CC BY
93
печеночно-почечного барьера может приводить к повреждению гепатоцитов печени и снижению выработки кальцидиола, а также паренхимы почек и снижению образования кальцитриола. В результате нарушается кальциевый обмен и это, скорее всего, приводит к снижению уровня кальция в крови наркоманов в 1,4 раза по сравнению с контрольной группой (р < 0,05).
Таким образом, у лиц с героиновой интоксикацией лабораторными критериями могут служить повышение уровня лактата и активности ГГТ в сыворотке крови.
Кроме того, героиновая наркомания сопровождается органопатологическими осложнениями - поражением барьерных функций печени и почек, о которых свидетельствуют снижение уровня кальция, повышение активности аланинаминотрансферазы (АлАТ), увеличение содержания общего билирубина и креатинина в сыворотке крови.
ЛИТЕРАТУРА
1. Асташкина О.Г. и соавт. Материалы VI Всероссийского съезда судебных медиков, посвященного 30-летию Всероссийского общества судебных медиков, "Перспективы развития и совершенствования суд.-мед. науки и практики". Москва-Тюмень, 2005. - С. 31-32.
2. Еремин С.К., Изотов Б.Н., Веселовская Н.В. Анализ наркотических средств. Москва; 1993: 6-8.
3. Кишкун А.А. Руководство по лабораторным методам диагностики. М., ГЭОТАР-Медиа, 2007.
4. Реброва О.Ю. Статистический анализ медицинских данных с помощью пакета программ "Статистика". М., Изд-во Медиа Сфера; 2002.
5. Фланаган Р.Д. и др. Основы аналитической токсикологии. ВОЗ. Женева; 1997.
Поступила 09.04.12
гематология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013
УДК 618.3-06:616.155.194]-07:616.155.1-074
С.С. Осочук, И.Г. Рандаренко, Н.Н. Яроцкая, С.В. Иванова
влияние анемии на состав и физико-химические свойства мембран эритроцитов беременных женщин
Витебский медицинский университет
Исследовали деформируемость эритроцитов, липидно-белковый состав и физико-химические свойства цитоплазмати-ческой мембраны эритроцитов женщин 21-26 лет с нормально протекающей и осложненной анемией беременностью. На сроке беременности 32-34 нед в мембранах эритроцитов женщин с осложненной анемией беременностью увеличено процентное содержание лизофосфатидов и холестерина, а количество общих фосфолипидов и фосфатидилинозитолов снижено. Дисперсионный анализ показал, что степень влияния анемии на содержание общих фосфолипидов составила 11,1%, а на отношение фосфолипидов и холестерина - 23,9%. Изменения состава мембран эритроцитов не повлияли на их физико-химические свойства и деформируемость эритроцитов.
Ключевые слова: анемия, беременность, эритроциты. S.S. Osothcuk, I.G. Randarenko, N.N. Yarotskaya, S.V. Ivanova
THE IMPACT OF ANEMIA ON CONTENT AND PHYSICAL CHEMICAL CHARACTERISTICS OF MEMBRANES OF ERYTHROCYTES IN PREGNANT WOMEN
The article deals with the study of deformability of erythrocytes, lipid protein content and physical chemical characteristics ща cytoplasmic membrane of erythrocytes in women aged 21-26 years with pregnancy taking normal course and complicated with anemia. In women with pregnancy complicated with anemia, by the period of 32-34 weeks in membranes of erythrocytes the percentage of lysophosphatids and cholesterol is decreased while the number of whole phospholipids and phosphatidyl inositols is decreased. The variance analysis demonstrated that the percentage of impact of anemia on the content of whole phospholipids consisted 11.1% and on ratio of phospholipids and cholesterol about 23.9%. The changes in content of membranes of erythrocytes had no impact on their physical chemical characteristics and deformability of erythrocytes.
