению с нормой (р<0,05); ** - достоверность отличий показателей животных группы 2 по сравнению с показателями животных группы 1 (р<0,05).
Из полученных нами данных следует, что до 60-х суток более выразительная супрессорная активность лимфоцитов отмечается у
животных, получивших комбинированный трансплантат, по сравнению с реципиентами миелокариоцитов per se. Однако, на протяжении третьего месяца после облучения и трансплантации у реципиентов 2-й группы эта активность угасает, тогда как у мышей 1й группы она остается достоверно повышенной до конца периода исследования (90-х суток). По отношению непролиферирующих клеток лимфоциты костного мозга реципиентов ингибирующего действия не оказывали.
Фенотипическое изучение супрессорных клеток облученных реципиентов 1-й и 2-й групп было проведено на начальных этапах их активности - на 30-е сутки после облучения и трансплантации и в конце периода исследования - на 60-е сутки. В эти периоды из суспензии лимфоцитов костного мозга и селезенки реципиентов были выделены отдельные популяции sIg+, FcR+, C3R+ и ноль-клеток. Было обнаружено, что в лимфоидном пуле клеток костного мозга у животных как 1-й, так и 2-й групп на протяжении обоих периодов исследования основное супрессорное действие производят ноль-лимфоциты и sIg-клетки.
Очевидно, что простое суммирование супрессорной активности этих двух популяций лимфоцитов составляет несколько более высокую величину, чем величина супрессорной активности (Кб) общей популяции Т-исто-щенных клеток костного мозга. У обеих групп животных ноль-клетки костного мозга обладают более высокой супрессорной активностью по сравнению с sIg-клетками. Нами также установлено, что в 1-й и 2-й группах животных супрессорными свойствами обладают FcR-клетки, а С^+-клетки подобных свойств не обнаруживают. Таким образом, очевидно, на ноль- и sIg-клетках, оказывающих супрессорное действие, экспрессируются Рс-рецепторы. Для популяции костномозговых клеток интактных мышей характерно проявление супрессорной активности ноль-лимфоцитами и в незначительной степени - sIg-клетками.
Фенотипический анализ показал, что по поверхностным характеристикам супрессорные клетки костного мозга, полученные на 30-е и 60-е сутки после облучения и трансплантации, мало отличаются от супрессорных клеток интактного костного мозга.
Анализ содержания и функциональной активности ноль-лимфоцитов костного мозга в разные сроки после облучения и трансплантации клеток показал, что ноль-лимфоциты ранних сроков главным образом представлены популяцией незрелых лимфоцитов, а неспецифические супрессорные клетки,
Сутки после облучения и трансплантации 1 2
10 0,95±0,05* 0,96± 0,05*
15 1,0±0,05* 1,2±0,05*'**
20 2,0±0,10 2,2±0,11
30 3,0±0,20" 4,0± 0,22*""
45 3,0±0,18" 3,7±0,20*""
60 2,8±0,18* 2,5±0,14*
90 2,7±*0,14* 2,2±0,12
Сутки после облучения и трансплантации 1 2
10 0,96±0,05* 0,96±0,05*
15 1,2±0,06* 1,4±0,06*""
20 2,2±0,11 2,7±0,13"
30 3,6±0,22* 4,4±0,24*"**
45 3,2±0,18* 4,0±0,20*""
60 3,2±0,20* 3,0±0,17*
90 3,1±0,15 2,5±0,13"
формирующиеся с 30-х суток, являются особой клеточной популяцией. Можно предположить, что на этом этапе неспецифическое супрессорное действие лимфоцитов костного мозга опосредуется популяцией зернистых лимфоцитов, не имеющих маркеров Тили В-лимфоцитов. Установлено, что клетки этого типа хорошо переносят облучение и после него способны активно репопулиро-вать лимфоидную ткань. Вероятно, что увеличение количества и/или активности ноль-клеток с супрессорными свойствами в костном мозге связано с интенсивностью гемо- и лимфопоэза в органе в начальный пост-трансплантационный период, а также является результатом активного взаимодействия клеток донорского и хозяйского типов на этапе становления клеточности костного мозга.
