CC BY
42
ф
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СНИЖЕНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ГЕПАТОМ... 1 73
УДК 616.36-006.6-092.9:615.322
O.A. Бочарова, Е.В. Бочаров, Р.В. Карпова, A.A. Вершинская, Ю.Н. Соловьев СНИЖЕНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ГЕПАТОМ
ПРИ ВОЗДЕЙСТВИИ ФИТОАДАПТОГЕНА У ВЫСОКОРАКОВЫХ МЫШЕЙ СБА
ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина», Москва.
Контактная информация
Бочарова Ольга Алексеевна, д.б.н., проф., заведующая лабораторией иммунофармакологии НИИЭДиТО адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-55-26 e-mail: imufarm@rambler.ru
Статья поступила 24.02.2014, принята к печати 04.04.2014.
Резюме
Целью работы было изучение профилактического и лечебного воздействия комплексного КФ на частоту возникновения и величину спонтанных гепатокарцином у мышей высокораковой линии СБА. КФ содержит компоненты экстрактов в том числе женьшеня, родиолы, элеутерококка, лимонника и аралии. Введение КФ профилактически в течение первого месяца постнатального развития, включая критический период дифферен-цировки ткани печени, замедляло развитие спонтанных гепатом у самцов линии СБА, снижая частоту их возникновения, объем опухолевой массы и число опухолей у одного животного. Долговременное лечебное воздействие КФ, начиная с 6-месячного возраста мышей-самцов СБА (периода возникновения первых гепатом) и до естественной гибели животного, также подавляло частоту возникновения спонтанных гепатокарцином, уменьшая объем опухолевой массы, но не изменяя числа опухолевых узлов у одного животного.
Ключевые слова: спонтанные гепатомы, частота возникновения и размеры гепатокарцином, линия мышей СБА, фитоадаптогены (женьшень, родиола, элеутерококк).
O.A. Bocharova, R.V. Karpova, E.V. Bocharov, Yu.N. Soloviev PHYTOADAPTOGENE INHIBITION EFFECT
ON THE HEPATOMAS INCIDENCE IN HIGH-CANCER INBRED MICE CBA
FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow
Abstract
The aim of investigation was to evaluate the incidence and sizes of tumours in CBA inbred mice-males with high frequency of spontaneous hepatocarcinomas using multiphytoadaptogene complex (MPAC) preventive and therapeutic application. MPAC is a herbal formula composed of forty plants water-ethanol extracts components including Panax ginseng, Rhodiola rosea, Eleutherococcus senticosus, Schizandra chinensis and Aralia mandshurica.. The mice of the preventive group were given MPAC solution in drinking water during the first month of life including the final time period of liver tissue differentiation. As a result the tumours occurred with lower incidence as well as with lower volumes and number per animal. Long-term MPAC therapeutic administration (starting the 6-th month of mice age, when the first hepatocarcinomas are generated, until the death of the animal) also reduced the incidence and sizes of spontaneous hepatomas without changing their number per animal.
Key words: spontaneous hepatomas, hepatocarcinomas incidence and sizes, inbred strain of CBA mice, phy-toadaptogenes (Ginseng, Rhodiola, Eleutherococcus).
Введение
При спонтанном гепатоканцерогенезе у мышей-самцов линии СБА в предыдущих исследованиях было выявлено снижение экспрессии лейкоцитарных интегринов ЬРЛ-1 и Мас-1 при возрастании сывороточного уровня ИЛ-6 и ИЛ-10 [9]. Кратковременное введение МФА фитомикса-40, обладающего адгезиогенным действием [11], захватывая завершающий период дифференцировки ткани печени, предрасположенной к возникновению опухолей, приводит к долговременному усилению экспрессии молекул гетеротипической адгезии лейкоцитарных интегринов ЬРЛ-1 (СВ11а/СБ18) и Мас-1 (СБ11Ь/СБ18), обеспечивающих контактные взаимодействия иммунных эффекторов и клеток-мишеней [2-4]. Вместе с тем, продолжительное использование препарата, начиная с периода возникновения опухолей, также поддерживало коррекцию экспрессии лейкоцитарных интегринов на эффекторах иммунитета. Последнее, вероятно, повышает активность противоопухолевых реакций
иммунитета и способствует подавлению опухолевого процесса. В связи с вышеизложенным, целью настоящего исследования была оценка в обозначенных условиях воздействия МФА на уровень спонтанного опухолеобразования у мышей высокораковой линии СБА.