Key words: anemia, pregnancy, erythrocytes
Одним из главных факторов, приводящих к значительным нарушениям развития плода во время беременности, является гипоксия. В ряду причин, которые могут
Для корреспонденции:
Осочук Сергей Стефанович, д-р мед. наук, доц., зав. ЦНИЛ Адрес: 210023, Витебск, пр. Фрунзе, 27 Телефон: +375(212) 36-59-38 E-mail: [email protected]
привести к хронической гипоксии плода, можно назвать анемию беременных. В современной литературе описаны последствия гипоксии плода, вызванные анемией беременных, связанные с недостаточным уровнем гемоглобина и снижением содержания эритроцитов [14]. Известно, что эритроцитарные мембраны оказывают существенное влияние на способность эритроцита к деформации и проникновению в микроциркуляторное русло [16]. Помимо этого, липидное микроокружение белков
ГЕМАТОЛОГИЯ
мембран эритроцитов способно повлиять на перенос кислорода через мембрану [11]. Все известные факты говорят о высоком значении мембран в транспорте кислорода в ткани. Однако, несмотря на всю очевидность и актуальность проблемы, ее исследования не получили достаточного отражения в литературных источниках.
В связи с вышеизложенным целью нашего исследования было сравнение физико-химических свойств мембран эритроцитов беременных женщин с нормально протекающей беременностью и с беременностью, протекающей на фоне анемии.
Материал и методы. Для достижения поставленной цели обследована 51 беременная женщина в возрасте от 21 года до 26 лет, относящемся согласно рекомендациям международного симпозиума по возрастной медицине к первому периоду зрелого возраста [2].
Срок беременности 32-34 нед. В основную группу отобраны 29 беременных женщин с анемией по следующим критериям: отставание роста плода по данным фе-тометрии на 2 нед и более; снижение фетоплацентарного кровотока при допплерометрии; снижение биофизического профиля плода до 7 баллов; выявление признаков страдания плода при кардиомониторном наблюдении StV 3,5-4 м/с и более 20 м/с.
Контрольную группу составили 22 женщины с нормально протекающей беременностью. Кровь забирали из локтевой вены натощак в утренние часы. Эритроциты отмывали забуференным физиологическим раствором и исследовали индекс деформируемости (ИД) согласно методическим рекомендациям, утвержденным Минздравом Республики Беларусь [9]. Выделение мем-
Таблица 1
Липидно-белковый состав мембран эритроцитов
Показатель Анемия Норма
ИД ед. 65,8 ± 5,7 66,7 ± 4,5
ЛФ % 15,1 ± 4,8 9,4 ± 3,25
p 0,0016
СФМ % 16,2 ± 4,6 14,6 ± 6,7
ФИ % 7,6 ± 3,8 11,0 ± 5,7
p 0,03
ФХ % 29,2 ± 3,5 32,4 ± 8,4
ФЭА % 34,1 ± 7,5 36,2 ± 7,1
ХС мг/мл 0,056 ± 0,01 0,03 ± 0,008
p 0,0001
ОФЛ мМ/л 0,13 ± 0,03 0,2 ± 0,04
p 0,0001
Белок г/л 0,11 ± 0,03 0,117 ± 0,04
ОФЛ/ХС 2,36 ± 0,75 6,69 ± 2,8
p 0,0001
ХС/БЕЛ 0,59 ± 0,44 0,29 ± 0,13
p 0,0001
ОФЛ/БЕЛ 1,4 ± 0,75 1,8 ± 0,67
p 0,0014
Примечание. р - по сравнению с нормой.
ИД - индекс деформируемости эритроцитов; ЛФ - лизофосфа-тиды; СФМ - сфингомиелины; ФИ - фосфатидилинозитолы; ФХ - фосфатидилхолины; ФЭА - фосфатидилэтаноламины; ХС - холе-стерол; ОФЛ - общие фосфолипиды, БЕЛ - белок.
бран эритроцитов проводили по методам [1, 15]. Для исследования физико-химических свойств мембран эритроцитов концентрацию белка в эритроцитарных тенях определяли по Лоури и фосфатным буфером (pH 7,4) доводили до концентрации 0,1 мг/мл. Рабочие концентрации пирена в растворе мембран составили 1-10 мкМ. Спектры флюоресценции регистрировали с помощью спектрофлюориметра СМ2203 (Solar, Беларусь) с использованием кварцевой кюветы размером 1,2*1,2 см в диапазоне 300-500 нм [7]. Коэффициент эксимеризации пирена (N) рассчитывали для двух длин волн возбуждения (286 и 337 нм).