Полученные нами данные об индукции супрессорных клеток в костном мозге животных после облучения и миелотрансплан-тации свидетельствуют о механизме активной супрессии иммуногенеза у сингенных радиационных химер. Результаты этих исследований могут служить одним из возможных объяснений продолжительной депрессии антителообразующей способности у облученных животных, защищенных костным мозгом, которая на протяжении второго пострадиационного месяца составляет 6070% по сравнению с показателями интакт-ных животных, а также сниженной, по сравнению с нормой, бластогенной реакцией лимфоцитов на митогены.
Повышенная активность супрессорных клеток в костном мозге может также подавлять продукцию in situ прекурсоров АОК и оказывать супрессирующее влияние на все активно пролиферирующие клетки.
Активное влияние супрессорных клеток на гемопоэз может также служить причиной волнообразного характера восстановления клеточности в костном мозге облученных реципиентов, защищенных миелотрансплан-татом.
Следует отметить, что супрессорная активность лимфоцитов костного мозга реципиентов комбинированного лимфомиело-трансплантата, являясь более выраженной на первых этапах появления этих клеток (второй посттрансплантационный месяц), в дальнейшем снижается, полностью нормализуясь к 90-м суткам. Это может свидетельствовать о регулирующей способности введенных тимоцитов в отношении супрессорного эффекта, оказываемого лимфоцитами костного мозга на пролиферирующие клетки. Благодаря влиянию введенных Т-клеток, это действие костномозговых лимфоцитов
постепенно нивелируется по мере восстановления клеточности органа. Возможно, в данном случае срабатывает механизм ограничения перепроизводства клеток в восстанавливаемом органе, обеспечивая постепенный, линейный характер реконституции миелокароцитов у реципиентов комбинированного лимфомиелотрансплантата.
ВЫВОДЫ
1. Реконституция костного мозга летально облученных реципиентов лимфомиело-трансплантата, как и миелотранспланта-та, сопровождается появлением среди миелокариоцитов супрессорных клеток, имеющих фенотипы ноль- и sIg-лимфоцитов и экспрессирующих Fc-рецепторы.
2. У реципиентов лимфомиелотранспланта-та супрессорные клетки проявляют повышенную активность с 20-х по 60-е пострадиационные сутки, тогда как при трансфузии миелокариоцитов per se она продолжает регистрироваться до 90-х суток.
3. Супрессорные клетки костного мозга облученных реципиентов миело- и лим-фомиелотрансплантата оказывают влияние только на стимулированные, активно пролиферирующие клетки.
Учитывая, что регуляция гемо- и миело-поэза в организме осуществляется как путем непосредственного клеточного взаимодействия, так и посредством факторов, содержащихся в сыворотке, предметом дальнейших исследований механизмов, контролирующих востановление гемопоэза облученных реципиентов лимфомиелотрансплантата, на наш взгляд, должно стать модулирующее влияние сыворотки на реконституцию костного мозга, а также природа сывороточных компонентов, производящих подобное действие.
ЛИТЕРАТУРА
1. Collins R.N. // Lancet. - 1997. - № 9050. - P. 881-887.
2. Donall Т.Е. // Brit. J. Haematol. - 1999. - № 2. - P. 330-339.
3. Лисуков И. А., Крючкова И.В., Кулагин А. Д., и др. // Терапевт, арх. - 1998. - №7. - С. 78-79.
4. Carreras E., Bertz H., Arcese W., et. Al. // Blood. - 1998. - № 10. - P. 3599-3604.
5. Гольдберг Е.Д., Дыгай A.M. Роль лимфоцитов в регуляции гемопоэза. -Томск. - 1983. - 189 с.
6. Бабаева А.Г. Регенерация и система иммуногенеза. -М.:Наука. -1985. - 212 с.
7. Атауллаханов Р.И., Хаитов P.M., Сидорович Г.Г., и др.//Цитология.- 1980.- Т.22.- №8. - С. 966-970.
8. Mage M.G., McHugh L.L., Rothstein NX. // Immunol. Meth. - 1977. - Vol. 15. - № 1. - P. 47-56.
9. Lymdsten Т., Andersson B. // Cell Immunol, - 1981. - Vol. 61. - № 2. - P. 386-396.
10. Miyama M., Kuribayashi K., Yodai J. // Cell. Immunol. - 1978. - Vol. 35. - № 2. - P. 253-265.
