Лейкоцитарные интегрины при гепатоканцерогенезе мышей высокораковой инбедренной линии СВА Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

УДК 616-006.04-092.9:577.175.14

О.А.Бочарова, Р.В. Карпова, В.А. Ильенко, Е.В. Бочаров, И.В. Казеев ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ ИНТЕГРИНЫ

ПРИ ГЕПАТОКАНЦЕРОГЕНЕЗЕ МЫШЕЙ ВЫСОКОРАКОВОЙ ИНБРЕДНОЙ ЛИНИИ СВА

ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н. Блохина» РАМН, Москва

Контактная информация

Ольга Алексеевна Бочарова, д-р биол. наук, профессор, заведующая лабораторией иммунофармакологии НИИ

экспериментальной диагностики и терапии опухолей

адрес: 115478, Москва, Каширское шоссе, 24; тел. +7(499)324-55-26

e-mail: imufarm@rambler.ru

Статья поступила 25.02.2013, принята к печати 09.07.2013

Резюме

Изучены нарушения экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1, а также цитокинов ИЛ-6 и ИЛ-10 у мышей высокораковой инбредной линии СВА, генетически предрасположенных к возникновению ге-патокарцином. Исследована возможность изменений данных показателей мультифитоадаптогеном и значимость коррекции адгезивных взаимодействий иммуноцитов и клеток-мишеней в восстановлении противоопухолевого надзора.

Ключевые слова: спонтанный гепатоканцерогенез, лейкоцитарные интегрины, цитокины, мультифитоа-даптоген.

O.A. Bocharova, R.V. Karpova, V.A. Ilyenko, E.V. Bocharov, I.V. Kazeev LEUKOCYTE INTEGRINS IN CBA MICES WITH HIGH RISK OF GEPATOCARCINOMAS

FSBI «N.N. Blokhin RCRC» RAMS, Moscow

Abstract

LFA-1 and Mac-1 expression as well as serum cytokines IL-6 and IL-10 were investigated in males of inbred mice CBA genetically predisposal to spontaneous hepatocarcinomas. Correction of these parameters by multiphy-toadaptogene administration was demonstrated. Datа obtained suggest the significance of enhancing the adhesive interaction between immune and cancer cells for immune escape tumors mechanism reduce.

Key words: spontaneous hepatocarcinogenesis, leucocyte integrins, cytokines, multiphytoadaptogene.

Введение

Известно, что способность опухолевых клеток к неконтролируемому росту, миграции, инвазии в окружающие ткани и образованию метастазов связана с нарушениями адгезивных взаимодействий клеток между собой или внеклеточным мат-риксом Г19: 231. Многие современные авторы уделяют большое внимание изучению рецепторов клеточной адгезии, их роли в процессе опухолеобразо-вания, а также исследованию препаратов, обладающих адгезиогенным эффектом. Таким образом, исследования молекул межклеточной адгезии на клеточных эффекторах иммунитета и возможности их коррекции являются актуальными.

Нарушение адгезивных взаимодействий клеток между собой и внеклеточным матриксом значимо в патогенезе злокачественного роста, ускользании опухоли от иммунологического надзора, инвазии и метастазировании [23]. На поверхности многих клеток присутствуют молекулы межклеточной адгезии (ICAM - intercellular adhesion molecules). С одной стороны, они являются гистонеспе-цифическими контактными молекулами интеграции клеток в тканевых системах, с другой - служат лигандами для функционально гомологичных молекул лейкоцитарных интегринов в том числе LFA-1 (CD11a/CD18) и Mac-1 (CD11b/CD18), обеспечивающих адгезию между иммунными эффекторами и клетками-мишенями [11]. Недостаток гистонес-пецифических молекул адгезии на мембранах опу-

холевых клеток индуцирует снижение экспрессии лейкоцитарных интегринов, что приводит к ослаблению их взаимодействий, сводя к минимуму элиминацию клеток-мишеней естественными киллерами, цитотоксическими лимфоцитами и др. В частности, слабая экспрессия молекулы адгезии 1САМ-1 сопровождается подавлением иммунных функций и наоборот. Это вносит определенный вклад в «ускользание» опухоли от иммунологического надзора [17; 20]. Существенной для реализации противоопухолевого эффекта представляется коррекция экспрессии лейкоцитарных интегринов [18].