Экстракцию фосфолипидов (ФЛ) эритроцитар-ных мембран осуществляли последовательно смесью хлороформ-метанол (1:2 по объему) и смесью хлороформ-метанол-вода (1:2:0,8 по объему) согласно методике М. Кейтс [8]. Суммарную концентрацию ФЛ эритроцитарных мембран измеряли после минерализации экстракта в реакции с молибдатом аммония и аскорбиновой кислотой [18] по стандарту неорганического фосфата. Индивидуальные ФЛ разделяли методом тонкослойной хроматографии [8]. Идентификацию ФЛ-классов проводили по стандартам после окрашивания в йодной камере. Содержание ФЛ-классов определяли по неорганическому фосфату в реакции с реактивом Вась-ковского [19] и выражали в процентах от общего количества. Количество холестерина (ХС) определяли по стандартам ХС в реакции Златкиса-Зака [10].
Статистическую обработку проводили с использованием пакета прикладных программ STATISTIKA 6,0 после оценки распределения признака и равенства дисперсий. В связи с неправильностью распределения признака и неравенством дисперсий в сравниваемых группах были использованы методы непараметрического анализа.
Результаты и обсуждение. Исследование ФЛ-спектра показало, что у беременных с анемией процентное содержание лизофосфатидов (ЛФ) было более высоким (p = 0,0016, табл. 1), а содержание ФИ более низким (p = 0,03), чем в группе сравнения. Увеличение содержания ЛФ может обусловливаться более высокой активностью секреторной фосфолипазы А2 и может быть расценено как негативный фактор, поскольку ЛФ обладают выраженной детергентной активностью и способны значительно дестабилизировать билипидный слой мембран. Вероятно, возможное повышение активности секреторной фосфолипазы А2 явилось также причиной достоверного (p < 0,0001) снижения содержания ОФЛ. Поскольку эритроцит является безъядерной клеткой, неспособной самостоятельно обновлять структуру своей мембраны, увеличение содержания ЛФ и снижение уровня ОФЛ может обусловливаться в том числе и возможными изменениями в структуре липидтран-спортной системы, обеспечивающей обновление липид-ных компонентов мембран эритроцитов. Исследование содержания ХС выявило его достоверное увеличение в основной группе (p<0,0001). Известно, что ХС способен легко встраиваться в зоны дефектов билипидного слоя мембран [3]. Учитывая такую способность, выявленное увеличение содержания ХС можно расценивать как компенсацию повышения уровня ЛФ. Изменение содержания ХС и ОФЛ повлекло за собой и изменения их соотношений, а также их удельного (в пересчете на белок) содержания (p < 0,001). Снижение содержания ФИ может быть следствием перестройки сигнальных компонентов мембраны эритроцита, поскольку ФИ участвует в фосфатидилинозитольном пути переноса гормонального сигнала через мембрану для непроникающих в
Таблица 2
результаты дисперсионного анализа влияния анемии на липид-ный спектр мембран эритроцитов
Группа обследованных Дисперсия Число степеней свободы Ошибка средней Критерий Фишера Р
Содержание ОФЛ
Анемия 0,180255 1 0,180255 6,230059 0,015903
Ошибка 1,446659 50 0,028933
Отношение ОФЛ/ХС
Анемия 396,484 1 396,4840 15,68121 0,000238
Ошибка 1264,201 50 25,2840
Таблица 3
параметры физического состояния липидной фазы мембран эритроцитов при анемии и в контрольной группе
Группа ^ с = 6 мкмоль Nзз7, с = 6 мкмоль 9
Контроль 0,72 0,82 0,9 2,36
0,28-2,13 0,41-1,17 1,39-4,48
Анемия 0,85 0,86 0,95 2,59
0,3-4,19 0,49-1,28 1,73-5,73
Примечание. Коэффициент эксимеризации ^ , от-
носительное содержание доноров энергии Р2/Р0 и глубина погружения белков в мембрану (9), Ме (10-90%).
клетку гормонов. Помимо этого, снижение содержания ФИ может отражать увеличение склонности эритроцита к лизису, поскольку и гликозилфосфатидилинозитол является якорем для прикрепления белка, защищающего эритроцит от гемолитических атак [17].
Для выявления степени влияния анемии на исследуемые показатели был проведен дисперсионный анализ (табл. 2). В ходе анализа выявлено достоверное влияние анемии на содержание ОФЛ и отношение ОФЛ/ХС (р = 0,015 и 0,0002 соответственно). Степень влияния анемии на содержание ОФЛ составила 11,1%, а на отношение ОФЛ/ХС - 23,9%.