В задачи данной работы входило определение профилактического и лечебного воздействия МФА на частоту возникновения, количество и размеры гепатокарцином у мышей-самцов линии СВА.
Материалы и методы
Работу проводили на мышах-самцах высокораковой инбредной линии СБА (сублиния CBA/Lac Y), используя способ тестирования иммуномодуля-торов in vivo на модели спонтанного гепатоканцеро-генеза [5]. Исходно мыши получены из ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН, разведение отдела лабораторных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина». Эта линия является классической моделью генетической предрасположенно-
го 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
#
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СНИЖЕНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯГЕПАТОМ...
сти к опухолям печени с высоким риском их возникновения. Дистальная хромосома 1 в клетках этих мышей несет один и более генов, обеспечивающих предрасположенность к спонтанному и химически индуцированному гепатоканцерогенезу [19]. Первые спонтанные гепатомы у мышей-самцов линии СБА возникают, начиная с 6-месячного возраста, и встречаются в 7 раз чаще, чем у самок. В позднем онтогенезе, в возрасте 18-22 мес., в 100% случаев у самцов выявляют гепатокарциномы [22]. В нашей работе использовано 170 мышей. Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с международными этическими нормами. Мыши контрольной группы получали в качестве питья только воду. Водой наполняли стандартные поилки. Животные пили воду самостоятельно. Поскольку препарат является водно-спиртовым экстрактом, мышам дополнительных контрольных групп в воду добавляли раствор этанола соответствующей концентрации (3%) при разных режимах введения. Во всех контрольных группах были получены аналогичные результаты. Поэтому мы посчитали правомерным объединить эти данные в одну контрольную группу (группа 1). Мышам группы 2 (профилактическая) 10% раствор МФА добавляли в воду, которую получали самки, начиная с последних сроков беременности до отъема детенышей в возрасте 1 мес по-стнатального развития. Мышам группы 3 (лечебная) в воду добавляли аналогичный раствор, начиная с возраста 6 мес. (курсами) до естественной гибели животного. Курс применения препарата - 2 нед, интервал между курсами - 2 нед.
Часть животных (13-15 мышей из каждой группы) забивали в возрасте 4; 8; 22 мес. Печень контрольных и опытных животных, помимо макроскопической оценки, подвергали гистологической обработке по стандартной методике и окрашиванию гематоксилином-эозином. Микроскопически опухоли печени у исследуемых мышей были определены как гепатокарциномы. Макроскопической ревизии подвергали и другие органы животных. Однако опухолей при этом не наблюдали. Объём опухолей (мм3) вычисляли по стандартной формуле. Проводили измерение трех максимальных взаимно перпендикулярных размеров опухоли (А -длина, В - ширина, С - высота) у каждого животного и вычисляли ее объем: А х В х С х 0,52. Также определяли общий объём опухолевой массы органа, учитывая число гепатом в печени.
МФА фитомикс-40 представляет собой препарат на основе компонентов экстрактов сорока растений, включенных в Госфармакопею РФ, в том числе известных адаптогенов женьшеня, родиолы, элеутерококка, лимонника, аралии [4; 6; 7; 16]. Разработаны способы его биологической и химической стандартизации [9; 18]. В предыдущих исследованиях показаны противоопухолевые, антиоксидант-ные, антимутагенные, иммуномодулирующие, в том числе - интерфероногенные и адгезиогенные свойства МФА [1; 11; 12; 15; 17; 20; 21].
Статистический анализ результатов проводили с использованием программы «8ТАТ]БТ1СА 6.0». Для всех результатов просчитывали среднее значение и ошибку среднего по выборке (М ± т). Различия между группами считали статистически достоверными при р < 0,05.