Медиаторами взаимоотношений между иммунной системой и растущей опухолью являются цитокины. Многообразие биологических эффектов интерлейкинов, играющих существенную роль в пролиферации, дифференцировке, цитотоксичности иммунных клеток, межклеточных взаимодействиях, предполагает их участие в патологических процессах, в том числе в развитии и метастазировании злокачественных новообразований [16; 21; 26].

Таким образом, особенности ингибирования цитолитических потенций иммунных эффекторов в отношении опухолевых клеток связаны не только с нарушением рецепторного ансамбля, отвечающего за формирование конъюгатов с клеточными мишенями, но и с обязательным цитокиновым сопровождением [1; 13; 25]. Вероятно, нарушение адгезионных механизмов с участием сигнальной реактивности цитокинов при опухолевом процессе может нуждаться в соответствующей коррекции препара-

54

ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ

ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕ ИНТЕГРИНЫ..

тами с адгезиогенным действием. Интерес в данном аспекте представляют фитоадаптогены, которые регулируют межклеточную адгезию, являясь индукторами дифференцировки клеток, усиливают иммунологическую реактивность организма в отношении опухолей и способствуют противоопухолевому эффекту [15; 22].

МФА представляет собой препарат на основе компонентов экстрактов сорока растений, включенных в Госфармакопею РФ, в том числе, известных адаптогенов женьшеня, родиолы, элеутерококка, лимонника, заманихи и аралии [2]. Разработаны способы его биологической и химической стандартизации [3; 10]. В предыдущих исследованиях показаны антиоксидантные, антимутагенные, проти-воопуховолевые, иммуномодулирующие свойства МФА [4-6].

Целью проведенного исследования являлось изучение экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на иммуноцитах и сывороточного уровня IL-6 и IL-10 на примере мышей высокораковой инбредной линии СВА, генетически предрасположенных к развитию спонтанных гепатокар-цином, а также возможность коррекции этих показателей МФА.

Материалы и методы

Работу проводили на мышах-самцах высокораковой инбредной линии СВА (сублиния СВА/Lac Y). Исходно мыши получены из ФГБУ «Научный центр биомедицинских технологий» РАМН, разведение отдела лабораторных животных ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН. Эта линия является классической моделью генетической предрасположенности к опухолям печени с высоким риском их возникновения. Дистальная хромосома 1 в клетках этих мышей несет один и более генов, обеспечивающих предрасположенность к спонтанному и химически индуцированному гепатоканце-рогенезу [12]. Первые спонтанные гепатомы у мышей-самцов линии СВА возникают, начиная с 6-месячного возраста, и встречаются в 7 раз чаще, чем у самок [7; 8, 27]. В позднем онтогенезе, в возрасте 18-22 мес., в 100% случаев у самцов выявляют гепатокарциномы [9; 27]. В нашей работе использовано 170 мышей. Животных содержали в стандартных условиях вивария в соответствии с международными этическими нормами. Мыши контрольной группы получали в качестве питья только воду. Водой наполняли стандартные поилки. Животные пили воду самостоятельно. Поскольку препарат является водно-спиртовым экстрактом, мышам дополнительных контрольных групп в воду добавляли раствор этанола соответствующей концентрации (3%) при разных режимах введения. Во всех контрольных группах были получены аналогичные результаты. Поэтому мы посчитали правомерным объединить эти данные в одну контрольную группу (группа 1). Мышам группы 2 (профилактическая) 10 %-ный раствор МФА добавляли в воду, которую получали самки, начиная с последних сроков беременности до отъема детенышей в возрасте 1 месяца постнатального развития. Мышам группы 3 (лечебная группа) в воду добавляли аналогичный раствор, начиная с возраста 6 мес. (курсами) до естественной гибели животного. Курс применения препарата - 2 недели, интервал между курсами - 2 недели.

