CC BY
18
УДК 616.36-006-092.9:615.322:599.324.4 Е.В. Бочаров1,2, Р.В. Карпова1, А.А. Вершинская1, В.Г. Кучеряну2, О.А. Бочарова1 ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯ ГЕПАТОКАРЦИНОМ МЫШЕЙ ВЫСОКОРАКОВОЙ ЛИНИИ СВА ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ МУЛЬТИФИТОАДАПТОГЕНА В РАННЕМ ПОСТНАТАЛЬНОМ ОНТОГЕНЕЗЕ 1ФГБНУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина», Москва 2ФГБНУ «НИИ общей патологии и патофизиологии», Москва
Контактная информация
Бочарова Ольга Алексеевна, д.б.н., проф., зав. лабораторией иммунофармакологии НИИ ЭДиТО адрес: 115478 Москва, Каширское ш., 24; тел. +7(499) 324-55-26 e-mail: imufarm@rambler.ru
Статья поступила 16.04.2015, принята к печати 27.04.2015.
Резюме
В статье представлены результаты морфологического исследования ткани печени мышей высокораковой линии СВА на разных этапах онтогенеза при воздействии мультифитоадаптогена в течение 1 месяца жизни. Выявлены умеренно- и низкодифференцированные трабекулярные и трабекулярно-ацинарные гепатокрциномы. У мышей опытной группы в возрасте 22 мес определена лимфоцитарная инфильтрация гепатокарцином, а также деструкция опухолевых узлов. У мышей контрольной группы инфильтрации и деструкции гепатокарцином не наблюдали.
Ключевые слова: высокораковая линия мышей СВА, трабекулярные и трабекулярно-ацинарные гепато-карциномы, опухоль-инфильтрирующие лимфоциты, фитоадаптогены.
E.V. Bocharov1;2, R.V. Karpova1, АА. Vershinskaya1, V.G. Kucheryanu2, O.A. Bocharova1
LYMPHOCYTE INFILTRATION
IN HIGH-CANCER CBA MICE HEPATOCARCINOMAS
USING MULTIPHYTOADAPTOGENE EARLY POSTNATAL ONTOGENESIS ADMINISTRATION
1FSBSI «N.N. Blokhin Russib Cancer Research Center», Moscow
2FSBSI «The institute of general pathology and pathophysiology», Moscow
Abstract
The article presents the results of high-cancer CBA inbred mice liver morphological research while using mul-tiphytoadaptogene early postnatal ontogenesis administration. Moderate and pooly differentiated trabecular and trabecu-lar-acinar hepatocarcinomas were determined. Lymphocytes infiltration and destructive features were microscopically visible in hepatocarcinomas at the age of 22 months. Infiltrated lymphocytes and destructive features in control mouse hepatocarcinomas were not detected.
Key words: high-cancer CBA inbred mice, tral trated lymphocytes, phytoadaptogenes.
Введение
В предыдущих исследованиях на модели спонтанного гепатоканцерогенеза у мышей-самцов высокораковой линии СВА было выявлено снижение в онтогенезе экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов LFA-1 (œ11a/CD18) и Mac-1 (OTnb/CD18), обеспечивающих контактные взаимодействия эффекторов иммунитета и опухолевых клеток. Вместе с тем определено возрастание сывороточного уровня интерлейкинов -6 и -10 [11; 12].
Применение МФА фитомикса-40 у высокораковых мышей СВА в раннем постнатальном онтогенезе в течение первого месяца жизни, захватывая завершающий период дифференцировки нор-
and trabecular-acinar hepatocarcinomas, tumours infil-
мальной ткани печени, способствовало усилению экспрессии молекул LFA-1 и Mac-1, подавлению сывороточных уровней ИЛ-6 и ИЛ-10, снижению уровня наследственного опухолеобразования, количества и размеров гепатокарцином по сравнению с контрольными животными. Применение МФА, начиная с 6 мес постнатального развития (периода возникновения первых гепатом) и до естественной гибели животного, также приводило к коррекции показателей лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, ИЛ -6 и -10, снижению частоты возникновения и размеров гепатокарцином, не влияя на их количество у одного животного [11; 12; 13].
Целью настоящей работы явились морфологические исследования печени высокораковых
мышей-самцов линии СВА, генетически предрасположенных к развитию спонтанных гепатом, при введении МФА в течение первого месяца постна-тального развития.
В задачи работы входила оценка морфологических изменений в ткани печени мышей линии СВА на разных этапах онтогенеза при воздействии МФА.