Результаты
Из табл. 1 следует, что в контрольной группе в возрасте 8 мес частота возникновения опухолей со-
ставляет 10%. Число опухолей на мышь составило 0,20±0,16. Средний объём одной опухоли 31,7±24,1 мм3, что достоверно отличается от данных второй группы (р1-2=0,02). При этом величина опухолевой массы в среднем у одного животного была определена как 4,2±3,2 мм3. У животных 2 (профилактической) группы макро- и микроскопически опухоли в этом возрасте определены не были ни у одной из 14 исследованных мышей. В третьей (лечебной) группе число животных с гепатомами сравнимо с контрольной группой (20,0%). То же самое можно отметить и в отношении числа опухолей на мышь (0,27±0,15; р1-3=0,4). Средняя величина одной гепатомы (1,6±0,5 мм3) при этом не отличалась от контрольной группы (р1-3=0,26), так же как и общий объём опухолей на мышь (0,44±0,25; р1-3=0,45). Однако укажем, что объём одной опухоли в данной группе значимо отличался от «профилактической» группы (р2-3=0,001).
В табл. 2 показано, что в возрасте 22 мес. в контрольной группе (1) опухоли были выявлены у всех животных, т.е. частота возникновения опухолей = 100%. Число опухолевых узлов на мышь составило 2,7±0,3, а средний объём одной опухоли -381,9±62,0 мм3. При этом величина опухолевой массы в среднем у одного животного была равна 1043,9±193 мм3. У животных опытной группы (2), принимавших препарат профилактически, опухоли возникали реже - в 69,2% случаев (р1-2<0,001). Количество гепатом на мышь (1,0±0,3) при этом оказалось достоверно меньшим, чем в контроле (р1-2 <0,001). В «лечебной» группе животных (3) число животных с гепатомами сравнимо со 2-й группой (70,0%; р!-3 <0,001). Вместе с тем, число опухолевых узлов на мышь (1,6±0,2) было снижено не достоверно (р1-3=0,056). Средняя величина одной гепатомы при этом оказалась уменьшенной (115,7±30,2 мм3) также не значимо (р1-3=0,06) по сравнению с данными контрольной группы. Вместе с тем, общий объём опухолей на мышь (185,1±67,4 мм3) снизился статистически достоверно (р1-3=0,02).
Обсуждая полученные результаты, можно отметить, что кратковременное (в течение первого месяца постнатального онтогенеза) применение фитоадаптогена с адгезиогенным действием у мышей с высокой частотой наследственного опухоле-образования, захватывая «критический» период завершения дифференцировки ткани-мишени в раннем постнатальном онтогенезе, вероятно, вызывает долговременное усиление тканевой интеграции, или взаимной адгезивности клеток соответствующего органа.
Вместе с тем наблюдается повышение функциональной активности Т-лимфоцитов, что сопровождается ростом экспрессии молекул лейкоцитарных интегринов ЬБА-1 и Мас-1 и подавлением сывороточного уровня ИЛ-6 и -10 [8]. В результате, в позднем онтогенезе определено снижение уровня наследственного опухолеобразования (доли мышей с опухолями, числа и объёма опухолей у одного животного).
Следует подчеркнуть, что профилактические в отношении опухолей эффекты препаратов принято корректным выявлять либо при лечебном воздействии на предраковое заболевание, либо учитывая превентивное действие на спонтанное опухоле-образование у линейных животных. В данном случае получены положительные результаты и в том и в другом случае, поскольку в предыдущих работах показан лечебный эффект препарата в отношении предракового заболевания лейкоплакии слизистой оболочки полости рта [11; 12; 14].
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
#
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ СНИЖЕНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯ ГЕПАТОМ... 1 75
Таблица 1
Воздействие комплексного фитоадаптогена на частоту возникновения и размеры спонтанных гепатом у мышей
Группы мышей n мышей в группе n мышей с опухолями n опухолей/ мышь (M±m) Объем одной опухоли, мм3 (M±m) Объём опухолевой массы/мышь мм3 (M±m)
1. Контроль 30 3 (10%) 0,20 ± 0,16 31,70 ± 24,10 4,20 ± 3,20
2. Прием ФМ-40 до 1 мес. 14 0 0 0 0
3. Прием ФМ-40 с 6 мес. 15 3 (20,0%) 0,27 ± 0,15 1,6 ± 0,5 0,44 ± 0,25
Р - Р1-2>0,05 Р1-3>0,1 Р2-3>0,1 Р1-2=0,26 Р1-3=0,40 Р2-3=0,76 Р1-2=0,02 Р1-3=0,26 Р2-3=0,001 Р1-2=0,40 Р1-3=0,45 Р2-3=0,12
Таблица 2
Воздействие комплексного фитоадаптогена на частоту возникновения и размеры спонтанных гепатом у мышей линии СВА в возрасте 22 месяца____
Группы мышей n мышей в группе n мышей с опухолями n опухолей/ мышь (M±m) Объем одной опухоли, мм3 (M±m) Объём опухолевой массы/мышь мм3, (M±m)
1. Контроль 30 30 (100%) 2,7±0,3 381,9±62,3 1043,9±193,0
2. Прием ФМ-40 до1 мес. 13 9 (69,2%) 1,0±0,3 268,4±74,9 268,3±81,7
3. Прием ФМ-40 с 6-ти мес. 10 7 (70,0%) 1,6±0,4 115,7±30,2 185,1±67,4
Р - Р1-2<0,001 р1-3<0,001 Р2-3>0,1 Pi-2<0,001 р1-3=0,056 Р2-3=0,24 Р1-2=0,50 р1-3=0,06 Р2-3=0,12 Р1-2=0,02 р1-3=0,02 Р2-3=0,46
Следовательно, с высокой долей вероятности можно утверждать, что МФА обладает профилактическим действием в отношении опухолевых заболеваний.