В каждой группе забивали 13-15 мышей в возрасте 4; 8; 22 мес. Относительное содержание

лимфоцитов периферической крови животных с экспрессией лейкоцитарных интегринов LFA-1 (СБ11а+ лимфоциты, %), Mac-1 (CD11b+ лимфоциты, %) определяли методом непрямой иммуноф-луоресценции с использованием наборов фирмы «BD Biosciences» (США). Реакцию учитывали на проточном цитофлуориметре FACScanto IIc («Bec-ton Dickinson», США).

Уровень цитокинов IL-6 и IL-10 в сыворотке крови мышей определяли методом твёрдофазного им-муноферментного анализа с использованием наборов фирмы «Diaclone» (Франция). Полученные результаты анализировали с использованием статистических пакетов "STATISTICA" 6.0, ONE-WAY ANOVA.

Результаты и обсуждение

Результаты работы показали (табл. 1), что у мышей линии СВА в возрасте 4 и 8 мес. относительное число лимфоцитов, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин LFA-1 ^D11a+ лимфоциты), в контрольной группе практически одинаково (47,8+2,6 % и 44,1+2,4 % соответственно). В возрасте 22 мес. этот показатель у животных снизился до 35,3±1,6 %. У мышей при профилактическом введении МФА (группа 2) изучаемый показатель к 22 месяцам понизился до 40,7+1,9 %, статистически не значимо в сравнении с контролем. Лечебное введение препарата (группа 3) выявило достоверное повышение данного показателя (42,3+2,9 %) в сравнении с контролем (см. табл. 1).

В контрольной группе мышей количество лимфоцитов, экспрессирующих лейкоцитарный интегрин Mac-1 (CD11b+ лимфоциты) к 22-месячному возрасту достоверно снизилось до 7,8+1,0 %. У опытных мышей 2 группы изучаемый показатель снизился до 11,5+1,1 %. В 3 группе параметр значимо превышал (12,8+1,7 %) уровень в контроле (табл. 2).

Как следует из данных табл. 3, у контрольных животных концентрация IL-6 в сыворотке крови к 22-месячному возрасту достоверно увеличилась до 139,1±6,6 пг/мл. Во 2 группе у животных сывороточный уровень IL-6 также достоверно повысился до 114,8±12,3 пг/мл, отставая от контроля в этот же период. Применение МФА в лечебном режиме не изменяло содержания IL-6 у животных к 22 месяцам (111,4±10,5 пг/мл), которое значимо не достигало контрольных значений в этом возрасте.

Сывороточная концентрация IL-10 в контроле к возрасту 22 мес. достоверно увеличилась. При введении МФА в профилактическом режиме уровень IL-10 не достиг контрольных значений. В группе 3 содержание IL-10 достоверно ниже по сравнению с контролем (табл. 4).

Полученные результаты показали, что у мышей-самцов высокораковой инбредной линии СВА в онтогенезе происходит снижение экспрессии лейкоцитарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах иммунитета параллельно с повышением уровня IL-6 и IL-10 в сыворотке крови. Это может быть связано с развитием спонтанного гепато-канцерогенеза у этих животных, со старением или как с тем, так и с другим процессами. Применение МФА в профилактическом режиме, в раннем онтогенезе, кратковременно, захватывая «критический» период развития ткани печени (7-10 дни), способствует долговременному увеличению числа CD11a+ и CD11b+ лимфоцитов, экспрессирующих соответственно молекулы LFA-1 и Mac-1, по сравнению с контрольными животными.