Необходимо отметить, что выявленные изменения не привели к ухудшению способности эритроцитов к деформации, что может свидетельствовать о сохранении способности эритроцитов проникать в микроциркуля-торное русло.
Таким образом, проведенные исследования свидетельствуют о значительных сдвигах в липидном спектре мембран эритроцитов, вероятно, носящих в том числе и адаптационный характер и не влияющих на способность эритроцитов к деформации. Вероятно, выявленные изменения могут быть как следствием повреждающей активности фосфолипазы А2, так и адаптационным механизмом, обеспечивающим оптимизацию переноса кислорода от эритроцитов к тканям в условиях анемии. Для более точного ответа на вопрос о функциональной направленности выявленных изменений необходимо оценить активность переноса кислорода через эритроцитарные мембраны.
Исследование физико-химических свойств мембран эритроцитов с использованием флюоресцентного зонда пирена показало, что во всех исследуемых группах для пирена, расположенного в области аннулярных (прибелковых) липидов, зависимость коэффициента эксимеризации пирена от концентрации зонда (пирена) в плазматических мембранах эритроцитов была линейной (см. рисунок, а), что свидетельствовало о достаточной однородности аннулярного липидного фонда.
Для суммарно возбуждаемого пирена зависимость носила нелинейный характер и отражала гетерогенность физических свойств общего билипидного слоя [6, 12, 13]. Достоверных различий между группами (анемия -контроль) не наблюдалось ни для аннулярного липида, ни для общего липидного бислоя, что свидетельствует об одинаковой структурной упорядоченности липидных фондов и, следовательно, о микровязкости мембран эритроцитов, как в контроле, так и при анемии.
При встраивании пирена в билипидный мембранный слой наблюдается индуктивно-резонансный перенос энергии с мембранных триптофанилов на пирен, сопровождающийся тушением флюоресценции остатков триптофана и увеличением интенсивности флюоресценции пирена [45, 12], что позволяет исследовать микровязкость липидного бислоя и определить взаимное расположение белков и липидов относительно друг друга. В белково-липидных системах доноры энергии (остатки триптофана) находятся на разном расстоянии от акцептора (пирена), распределенного в липидном слое, и условно делятся на две группы [5]:
1) белки, расположенные близко к липидам, принимающие участие в переносе энергии и доступные тушению пиреном;
2) более удаленные части белковых молекул или не связанные с мембранами белки, практически не подвергающиеся тушению.
Расчет относительного содержания доноров энергии 1-й группы Р/Б0 и среднего расстояния между поверхностью бислоя и донорами 2-й группы в мембранах эритроцитов здоровых доноров и при анемии 9 отражен в табл. 3 (Р0 - интенсивность флюоресценции донора энергии в отсутствие тушителя).
Анализ параметров физического состояния мембран не выявил достоверных различий между сравниваемыми группами, что, вероятно, говорит об отсутствии структурно-физических изменений в мембранах эритроцитов при анемии по сравнению с контролем. Отсутствие достоверных различий, возможно, обусловлено взаимным компенсаторным влиянием перестроек в липидном
Зависимость степени эксимеризации пирена (П) от концентрации зонда в мембранах эритроцитов. а - возбуждение при 286 нм, б - при 337 нм. 1 - контрольная группа, 2 - анемия.
ЦИТОЛОГИЯ
бислое либо значительной дисперсией экспериментальных показателей и малым объемом выборки, либо другими причинами, требующими дополнительного изучения.
Выводы. 1. Анемия беременных вызывает увеличение процентного содержания лизофосфатидов, снижает содержание фосфатидилинозитолов и, возможно, компенсаторно увеличивает содержание холестерина и фос-фатидилинозитолов.
2. Степень влияния анемии на снижение содержания общих фосфолипидов составляет 11,1%, а на отношение ОФЛ/ХС - 23,9%.
3. Выявленные изменения не приводят к достоверным изменениям физико-химических свойств мембран и деформируемости эритроцитов, что может свидетельствовать о сбалансированности этих изменений.
ЛИТЕРАТУРА
1. Акоев В.Р., Бобровский Р.В., Жадан Г.Г. и др. Биологические мем-
браны. 1991; 8(1): 78-84.