Следует обратить внимание, что при введении препарата отдельного фитоадаптогена (экстракта Rhodiola rosea) высокогепатомным мышам СВА кратковременно (в течение одного месяца) в другое время, минуя критический период завершения дифференцировки ткани печени, описанные эффекты не реализуются [13].
Поэтому, вероятно, профилактическое действие препарата может быть реализовано только в случае его применения в критический период дифференцировки ткани-мишени [10].
Долговременный (в течение всего периода роста опухолей) вариант применения адгезиогенно-го препарата ФМ-40 приводит к торможению роста опухолей (уменьшение размеров опухолей) без изменения частоты возникновения опухолей у одного животного. В конечном итоге, общий объем опухолей у одного животного был подавлен по сравнению с контрольными животными. Вместе с тем в данном случае лечебный эффект снижения уровня спонтанного опухолеобразования (примерно на 30%) в позднем онтогенезе был аналогичен профилактическому варианту применения препарата. Отметим, что в предыдущих работах лечебный противоопухолевый эффект препарата был выявлен в клинических исследованиях, в частности при рас-
пространенном раке желудка человека [17], однако механизмы были до конца не ясны. Тем не менее, с высокой долей вероятности можно предполагать противоопухолевую активность изучаемого МФА
Заключение
Таким образом, данная работа показала, что МФА обладает профилактическим и лечебным действием в отношении генетически обусловленных гепатокарцином у высокораковых мышей СБА.
Вероятно, усиление взаимной адгезивности клеток печени при подавлении сывороточного содержания ИЛ-6 и -10 может нарушать экранирование опухолевых клеток, в том числе специфическими антителами, что, вероятно, приводит к усилению экспрессии молекул гетеротипической адгезии (включая ЬБЛ-1, Мас-1), обеспечивающих контактные взаимодействия иммунных эффекторов и клеток-мишеней. В результате выявлено снижение уровня наследственного опухолеобразования при профилактическом и лечебном применении адге-зиогенного препарата фитоадаптогена у высокораковых мышей СВА.
Актуальным в данном случае остается вопрос о вероятности инфильтрации гепатокарцином цитотоксическими лимфоцитами. Таким образом может быть обеспечено повышение иммунореак-тивности, которая, вероятно, и приводит к гибели опухолевых клеток.
Литература
1. Бочаров Е.В., Кучеряну В.Г., Бочарова O.A., Карпова Р.В. Нейропротекторные свойства фитоадапто-генов // Вестник РАМН. - 2008. - № 4. - С. 47-50.
2. Боценовский В.А., Барышников А.Ю. Молекулы клеточной адгезии // Успехи современной биологии. - 1994. - Т. 114, №6. - С. 741.
3. Бочарова O.A. Адгезионные взаимодействия в биологии рака // Вестник РАМН. - 2002. - №1. - С. 22-5.
№ 2/том 13/2014 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ
ф
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
СНИЖЕНИЕ ВОЗНИКНОВЕНИЯГЕПАТОМ...
4. Бочарова O.A., Барышников А.Ю., Давыдов М.И. Фитоадаптогены в онкологии и геронтологии. - М.: МИА, 2008. - 218 с.
5. Бочарова O.A., Барышников А.Ю., Карпова Р.В. и др. Способ оценки противоопухолевой активности in vivo на модели спонтанного гепатоканцерогенеза. Методическое руководство. Утверждено ученым советом ФГБУ "РОНЦ им. H.H. Блохина" РАМН № 12 от 03.12.2013. - М., 2014. - 18 с.
