CC BY
82
ишемической болезнью сердца и атеротромботическим вариантом мозгового инсульта. Клиническая лабораторная диагностика. 2006; 5: 9-12.
6. Wehkamp J., Fellermann K., Herrlinger K.R., Bevins C.L., Stange E.F. Mechanisms of disease: defensins in gastrointestinal diseases. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2005; 2(9): 406-15.
7. Hattar K., Franz K., Ludwig M. et al. Interactions between neutrophils and NSCLC cells in vitro effects on neutrophil inflammatory mediator generation and tumour cell proliferation. J. Clin. Oncol. 2009; (Suppl.): abstr. e22148.
8. Hattar K., Heygster D., Eul B., Banat A., Fink L., Draing C. et al. Amplification of LPS and LTA induced cytokine synthesis in NSCLC/ neutrophil co-cultures. J. Clin. Oncol. 2008; (Suppl.): abstr. e22198.
REFERENCES
1. Lipid metabolism management for atherosclerosis prophylaxis and treatment. Russian recommendation, V edition. Rossiskiy kardiologicheskii zhurnal. 2012; 4 (Suppl.). (in Russian)
2. Titov V.N. Lipid acids, lipids (lipid acids transport forms) and apo-lipoproteins (lipid caring molecules) - one functional system. Klin-icheskaja laboratornaja diagnostika. 2007; 1: 3-9. (in Russian)
3. Higazi A.A., Nassar T., Ganz T., Rader D.J., Udassin R., Bdeir
K. et al. The alpha-defensins stimulate proteoglycan-dependent catabolism of low-density lipoprotein by vascular cells: a new class of inflammatory apolipoprotein and a possible contributor to atherogenesis. Blood. 2000; 96(4): 1393-8.
4. Tuev A.V., Mishlanov V.Ju. The method of progressive stenocardia diagnosis in the heart coronary disease patients. Patent RF № 2194995, 2002. (in Russian)
5. Mishlanov V.Ju., Tuev A.V., Shutov A.A., Baydina T.V., Syutkina O.V., Obukhova O.V. Method lipid-releasing leukocytes ability in the diagnosis of mechanisms atherosclerosis in patients with coronary heart disease and variant atherothrombotic stroke. Klinicheskaja laboratornaja diagnostika. 2006; 5: 9-12. (in Russian)
6. Wehkamp J., Fellermann K., Herrlinger K.R., Bevins C.L., Stange E.F. Mechanisms of disease: defensins in gastrointestinal diseases. Nat. Clin. Pract. Gastroenterol. Hepatol. 2005; 2(9): 406-15.
7. Hattar K., Franz K., Ludwig M. et al. Interactions between neutrophils and NSCLC cells in vitro effects on neutrophil inflammatory mediator generation and tumour cell proliferation. J. Clin. Oncol. 2009; (Suppl.): abstr. e22148.
8. Hattar K., Heygster D., Eul B., Banat A., Fink L., Draing C. et al. Amplification of LPS and LTA induced cytokine synthesis in NSCLC/ neutrophil co-cultures. J. Clin. Oncol. 2008; (Suppl.): abstr. e22198.
Поступила 02.10.13
© ОСОЧУК С.С., МАРцИНКЕВИЧ А.Ф., 2014 УДК 612.111.1:796.071].083
Осочук С.С., Марцинкевич А.Ф.
липидный состав мембран эритроцитов у спортсменов циклических видов спорта
Витебский государственный медицинский университет Минздрава Республики Беларусь, 210023, Витебск
Исследован состав липидов мембран эритроцитов у спортсменов циклических видов спорта с квалификацией от 1-го взрослого разряда до мастера спорта и лиц, не занимающихся спортом. Проведен количественный и качественный анализ фосфолипидных фракций и жирно-кислотного спектра сфингомиелина (СФМ) и фосфатидилхолина (ФХ). У спортсменов статистически значимо увеличено количество СФМ и ФХ, а также процентное содержание ФХ и снижено процентное содержание фосфатидилэтаноламина (ФЭА). Отношение СФМ/ФХ было ниже на 52,3%. В жирно-кислотном спектре СФМ и ФХ спортсменов оказалось сниженным процентное содержание С14:0 и С16:0, в ФХ отмечено увеличение содержания С16:1, в СФМ увеличилось содержание С18:3. Отношение сумм насыщенных к полиненасыщенным жирным кислотам (ПНЖК) было ниже у спортсменов. Полученные результаты говорят о существенных изменениях в мембранах эритроцитов, обусловленных регулярными физическими нагрузками и, вероятно, способствующих росту функциональной активности.