Материалы и методы
Работу проводили на мышах-самцах высокораковой инбредной линии СВА (сублиния СВА/Lac Y; [3; 4; 19]). Первые спонтанные гепатомы у мышей-самцов возникают в период, близкий к 6-месячному возрасту, и встречаются в 7 раз чаще, чем у самок. В возрасте 18-22 мес в 100% случаев у самцов выявляют гепатокарциномы [17; 27].
Мыши контрольной группы (n=90) получали в качестве питья воду. Мышам опытной группы (n=80) 10 %-ный раствор МФА добавляли в воду, которую получали самки, начиная с момента рождения и до отъема детенышей в возрасте 1 мес по-стнатального развития. Всего в работе использовано 170 мышей.
Часть животных (13-30 мышей из каждой группы) забивали (с использованием эфирного наркоза) в возрасте 4; 8; 22 мес. Печень контрольных и опытных животных, помимо макроскопического исследования, подвергали гистологической обработке по стандартной методике и окрашиванию гематоксилином и эозином.
МФА представляет собой препарат на основе компонентов экстрактов сорока растений, включенных в Госфармакопею РФ [5; 6], в том числе -известных адаптогенов женьшеня (Panax L.), ро-диолы розовой (Rhodiola rosea L.), элеутерококка (Eleutherococcus M.), лимонника (Schisandra coccinea), заманихи (Oplopanax elatus) и аралии (Aralia racemosa L.).
Разработаны способы биологической и химической стандартизации [7; 20; 21; 22]. В предыдущих исследованиях выявлены антиоксидантное, антимутагенное, противоопуховолевое, радиопротекторное, нейропротекторное, иммуномодули-рующее, в том числе - противовоспалительное и интерфероногенное, действия МФА [2; 8-10; 1416; 18].
Результаты и обсуждение
В возрасте 4 мес. у мышей контрольной и опытной групп опухоли обнаружены не были.
На рис. 1 в качестве примера представлен срез ткани печени самца контрольной группы в возрасте 4 мес. Обычные гепатоциты с нормальными ядрами и цитоплазмой образуют печёночные балки, характерные для нормальной ткани органа. Виден также срез сосуда с эритроцитами внутри просвета. Микроскопическое строение ткани печени опытных животных в этом же возрасте было аналогичным.
На рис. 2 показан срез ткани печени животного контрольной группы в возрасте 8 мес, который также демонстрирует нормальное строение: рисунок печеночных балок, просвет кровеносного сосуда, наличие желчных капилляров.
Между тем известно, что у высокораковых самцов линии СВА первые опухоли в печени возникают в период, близкий к шестимесячному возрасту [17]. В нашем эксперименте в контрольной группе мышей в возрасте 8 мес макроскопически и микроскопически мы наблюдали опухоли у 10 % исследованных животных.
На рис. 3 продемонстрирован гистологический препарат с гепатокарциномой контрольного животного в возрасте 8 мес. Вокруг просвета кровеносного сосуда видны полиморфные опухолевые клетки, образующие тяжи (трабекулы), практически лишь отдалённо похожие на структуры печеночных балок. В данном случае опухоль можно оценить как трабекулярную гепатокарциному умеренной дифференцировки. У животных опытной группы, принимавших МФА, мы не наблюдали признаков опухолевого процесса в этом возрасте.
В позднем онтогенезе (в возрасте 22 мес) у всех мышей контрольной группы были выявлены гепатокарциномы. На рис. 4 представлен гистологический препарат спонтанной гепатокарциномы самца линии СВА контрольной группы. В данном случае на препарате видны полиморфные опухолевые клетки с гиперхромными ядрами, расположенные в виде трабекул и характерных атипичных полостей (ацинусов). Увеличено соотношение «ядро-цитоплазма». В синусоидах между трабекулами и просветах ацинусов отмечаются эритроциты, му-цинозное вещество или желчный пигмент. По своему строению наблюдаемая ткань далека от нормального морфологического строения печени. В данном случае наблюдается низкодифференциро-ванная трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома, т.е. опухоль смешанного строения.
У мышей опытной группы, получавших МФА в течение первого месяца постнатального онтогенеза, гепатокарциномы были выявлены в 69,2 % случаев. В качестве примера на рис. 5 представлен гистологический препарат опухоли в этом возрасте (в данном случае, судя по однородным крупным клеточным ядрам, гепатокарцинома инфильтрирована массой активированных лимфоцитов; в соседних участках и по периферии опухоли также видны отдельные лимфоциты и их группы; наблюдаются также деструктивные элементы клеток опухоли).
У животных контрольной группы лимфоци-тарной инфильтрации в опухолях не наблюдали. При этом были выявлены сниженная экспрессия лейкоцитарных интегринов, высокая частота возникновения опухолей, существенное их количество и размеры.