2. БунакВ.В. Сов. педагогика. 1965; 11: 105-19.
3. Введение в биомембранологию. Учебное пособие. Под ред. А.А.
Болдырева. М.: Изд-во МГУ, 1990.
4. Добрецов Г.Е., Спирин М.М., КарманскийИ.М. Биохимия. 1980;
45(4): 622-8.
5. Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды в исследовании клеток,
мембран и липопротеинов. М.: Наука, 1989.
6. Егуткин Г.Г., Житкович А.В. Биологические науки. 1990; 8: 30-7.
7. Иванова С.В. Вестник ВГМУ 2008; 7(3): 17-23.
8. Кейтс М. Техника липидологии. М.: Мир, 1975; 76; 138-40; 310-1.
9. Козловский В.И., Атрощенко Е.С., Петухов И.В. Фильтрационные методы исследования деформируемости эритроцитов: Метод. рекомендации. Витебск, 1996.
10. КолбВ.Г., КамышниковВ.С. Справочник по клинической химии. Минск: "Беларусь", 1982.
11. Локтюшкин А.В. Особенности транспорта кислорода через мембрану эритроцитов: Автореф. дис. канд. биол. наук. М., 2009.
12. Окунь И.М., Калер Г.В., Волковец Т.М. и др. Биохимия. 1986; 51(7): 1132-40.
13. Самойленко Г.Г., Калер Г.В., Конев С.В. Биофизика. 1999; 44(3): 455-60.
14. Anju Grewal. J. Anaesth. 2010; 54(5): 380-6.
15. Dodje J.T., Mitchell C., Hanahah D.J. et al. Arch. Biochem. 1963; 100(1): 119-30.
16. Oliveira S., Saldanha C. Clin. Hemorheol. Microcirc. 2010; 44(1): 63-74.
17. Simpson R.J., Florida-James G.D., Whyte G.P. et al. Eur. J. Appl. Physiol. 2007; 99(2): 201-4.
18. SvanborgA., Svennercholm L. Acta Med. Scand. 1961; 169: 43-6.
19. Vaskovsky V.E., KostetskyE.J., Vassenolin J.M. J. Chromatogr. 1975; 114: 129-41.
Поступила 20.10.11
цитология
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 616-076.5:008
Н.Н. Волченко, Е.Н. Славнова, А.А. Тугулукова
применение различных вариантов жидкостных технологий в цитологии
ФГБУ московский научно-исследовательский онкологический институт им. п.А. Герцена министерства здравоохранения РФ, москва
Проведено сравнительное исследование традиционных мазков и трех различных жидкостных технологий приготовления цитологических препаратов (CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath) на материале, полученном от 112 больных с патологическими процессами различных локализаций - выпотные жидкости (31), мягких тканей (22), лимфатических узлов (18), молочных желез (20), слюнных желез (7), легких (9), щитовидной железы (5). Установлено, что при совместном применении жидкостной и традиционной цитологии эффективность цитологического исследования повышается на 3,3-5% (в зависимости от локализации патологического очага). Использование жидкостных технологий расширяет возможности применения иммуноцитохимии и молекулярной генетики на цитологическом материале.
Ключевые слова: жидкостная цитология, E-Prep, Cytospin3, BD TriPath, иммуноцитохимическое исследование
N.N. Voltchenko, Ye.N. Slavnova, A.A. Tugulukova
THE APPLICATION OF DIFFERENT TYPES OF LIQUID TECHNOLOGIES IN CYTOLOGY The P.A. Herzen Moscow research oncologic institute of Minzdrav of Russia, Moscow, Russia
The article discusses the results of comparative study of traditional smears and three different liquid technologies of making ready of cytological preparations (CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath) using material from 112 patients with pathological processes of such different localizations as exudative liquids (31), soft tissues (22), lymphatic nodes (18), mammal glands (20), saliva glands (7), lungs (9), thyroid gland (5). It is established that under joint application of liquid and traditional cytology the effectiveness of cytological analysis increases up to 3.3%-5% depending on localization of pathologic nidus. The implementation of liquid technologies expands the possibilities of applying immunocitochemistry and molecular genetics to cytological materials.
Key words: liquid cytology, CytoSpin3, E-Prep Processor, BD TriPath, immunocitochemical assay