Таблица 1

Воздействие мультифитоадаптогена на содержание СБ11а+ лимфоцитов в сыворотке крови мышей высокораковой инбредной линии СВА__

Группы СБ 11а+ лимфоциты (%)

4 мес 8 мес 22 мес р

1. Контроль 47,8+2,6 44,1+2,4 35,4+1,6 р4-8=0,31 р8-22=0,005 р4-22=0,0003

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес. 50,0+4,8 48,1+4,8 40,7+1,9 р4-8=0,77 р8-22=0,18 р4-22=0,09

3. Прием ФМ-40, начиная с 6-го мес. 46,6+3,5 47,1+3,8 42,3+2,9 р4-8=0,93 р8-22=0,33 р4-22=0,36

р р:-2=0,67 р:-3=0,83 р2-3=0,57 р:-2=0,45 р:-э=0,53 р2-3=0,88 р:-2=0,09 р:-3=0,04 р2-3=0,5 -

Таблица 2

Воздействие мультифитоадаптогена на содержание СБ11Ъ+ лимфоцитов в сыворотке крови мышей высокораковой инбредной линии СВА__

Группы СБ 11Ь+ лимфоциты (%)

4 мес 8 мес 22 мес Р

1. Контроль 15,7+1,1 13,6+1,2 7,8+1,0 р4-8=0,21 р8-22=0,0008 р4-22=0,0001

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес 19,2+2,0 17,5+1,9 11,5+1,1 р4-8=0,54 р8-22=0,013 р4-22=0,003

3. Прием ФМ-40, начиная с 6-го мес 16,4+2,0 20,3+2,0 12,8+1,7 р4-8=0,18 р8-22=0,010 р4-22=0,18

р р,-2=0,10 р,_3=0,77 р2-3=0,16 р!-9=0,10 р!-3=0,01 р2-3=0,4 р1-2=0,05 р!-3=0,01 р2-3=0,3 -

Таблица 3 Уровень ГЬ-6 в сыворотке крови мышей высокораковой инбредной линии СВА при воздействии мультифитоадаптогена

ГЬ-6 (пг/мл) р

4 мес 8 мес 22 мес

1. Контроль 80,9±4,1 88,5±4,3 139,1±6,6 р4-8=0,21 р4-22=0,001 р8-22=0,001

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес 78,7±6,9 80,5±7,53 114,8±12,3 р4-8=0,85 р4-22=0,02 Р8-22=0,03

3. Прием ФМ-40, начиная с 6-го мес 82,9±6,0 84,1±5,9 111,4±10,5 р4-8=0,89 р4-22=0,04 Р8-22=0,03

р р:-2=0,78 р1-3=0,80 р2-3=0,64 р1-2=0,40 р1-3=0,58 р2-3=0,70 р1-2=0,05 р1-3=0,03 р2-3=0,83 -

Таблица 4 Уровень ГЬ-10 в сыворотке крови мышей высокораковой инбредной линии СВА при воздействии мультифитоадаптогена

Возраст ГЬ-10 (пг/мл) р

4 мес 8 мес 22 мес

1. Контроль 24,8±2,0 31,8±2,7 60,9±3,9 р4-8=0,40 р4-22=0,001 р8-22=0,001

2. Прием ФМ-40 в течение 1-го мес 20,2±2,7 25,1±3,4 46,8±5,3 р4-8=0,27 р4-22=0,004 р8-22=0,003

3.Прием ФМ-40, начиная с 6-го мес 21,5±3,4 22,7±2,7 45,1±5,6 р4-8=0,77 р4-22=0,001 р8-22=0,001

р р:-2=0,26 р:-3=0,52 р2-3=0,61 р1-2=0,21 р1-3=0,047 р2-3=0,45 р1-2=0,07 р1-3=0,04 р2-3=0,82

56 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ЛЕЙКОЦИТАРНЫЕИНТЕГРИНЫ...