Следует отметить, что миграция и накопление активированных лимфоцитов в опухолевом очаге служит положительным прогностическим признаком опухолевого процесса [9].
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЛИМФОЦИТАРНАЯ ИНФИЛЬТРАЦИЯГЕПАТОКАРЦИНОМ..
Рис. 1. Самец линии СВА 4 мес., контрольная группа; ткань печени, окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400.
° V \ > Ш&Ш: О Ш ШЛ . ^ ^
? V ' " ,• .»дек
о * ' ' -
V,' - * ■ *
■ ^ и ■ г. .лЬ г»
& ш ъшу
> п. Ек . А»».«. ■■■■ . , ■ - *
-
; -
О т
с*
у а-
0 ШаВ
• * ■Ч'Цг
ая-
Рис. 2. Самец линии СВА 8 мес., контрольная группа; ткань печени, окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400.
Рис. 3. Самец линии СВА 4 мес., ткань печени, трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференци-ровки, окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400.
Рис. 4. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки. Самец линии мышей СВА контрольной группы 22 мес; окраска гематоксилином и эозином, увеличение х 400.
Рис. 5. Трабекулярно-ацинарная гепатокарцинома низкой дифференцировки. Самец линии мышей СВА в возрасте 22 мес, получавший фитомикс-40 в течение 1-го месяца жизни;окраска гематоксилином и эозином, увеличение ><400.
Клеточные эффекторы иммунитета (активированные лимфоциты, нейтрофилы, МК-клетки) контактируют с клетками-мишенями, что может выступать критическим фактором, который приводит в конечном итоге к гибели опухолевых клеток [1; 23; 24; 26]. Такой контакт может быть обусловлен усилением на эффекторах иммунитета экспрессии молекул адгезии, в том числе лейкоцитарных интегринов ЬБЛ-1 и Мас-1. Экспрессия последних может быть индуцирована их лигандами (например, 1СЛМ-1, -2) на клетках-мишенях с помощью регуляторных реакций при участии цитокинов (ИЛ-6, -10, 12, ИФН-у, ФНО и др.; [25]). Морфологическая картина опухолевых очагов в результате воздействия МФА в раннем онтогенезе в течение первого месяца постнатального развития сочеталась с долговременным повышением экспрессии лейкоцитарных интегринов ЬЕА-1 и Мас-1 на клетках крови, снижением сывороточного содержания ИЛ-6 и ИЛ-10, частоты опухолеобразования, а также уменьшением размеров опухолей у мышей опытной группы.
Заключение
Введение нетоксичного, неканцерогенного препарата мультифитоадаптогена с адгезиогенным действием высокораковым мышам в течение первого месяца постнатального развития, захватывая завершающий период дифференцировки нормальной ткани печени, приводит к долговременному усилению экспрессии молекул гетеротипической адгезии лейкоцитарных интегринов ЬБЛ-1 (СБ11а/СБ18) и Мас-1 (СВ11Ъ/СБ18), обеспечивающих контактные взаимодействия иммунных эффекторов и клеток-мишеней в опухолевых узлах.
Инфильтрация спонтанных гепатокарци-ном активированными лимфоцитами может способствовать повышению активности противоопухолевых реакций иммунитета и деструкции опухолевой ткани. В результате снижена частота возникновения, количества и размеров наследственных опухолей.
Литература
1. Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г. и др. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник московского онкологического общества. - 2008. - № 1. - С. 6-10.
2. Бочаров Е.В., Карпова Р.В., Казеев И.В. и др. Исследование радиозащитной активности мультифи-тоадаптогена в эксперименте на мышах // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2013. - № 3. - С. 55-8.
3. Бочарова О.А., Модянова Е.А., Ушаков В.Ф. Механические свойства межклеточных контактов гепа-тоцитов у мышей инбредных линий и предрасположенность к спонтанным гепатомам // Бюлл. экс-пер. биол и мед. - 1980. - Т. 89, № 4. - С. 459-62.
4. Бочарова О.А., Модянова Е.А. Изменение межклеточных контактов гепатоцитов в онкогенезе у мышей инбредных линий с высокой (СВА) и низкой (С57В1) частотой спонтанных гепатом // Онтогенез. - 1982. - Т. 13, № 4. - С. 427-9.
5. Бочарова О.А. Патент РФ № 2099410. Композиция ингредиентов для бальзама Алексеевой (Фито-микс-40). 1998. - Бюлл. № 35.
6. Бочарова О.А., Лыженкова М.А., Мезенцева М.В. и др. Фитоадаптоген для профилактической онкологии: иммунобиологические критерии состава. // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2003. - Т. 136, № 12. -С. 670-3.