Ключевые слова: мембрана эритроцита; фосфолипиды; спорт. S.S. Osotchuk, A.F. Martsinkevitch
THE LIPID COMPOSITION OF MEMBRANES OF ERYTHROCYTES IN ATHLETES OF CYCLIC TYPES OF SPORT
The Vitebsk state medical university of Minzdrav of Republic of Belarus, 210023 Vitebsk, Republic of Belarus
The lipid composition of membranes of erythrocytes in athletes of cyclic types of .sport with qualification from first adult class to Master of Sports and persons doing no sports was analyzed. The qualitative and quantitative analysis ofphospholipid fractions and fatty-acid specter of sphingomyelin and phosphatidylcholine was implemented. In athletes, amount of sphingomyelin and phosphatidylcholine and percentage content of phosphatidylcholine were significantly increased. The percentage content of kefalin was also decreased. The ratio of sphingomyelin/phosphatidylcholine was lower on 52.3%. In fatty-acid specter of sphingomyelin and phosphatidylcholine of athletes the percentage of C14:0 and C16:0 was decreased. In phosphatidylcholine increase of content of C16:1 was noted and in sphingomyelin content of C18:3 was increased. The ratio of sums of saturated fatty acids/ polyunsaturated fatty acids were lower in athletes. The study results testify significant alterations in membranes of erythrocytes caused by regular physical loads and probably favoring increase of functional activity.
Keywords: membrane of erythrocyte; phospholipid; sport. Для корреспонденции:
Осочук Сергей Стефанович, д-р мед. наук, проф., зав. ЦНИЛ Адрес: 210023, Витебск, пр. Фрунзе, 27 E-mail: oss62@mail.ru
Введение. Работоспособность спортсменов зависит от эффективности переноса кислорода к органам и тканям, что обусловлено преобладанием коэффициента полезного действия (КПД) аэробного распада глюкозы над КПД анаэробного. Элементарным звеном кислородтранспортной системы является эритроцит, мембрана которого активно участвует в доставке кислорода к рабочим органам и элиминировании из них углекислого газа. Диффузия газов через мембрану эритроцита представляет собой активный процесс, который осуществляется при помощи специфических переносчиков - аквапоринов-1 [1-3]. Их активность как мембранных каналов детерминируется составом и физико-химическими свойствами мембраны [4]. Непосредственное влияние на активность трансмембранных каналов оказывают прибел-ковые (аннулярные) липиды (сфингомиелины (СФМ) и хо-лестерол (ХС)) [5]. Общий липидный пул в значительной степени формируется фосфатидилхолинами (ФХ) [6] и активно обменивается фосфолипидами и ХС с аннулярным липидным пулом. Поскольку эритроцит является безъядерной клеткой, обновление липидного бислоя происходит посредством обмена с липопротеиновыми комплексами (ЛПК) крови [7]. Располагая информацией о наиболее выгодной с точки зрения работоспособности липидной композиции мембран эритроцитов, можно осуществлять ее коррекцию у тренирующихся спортсменов путем фармакологического или диетического воздействия на ЛПК. В доступной научной литературе не нашли отражения особенности липидного состава мембран эритроцитов у спортсменов, в связи с чем целью нашего исследования было изучение липидного состава, а также жирно-кислотного спектра основных фосфолипидов аннулярного (СФМ) и общего (ФХ) липидных пулов мембран эритроцитов у спортсменов циклических видов спорта.
Материалы и методы. В ходе эксперимента были сформированы опытная группа, состоящая из спортсменов циклических видов спорта с квалификацией от 1-го взрослого разряда до мастера спорта (42 человека, средний возраст -18,6 ± 3 года), и контрольная группа (38 практически здоровых доноров, не занимающихся регулярными физическими упражнениями, средний возраст - 19,2 ± 1,7 года).
Кровь для исследований брали в утренние часы (с 8.00 до 9.00) натощак из локтевой вены в одноразовые вакутейнеры с цитратом натрия.