Последнее сопровождается снижением со- -10 в сыворотке крови в данном эксперименте содержания IL-6 и IL-10. Применение препарата в провождалось признаками лимфоцитарной ин-лечебном режиме, минуя «критический» период фильтрации и деструкции опухолевых узлов в пе-дифференцировки ткани печени, долговременно, чени мышей опытных групп, снижением уровня кардинально не меняет эффектов, полученных при спонтанных гепатокарцином, лучшим соматиче-профилактическом введении МФА. Усиление экс- ским состоянием животных и повышением их вы-прессии лейкоцитарных интегринов на иммуноци- живаемости (неопубликованные данные). тах может активизировать образование конъюгатов с опухолевыми клетками, что согласуется с подав- Заключение лением уровней IL-6 и IL-10 [14; 24]. Последнее, вероятно, способствует ослаблению образования Снижение экспрессии лейкоцитарных интег-противоопухолевых антител, блокирующих анти- ринов LFA-1 и Mac-1 на лимфоцитах параллельно с гены опухолевых клеток и, следовательно, рецеп- повышением уровня IL-6 и IL-10 в сыворотке крови торы эффекторов иммунитета [21], а также сниже- у высокораковых самцов мышей линии СВА в он-нию ингибирования экспрессии в том числе моле- тогенезе может быть связано с развитием спонтан-кул адгезии ICAM-1 на клетках-мишенях [22]. При ных гепатокарцином, со старением или как с тем, этом может происходить миграция, накопление так и с другим процессами. иммунных эффекторов и их контактирование с На основании полученных результатов мож-опухолевыми клетками в патологическом узле. В но полагать, что коррекция экспрессии лейкоци-этом случае, во-первых, в клетки опухоли могут тарных интегринов LFA-1 и Mac-1 на эффекторах проникать факторы разрушения, в том числе про- иммунитета и сывороточного уровня IL-6 и IL-10 теиназы, лимфотоксины и реактивные интермедиа- может иметь значение при сдерживании ускольза-ты кислорода, азота, водорода. Во-вторых, в дан- ния опухоли от иммунологического надзора для ных условиях возможна активизации FasAPO1- осуществления киллинга опухолевых клеток эф-антигена (рецептора апоптоза), запускающего ме- фекторами иммунитета, участвующего в противо-ханизм «самоубийтва» клетки [23]. опухолевых реакциях организма. Вместе с тем Следует также отметить, что усиление экс- нельзя отказываться от предположения, что ука-прессии лейкоцитарных интегринов на эффекторах занная коррекция играет определенную роль в за-иммунитета, снижение уровня интерлейкинов -6 и медлении процессов старения организма. Литература 1. Барышников А.Ю., Демидов Л.В., Кадагидзе З.Г. Современные проблемы биотерапии злокачественных опухолей // Вестник московского онкологического общества. - 2008. - № 1. - С. 6-10. 2. Бочарова О.А. Композиция ингредиентов для Бальзама Алексеевой (Фитомикс-40) // Патент RU № 2099410. 1998. 3. Бочарова О.А., ЛыженковаМ.А., Куренная О.Н. и др. Способ биологического контроля комплексного фитоадаптогена // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2003. - Т. 136, № 12. - С. 694-6. 4. Бочарова О.А., Барышников А.Ю., Давыдов М.И. Фитоадаптогены в онкологии и геронтологии (на примере изучения Фитомикса-40). -М.: МИА, 2008. - 218 с. 5. Бочарова О.А., Давыдов М.И., Клименков А.А. и др. Перспективы применения фитоадаптогена в лечении распространенного рака желудка // Бюлл. экспер. биол. и мед. - 2009. - Т. 148, № 7. - С. 96-9. 6. Бочков Н.П., Бочарова О.А., Аксенов А.А. и др. Частота хромосомных аберраций в лимфоцитах пациентов с доброкачественной гиперплазией предстательной железы // Медицинская генетика. - 2005. - Т. 4, № 1. - С. 15-9. 7. Гобеев В.Н., Крипах Л.В., Березов Т.