6. Бочарова O.A., Давыдов М.И., Барышников А.Ю. и др. Комплексные фитоадаптогены в онкологии и геоонтологии // Вестник РАМН. - 2009. - № 8. - С. 21-5.
7. Бочарова O.A., Карпова Р.В., Голубева В.А. и др. Токсикологическое изучение препарата Фитомикс-40 // Гигиена и санитария. - 1999. - № 5. - С. 60-1.
8. Бочарова O.A., Карпова Р.В., Ильенко В.А. и др. Лейкоцитарные интегвдны при гепатоканпешгенезе мышей высокораковой линии СВА // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - Т. 12, № 3. -
9. Бочарова O.A., Лыженкова М.А., Мезенцева М.В. и др. Фитоадаптоген для профилактической онкологии: иммунобиологические критерии состава // БЭБиМ. - 2003. - Т. 136, № 12. - С. 670-3.
10. Бочарова O.A., Модянова Е.А., Маленков А.Г. Явление увеличения сил сцепления при межклеточном взаимодействии в эпителиальных тканях в раннем постнатальном периоде. Открытие № 330 с приоритетом - июнь 1982 г, зарегистрир. в гос. реестре открытий СССР 19 фев. 1987 г.
11. Бочарова O.A., Пожарицкая М.М., Чекалина Т.Л. и др. Современные аспекты патогенеза и лечения лейкоплакии слизистой оболочки полости рта. Методическое руководство для врачей. - М.: ГОУ ВУНМЦ, 2004. - 46с.
12. Бочарова O.A., Пожарицкая М.М., Чекалина ТЛ и др. // Лейкоплакия слизистой оболочки полости рта: патогенез и возможности коррекции фитоадаптогеном // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2004. - Т. 138, № 12. - С. 652-7.
13. Бочарова O.A., Серебрякова Р.В., Бодрова Н.Б. Профилактический эффект Rhodiola rosea на спонтанное опухолеобразование в печени на модели высокораковой линии мышей // Вестник РАМН. -1994. - № 5. - С. 41-3.
14. Бочарова O.A., Чекалина Т.Л., Мезенцева М.В. и др. Перспективы использования Фитомикс-40 для профилактической онкологии // Российский биотерапевтический журнал. - 2002. - Т. 1, № 2. - С.
15. Бочков Н.П., Бочарова О.А., Аксенов А.А. и др. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы // Медицинская генетика. - 2005. -Т. 4, № 1. - С. 15-9.
16. Композиция ингредиентов для препарата Фитомикс-40. Патент РФ N 2099410, 1998 г.
17. Чулкова С.В., Бочарова О.А., Клименков А.А. и др. Возможности повышения эффективности комплексного лечения распространенного рака желудка фитоадаптогеном // Российский биотерапевтический журнал. - 2006. - Т. 5, № 2. - С. 85-92.
18. Шейченко О.П., Бочарова О.А., Шейченко В.И. и др. Исследование комплексного фитоадаптогена методом ВЭЖХ // Вопр. биол. мед. и фарм. химии. - 2007. - № 2. - С. 20-5.
19. Bilger A., Bennett L., Carabeo R. et al. A potent modifier of liver cancer risk on distal mouse chromosome 1: linkage analysis and characterization of congenic lines // Genetics. - 2004. - 167(2). - P. 859-66.
20. Bocharov E. V., Kucheryanu V. G., Ivanova-Smolenskaya I.A. et al. Therapeutic Efficacy of the Neuroprotective Plant Adaptogen in Neuroprotective Disease (Parkinson's Disease as an Example) // Bul. Exp. Biol. and Medicine. - 2010. - 149(6). - C. 682-4.
21. Bocharova O.A., Serebriakova R., Philippova T. et al. The first in vitro and in vivo trials of the phytomix-ture for anticancer treatment // Farmacevtski Vestnik. - 1997. - 48. - P. 414-5.
22. Sharp J., Riches A., Littlewood V., Thomas D. The incidence, pathology and transplantation of hepatomas in CBA mice // J Pathol. - 1976. - 119(4). - P. 211-20.
С. 53-б.
114.
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. H.H. БЛОХИНА РАМН
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