Мембраны эритроцитов выделяли по методу J. Dodge [8]. Фосфолипиды экстрагировали смесью хлороформа и метанола (2:1) по методу J. Folch [9]. Фосфолипидный профиль определяли методом двухмерной тонкослойной хроматографии на пластинах TLC Silicagel 60, 20x20 см фирмы "Merck" (хроматографическая смесь № 1: 16,25 мл хлороформа, 7 мл метанола, 1,3 мл воды; хроматографическая смесь № 2: 14 мл хлороформа, 6 мл метанола, 1 мл аммиака). Идентификацию фосфолипидных классов проводили по величине Rf стандартных образцов. Количество индивидуальных классов фосфолипидов оценивали по методу V. Vaskovsky [10]. Процентное содержание фосфолипидных классов определяли относительно суммы оптических плотностей всех идентифицированных классов. Содержание общих фосфолипидов устанавливали по A. Svannborg и L. Svennerholm [11], ХС -по A. Zlatkis и В. Zak [12].
Для определения спектра жирных кислот в составе СФМ и ФХ экстрагированные фосфолипиды разделяли методом двухмерной тонкослойной хроматографии. После идентификации ФХ и СФМ соскабливали вместе с си-ликагелем с пластины и экстрагировали смесью хлороформ/метанол (2/1 по объему). Для удаления метанола к экстракту добавляли воду, после чего смесь тщательно перемешивали и для расслоения фракций оставляли на ночь в холодильнике при 4°С. Верхний (метанольный) слой удаляли водоструйным насосом. Нижний (хлороформный) слой высушивали в токе азота. Экстрагированные фосфолипиды метилировали 2 М раствором натрия метоксида в метаноле (ISO 5509:2000) и анали-
Таблица 1
Фосфолипидный профиль мембран эритроцитов у спортсменов и лиц контрольной группы
Группа СФМ, ФХ, ФЭА, ПГФ,
ммоль/мл ммоль/мл ммоль/мл ммоль/мл
Спортсмены 6,8 ± 5,7 29,7 ± 19,2 10,9 ± 18,3 2,1 ± 3,1
Контрольная 6,1 ± 5,3 16,0 ± 22,4 11,6 ± 42,7 1,7 ± 4,2
группа
Р 0,5697 0,0002416 0,02072 0,06153
Примечание. Здесь и в табл. 2: ПГФ - полиглицерофосфат.
2 Ч
0 -
ш ж
Г/////////Л
Спортсмены
Контрольная группа
Рис. 1. Отношение СФМ/ФХ в мембранах эритроцитов у спортсменов и лиц контрольной группы.
2 Н
0 -
штт
Спортсмены
Контрольная группа
Рис. 2. Отношение (СФМ + ФХ)/ФЭА у спортсменов и лиц контрольной группы.
зировали на газовом хроматографе Focus GC с пламенно-ионизационным детектором и капиллярной колонкой BPX70, 60 мм х 0,25 мм производства "Thermo Fisher Scientific". Термостат колонки работал в следующей программе: нагрев от 120 до 245°С при скорости подъема температуры 3°С/мин, изотерма при 245°С - 5 мин (полное время анализа составило 46,66 мин). Температура испарителя - 200°С, детектора - 280°С. Жирные кислоты идентифицировали по времени удержания стандартов метиловых эфиров ("Sigma Aldrich"), количество оценивали по площади пика.
Поскольку распределение исследуемых признаков отличалось от нормального (р < 0,05 по тесту Шапиро-Уилка), использовали непараметрические методы математической статистики (для парного сравнения - W-критерий Вилкок-сона, для определения гомогенности групп - Н-критерий Краскала-Уоллиса). Результаты приводятся в формате M ± SD, где М - среднее значение изучаемой величины, SD - среднеквадратическое отклонение. Обработку полученных
Таблица 2
содержание фосфолипидов в мембранах эритроцитов у спортсменов и лиц контрольной группы
Группа СФМ, % ФХ, % ФЭА, % ПГФ, %
Спортсмены 17,84 ± 15,99 58,79 ± 25,2 18,77 ± 18,48 4,6 ± 5,96
Контрольная 26,93 ± 17,23 46,21 ± 25,1 20,93 ± 19,79 5,94 ± 1,15
группа
Р 0,006783 0,03231 0,6265 0,5680
Таблица 3
содержание Хс и ОФЛ в мембранах эритроцитов у спортсменов и лиц контрольной группы
Группа ХС, мкг/мл ОФЛ, мг/мл ХС/ОФЛ, •10-5
Спортсмены 15,28 ± 6,28 185,69 ± 45,99 9,2 ± 5,7
Контрольная 16,77 ± 12,08 55,52 ± 56,10 77,0 ± 98,0
группа
р 0,8246 < 0,0001 < 0,0001
данных проводили с использованием статистического пакета Я 3.0.0 [13].