7. Бочарова О.А., Лыженкова М.А., Куренная О.Н., Княжев В.А. Способ биологического контроля комплексного фитоадаптогена // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2003. - Т. 136, № 12. - С. 694-9.
8. Бочарова О.А., Барышников А.Ю. Фитоадаптогены в онкологии. - М.: ЗооМедВет, 2004. - 138 с.
9. Бочарова О.А., Давыдов М.И., Клименков А.А. и др. Перспективы применения фитоадаптогена в лечении распространенного рака желудка // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2009. - Т. 148, № 7. - С. 96-9.
10. Бочарова О.А., Давыдов М.И., Барышников А.Ю. и др. Комплексные фитоадаптогены в онкологии и геронтологии // Вестник РАМН. - 2009. - № 8. - С. 21-5.
11. Бочарова О.А., Карпова Р.В., Ильенко В.А. и др. Лейкоцитарные интегрины при гепатоканцерогенезе мышей высокораковой линии СВА // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 3. -С. 53-6.
12. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В. и др. LFA-1, Mac-1 интегрины и IL-6, -10 цитокины у высокораковых мышей под воздействием фитоадаптогена // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2014. - Т. 157, № 2. - С. 223-6.
13. Бочарова О.А., Бочаров Е.В., Карпова Р.В. и др. Снижение возникновения гепатом при воздействии фитоадаптогена у высокораковых мышей СВА // Российский биотерапевтический журнал. - 2014. -Т. 13, № 2. - С. 73-6.
14. Бочков Н.П., Бочарова О.А., Аксенов А.А. и др. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы // Медицинская генетика. - 2005. -Т. 4, № 1. - С. 15-9.
15. Карпова Р.В., Бочаров Е.В., Казеев И.В. и др. Радиозащитная эффективность мультифитоадаптогена в опытах на собаках // Патологическая физиология и экспериментальная терапия. - 2013. - № 4. - С. 51-4.
16. Куренная О.Н., Карпова Р.В., Бочарова О.А. и др. Антимутагенез мультифитоадаптогена в клетках дрожжей-сахаромицетов // Генетика. - 2013. - Т. 49, № 12. - С. 1364-9.
17. Медведев Н.Н. Линейные мыши. - Л.: Медицина, 1964. - 230 с.
18. Пожарицкая М.М., Бочарова О.А., Чекалина Т.Л., Воронин В.Ф. Современные аспекты патогенеза и лечения лейкоплакии слизистой оболочки полости рта. Методическое руководство для врачей. - М.: ГОУ ВУНМЦ, 2004. - 46 с.
19. Фактор В.М., Шипова Л.Я. и др. Уровень клеточной ДНК в спонтанных гепатомах мышей линии СВА. Cell DNA of CBA mouse strain spontaneous hepatomas // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 1984. - Т. 97, №6. - С. 710-3.
20. Шейченко В.И., Бочарова О.А., Шейченко О.П. и др. Аналитические возможности метода ЯМР для определения компонентов препарата Фитомикс- 40 // Заводская лаборатория. Диагностика материалов. - 2006. - Т. 72, № 8. - С. 15-23.
21. Шейченко О. П., Бочарова О. А., Шейченко В. И. и др. Возможности использования электронных спектров поглощения для стандартизации многокомпонентного препарата «Фитомикс-40» // Вопросы биологической медицинской и фармацевтической химии. - 2007. - № 2. - С. 20-5.
22. Шейченко О.П., Бочарова О.А., Крапивкин Б.А. и др. Исследование комплексного фитоадаптогена методом ВЭЖХ // Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2012. - № 10. - С. 52-9.
23. Chiou S.H., Sheu B.C., Chang W.C. et al. Current concepts of tumor-infiltrating lymphocytes in human malignancies // Reprod Immunol. - 2005. - 67(1-2). - P. 35-50.
24. Lu P., Zhu X.Q., Xu Z.L. et al. Increased infiltration of activated tumor-infiltrating lymphocytes after high intensity focused ultrasound ablation of human breast cancer // Surgery. - 2009. - 145(3). - P. 286-93.
25. Oble D., Loewe R., Yu P., Mihm M. Focus on TILs: Prognostic significance of tumor infiltrating lymphocytes in human melanoma // Cancer Immun. - 2009. - 9(3). - P. 245-51.
26. Sasada T., Suekane S. Variation of tumor-infiltrating lymphocytes in human cancers: controversy on clinical significance // Immunotherapy. - 2011. - 3(10). - P. 1235-51.
27. Sharp J., Riches A., Littlewood V., Thomas D. The incidence, pathology and transplantation of hepatomas in CBA mice // J Pathol. - 1976. - 119(4). - P. 211-20.