Т. Биохимические особенности печени высоко- и низкораковых линейных мышей, а также первичных спонтанных гепатом // Вопр. мед. хим. - 1978. - Т. 24, №4. - С. 533-9. 8. Медведев Н.Н. Линейные мыши. - Л.: Медицина, 1964. - 230 с. 9. Фактор В.М., Шипова Л.Я. Уровень клеточной ДНК в спонтанных гепатомах мышей линии СВА. Cell DNA of CBA mouse strain spontaneous hepatomas // Бюлл экспер биол и мед - 1984 - Т 97 №6 - С 710-3 10. Шейченко О.П., Бочарова. О.А., Кпапивкин Б.А. и др. Исследование комплексного фитоадаптогена методом ВЭЖХ // Вопр. биол. мед. фарм. химии. - 2012. - № 10. - С. 52-9. 11. Хаитов Р.М., Ярилин А.А., Пинегин Б.В. Иммунология: атлас. - М.: ГЭОТАР-Медиа, 2011. - 624 с. 12. Bilger A., Bennett L., Carabeo R. et al. A potent modifier of liver cancer risk on distal mouse chromosome 1: linkage analysis and characterization of congenic lines // Genetics.- 2004. - 167(2). - P. 859-66. 13. FillonM. Biomarkers and prostate cancer progression // J Natl Cancer Inst. - 2011. - 103(21). - Р. 1570-1. 14. Chiou S., Sheu B., Chang W. et al. Current concepts of tumor-infiltrating lymphocytes in human malignancies. // Reprod Immunol. - 2005. -67(1-2). - P. 35-50. 15. Guo L., Song L., Wang Z. Panaxydol inhibits the proliferation and induces the differentiation of human hepatocarcinoma cell line HepG2 // Chem Biol Interact. - 2009. - 181(1). - Р. 138-43. 16. Gupta M., Han J., Stenson M. et al. Elevated serum IL-10 levels in diffuse large B-cell lymphoma: a mechanism of aberrant JAK2 activation // Blood. - 2012. - 119(12). - P. 2844-53. 17. Hynes R. The extracellular matrix: not just pretty fibrils // Science. - 2009. - 326. - Р. 1216-9. 18. Kadioglu A., De Filippo K., Bangert M. The integrins Mac-1 and alpha4beta1 perform crucial roles in neutrophil and T cell recruitment to lungs during Streptococcus pneumoniae infection // J Immunol. - 2011. - 186(10). - P. 5907-15. 19. Kato Y., Hirano T., Yoshida K. et al. Frequent loss of E-cadherin and/or catenins in intrabronchial lesions during carcinogenesis of the bronchial epithelium // Lung Cancer. - 2005. - 48(3). - P. 323-30. 20. Kawaguchi T. Cancer metastasis: characterization and identification of the behavior of metastatic tumor cell and the adhesion molecules, including carbohydrates // Curr. Drug. Targets. Cardiovasc. Haematol. Disord. - 2005. - 5(1). - P. 39-64. 21. Kim D., Oh S., Kwon H., Lee S. Clinical significance of preoperative serum interleukin-6 and C-reactive protein level in operable gastric cancer // Cancer. - 2009. - 20(9). - Р. 155-61. 22. Kim S., Kwon H., Chi D. et al. Reversal of P-glycoprotein-mediated multidrug resistance by ginsenoside Rg(3) // Biochem Pharmacol. - 2003. -65. - Р. 75-8. 23. Lascombe I., Clairotte A., Fauconnet S. et al. N-cadherin as a novel prognostic marker of progression in superficial urothelial tumors // Clin Cancer Res. - 2006. - 12(9). - P. 2780-7. 24. Lu P., Zhu X., Xu Z. et al. Increased infiltration of activated tumor-infiltrating lymphocytes after high intensity focused ultrasound ablation of human breast cancer // Surgery. - 2009. - 145(3). - P. 286-93. 25. Neagu S., Lerescu L., Costea R. et al. Perioperative immunologic changes in colorectal cancer patients // Chirurgia (Bucur). - 2012. - 107(1). -59-65. 26. Sasada T., Suekane S. Variation of tumor-infiltrating lymphocytes in human cancers: controversy on clinical significance // Immunotherapy. -2011. - 3(10). - Р. 1235-51. 27. Sharp J., Riches A., Littlewood V., Thomas D. The incidence, pathology and transplantation of hepatomas in CBA mice // J Pathol. - 1976. -119(4). - 211-20. СПИСОК ИСПОЛЬЗУЕМЫХ СОКРАЩЕНИЙ МФА - мультифитоадаптоген

№ 3/том 12/2013 РОССИЙСКИЙ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИЙ ЖУРНАЛ