Результаты и обсуждение. Было установлено, что мембраны эритроцитов спортсменов имеют статистически значимые отличия от мембран эритроцитов у лиц контрольной группы (табл. 1, 2). У спортсменов содержание ФХ было достоверно выше, а фосфатидилэтаноламинов (ФЭА) ниже (р=0,0002 и р=0,02 соответственно), чем у лиц, не занимающихся спортом. Учитывая, что ФХ повышают устойчивость мембран эритроцитов к гемолизирующим агентам [14], выявленные отличия можно расценить как способствующие улучшению устойчивости эритроцита к деформации при прохождении их в микроциркуляторном русле. Поскольку ФХ обогащены полиненасыщенными жирными кислотами (ПНЖК), во многом определяющими текучесть мембран [6], можно предположить, что они оказывают позитивное действие на этот показатель. Если учесть, что ФЭА локализуются преимущественно на внутренней поверхности мембран эритроцитов и могут переходить на внешнюю поверхность при активации свертывания крови [15], можно допустить, что протромбогенный потенциал эритроцитов спортсменов будет ниже, чем у лиц, не занимающихся спортом.
Таким образом, различия в фосфолипидном спектре свидетельствуют о возможной более высокой устойчивости мембран эритроцитов спортсменов к деформации, их модифицированной функциональной активности за счет большей текучести и, возможно, о сниженном протромбогенном потенциале за счет уменьшения содержания ФЭА.
Оценка отношения количества СФМ к количеству ФХ, отражающего текучесть наружного слоя мембраны эритроцита, показала (рис. 1) его снижение у спортсменов на 52,3% (р = 0,008), что подтверждает предположение о более высокой текучести мембран эритроцитов у спортсменов. Снижение отношения СФМ/ФХ также указывает на увеличение проницаемости мембран эритроцитов для заряженных частиц [6], что косвенно подтверждает предположение об увеличении функциональной активности мембран эритроцитов спортсменов.
Отношение (СФМ + ФХ)/ФЭА может быть использовано для оценки асимметричности бислоя липидов, так как производные СФМ и ФХ преимущественно локализованы на наружной стороне мембраны, в то время как ФЭА - на внутрен-
ней [6]. У спортсменов отношение (СФМ + ФХ)/ФЭА (рис. 2) было значимо выше (р = 0,024), что можно расценить как снижение асимметрии мембраны и ее переход в метастабиль-ное состояние [6], свидетельствующее о напряжении систем адаптации.
Сравнение процентного отношения фосфолипидных классов продемонстрировало (см. табл. 2), что у спортсменов доля ФХ, как в предыдущем случае, была достоверно выше (p = 0,03), а СФМ ниже (p = 0,006), чем у лиц, не занимающихся спортом. Полученные данные также подтверждают сделанные выше выводы о возможном увеличении текучести мембраны за счет роста доли ФХ. Снижение доли СФМ не сопровождалось уменьшением его абсолютного содержания, однако поскольку СФМ преимущественно участвуют в формировании анну-лярного (прибелкового) липидного пула [1б], изменение их доли в мембранных фосфолипидах может свидетельствовать о модификации активности обмена между аннулярным и общим липидным пулами.
Количество ХС у спортсменов и лиц контрольной группы (табл. 3) значимо не различалось (р = 0,8), однако количество общих фосфолипидов (ОФЛ) было достоверно выше в группе спортсменов (р < 0,05), в то время как показатель ХС/ОФЛ снижался (p < 0,05). Эти данные подтверждают предположение об увеличении текучести мембраны у спортсменов.
В спектре жирных кислот СФМ и ФХ (табл. 4) обнаружено снижение процентного содержания С14:0 и С16:0 в обоих фосфолипидных классах и С16:1 в ФХ спортсменов, а также рост С18:3 в СФМ у спортсменов (р < 0,05). Отношение суммы насыщенных жирных кислот к сумме полиненасыщенных (в ФХ) у спортсменов было статистически значимо ниже (р = 0,018), что свидетельствует о снижении микровязкости мембран эритроцитов [6].
Учитывая важную роль СФМ в образовании детергент-устойчивых областей мембраны (прибелковый липидный пул), состоящих из ХС, СФМ и белка, оказывающих непосредственное влияние на функциональную активность трансмембранных белков и каналов [6], можно предположить возможность опосредованного влияния выявленных изменений жирно-кислотного спектра на функциональную активность, в том числе аквапоринов.
Поскольку ФХ являются основными фосфолипидами мембран эритроцитов, обнаруженные изменения, вероятно, отражают глубокие перестройки в жирно-кислотном составе фосфолипидов общего липидного пула, отвечающего за обмен фосфолипидами с липопротеиновыми комплексами крови.
Заключение. Проведенные исследования позволяют утверждать, что регулярные занятия спортом оказывают выраженное влияние на состав мембран эритроцитов, вероятно, вызывая напряжение адаптационных систем, способных увеличивать текучесть мембраны, ее устойчивость к деформации и активность трансмембранных белков.
ЛИТЕРАТУРА
1. Blank М.Е., Ehmke H. Aquaporin-1 and HC03-Cl- transporter-mediated transport of C02 across the human erythrocyte membrane. J. Physiol. 2003; 550(2): 419-29.
2. Wang Y., Tajkhrshid E. Molecular mechanisms of conduction and selectivity in aquaporin water channels. Am. Soc. Nutr. 2007; 137(6): 1509-15.
3. Титовец Э.П. и др. Исследование механизмов кислородного обмена эритроцитов человека. Биофизика. 2009; 10: 425-41.
4. Lee A.G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 2003; 1612: 1-40.
Таблица 4
жирно-кислотный спектр сФМ и ФХ мембран эритроцитов у спортсменов и лиц контрольной группы
Кислота
СФМ
спортсмены
контроль
ФХ
спортсмены
контроль
c14:0
c16:0 c16:1
С18:3
V
^насыщ/
V
"^ненасыш
2,62 ± 1,79 9,52 ± 5,99 5,04 ± 3,50
3,66 ± 2,26 12,82 ± 6,82 5,62 ± 3,38
0,017 0,009 0,243
2,37 ± 1,81 11,8 ± 6,92 4,71 ± 3,95
3,70 ± 2,76 0,002 14,93 ± 7,77 0,040 6,61 ± 5,50 0,002
49,35 ± 25,48 37,25 ± 27,23 0,048 34,33 ± 29,60 35,91 ± 24,23 0,813 0,27 ± 0,18 0,41 ± 0,4 0,107 0,30 ± 0,25 0,58 ± 1,05 0,018
5. Fantini J., Barrantes F.J. Sphingolipid/cholesterol regulation of neurotransmitter receptor conformation and function. Biochim. Biophys. Acta. 2009; 2345-61.
6. Болдырев А.А. и др. Введение в биомембранологию: Учебное пособие МГУ 1990. 208 с.
7. Курилович С.А. и др. Обоснование применения эссенциальных фосфолипидов при хронических заболеваниях печени: динамика электрических и вязкоупругих параметров эритроцитов. Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. 2010; 11: 44-52.
8. Dodge J., Mitchell С., Hanahan D. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin free ghosts of erythrocytes. Arch. Bio-chem. 1963; 100(1): 119-30.
9. Folch J., Lees M., Sloane S.G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957; 226: 497-509.
10. Vaskovsky V.E., Latyshev N.A. Modified Jungnickel reagent for detecting phospholipid and phosphorus compounds on TLC chromato-grams. J. Chromatogr. 1975; 115: 246-9.
11. Svannborg A., Svennerholm L. Plasma total lipid cholesterol, triglycerides, phospholipids and in a healthy scandinavian population. Acta Med. Scand. 1961; 169: 43-6.
12. Zlatkis A., Zak B., Boyle A.J. A new method for determination of cholesterol. J. Lab. Clin. Med. 1953; 41: 486-92.
13. The R Project for Statistical Computing [Electronic resource]. -Mode of access: Available at: http://www.r-project.org. - Date of access: 20.04.2013.
14. Miyazaki Y., Hara-Hotta H., Matsuyama T., Yano I. Hemolysis of phosphatidylcholine-containing erythrocytes by serratamic acid from Serratia marcescens. Int. J. Biochem. 1992; 7: 1033-8.
15. Bevers E.M., Comfurius P., Zwaal R.F. Changes in membrane phos-pholipid distribution during platelet activation. Biochim. Biophys. Acta. 1983; 1: 57-66.
16. Степанян А.Дж. и др. Структурно-метаболический статус мембран эритроцитов при миоме матки. Кровь. 2008; 8: 28-36.
REFERENCES
1. Blank M.E., Ehmke H. Aquaporin-1 and HC03-Cl- transporter-mediated transport of Co2 across the human erythrocyte membrane. J. Physiol. 2003; 550(2): 419-29.
2. Wang Y., Tajkhrshid E. Molecular mechanisms of conduction and
selectivity in aquaporin water channels. Am. Soc. Nutr. 2007; 137(6): 1509-15.
3. Titovec Je.P. et al. Investigation of human erythrocytes oxygen exchange mechanisms. Biofizika. 2009; 10: 425-41 (in Russian).
4. Lee A.G. Lipid-protein interactions in biological membranes: a structural perspective. Biochim. Biophys. Acta. 2003; 1612: 1-40.
5. Fantini J., Barrantes F.J. Sphingolipid/cholesterol regulation of neu-rotransmitter receptor conformation and function. Biochim. Biophys. Acta. 2009; 11: 2345-61.
6. Boldyrev А.А. et al. Introduction to biomembranology: MSU. 1990. 208 p. (in Russian).
7. Kurilovich S.A. et al. Rationale for the use of essential phospholipids in chronic liver diseases: the dynamics ofthe electrical and viscoelastic parameters of erythrocyte. Experimentalnay i clinicheskaya gastroenterologiya. 2010; 11: 44-52 (in Russian).
8. Dodge J., Mitchell C., Hanahan D. The preparation and chemical characteristics of hemoglobin free ghosts of erythrocytes. Arch. Biochem. 1963; 100(1): 119-30.
9. Folch J., Lees M., Sloane S.G. A simple method for the isolation and purification of total lipides from animal tissues. J. Biol. Chem. 1957; 226: 497-509.
10. Vaskovsky V.E., Latyshev N.A. Modified Jungnickel reagent for detecting phospholipid and phosphorus compounds on TLC chromato-grams. J. Chromatogr. 1975; 115: 246-9.
11. Svannborg A., Svennerholm L. Plasma total lipid cholesterol, triglycerides, phospholipids and in a healthy scandinavian population. Acta Med. Scand. 1961; 169: 43-6.
12. Zlatkis A., Zak B., Boyle A.J. A new method for determination of cholesterol. J. Lab. Clin. Med. 1953; 41: 486-92.
13. The R Project for Statistical Computing [Electronic resource]. -Mode of access: Available at: http://www.r-project.org. - Date of access: 20.04.2013.
14. Miyazaki Y., Hara-Hotta H., Matsuyama T., Yano I. Hemolysis of phosphatidylcholine-containing erythrocytes by serratamic acid from Serratia marcescens. Int. J. Biochem. 1992; 7: 1033-8.
15. Bevers E.M., Comfurius P., Zwaal R.F. Changes in membrane phospholipid distribution during platelet activation. Biochim. Biophys. Acta. 1983; 1: 57-66.
16. Fantini J. et al. Lipid rafts: Structure, function and role in HIV, Alzheimer's and prion diseases. Expert Rev. Mol. Med. 2004; 4: 1-22.
Поступила 02.10.13
^\11111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111ШШШШШШШШ1Ш1Ш1//^
= вниманию авторов! =
Ё Начинается подписка на журнал =
| «Клиническая лабораторная диагностика» =
= на II полугодие 2014 г. =
= Индекс журнала для индивидуальных подписчиков - 71442, |
= для предприятий и организаций - 71443 |
| в Каталоге агенства «Роспечать». |
1111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111111
