CC BY
20
© Яковець О. О.
УДК 618. 29:616. 12:611. 42
Яковець О. О.
Л1МФАНГ10ГЕНЕЗ В СЕРЦ1 ПЛ0Д1В ЛЮДИНИ
ДЗ «ДМА М0З УкраГни» (м. Дшпропетровськ)
Доотдження виконано у рамках науково-дослщ-ницько! роботи кафедри анатомп людини «Розвиток та становлення оргаыв та тканин експерименталь-них тварин та людини в онтогенез! у норм! та пщ впливом зовншых чинниюв», № державно! реестра-цЛ0112и002124.
Вступ. Розвиток репродуктивних технолопй по-требуе встякого та всеб!чного розум!ння майже ус!х ембрюнальних под!й, зокрема, що мае особливу зо-середженють, формування та розвиток серцево-су-динно! системи. До цього часу окремими шляхами проводились дослщження, присвячен! розвитку ц!-люного ембрюна та стовбурових клггин [1,2]. Сучас-ний погляд, а саме об'еднання зусиль кардюембр!-олопв та дослщниюв стовбурових клггин дозволить нам краще зрозум!ти поди, як! вщбуваються в ембр!-ональному серц! в норм! та при формуванн! вродже-них вад серця [4]. Окремим напрямком, що потребуе розум!ння ембрюнальних механ!зм!в васкулогенезу та кардюгенезу, е стратеги у лкуванн! ¡нфаркту мю-карду, а саме пошук та щентифкаци молекулярних сигнал!в та стимулюючих фактор!в, як! приймають участь в серцево-судинному розвитку [5,10].
Прийнято вважати, що похщн! кттини епкарду е попередниками гладко-м'язових кл!тин, ф!броблас-т!в, перицит!в та кардюмюцит!в. Але чи е похщн! кл!-тини епкарду джерелом кл!тин ендокарду в!нцевих судин на сьогодн! залишаеться сп!рним питанням. Дослщження [6,9] надали доказ!в щодо походження ендокард!альних кштин в!нцевих судин вщ кштин по-хщних епкарду. Але ц! результати спростовують зна-хщки отриман! [8], щодо походження цих кглтин вщ м!-груючо! популяци кл!тин ембрюнально! печ!нки. Також не виключаеться можливють походження ендокард!-альних кл!тин в!нцевих судин шляхом !нвапнаци вну-тр!шнього шару ст!нки серця - ендокарду [11].
Все бтьше в лггератур! придтяеться уваз! роль л!мфатично! системи серця при його патолопчних станах, зокрема при !нтрамюкард!альному склероз! [3,7]. Для кращого розумшня функц!й л!мфатично! системи серця в вЫцевм циркуляци дослщники ви-вчають пренатальний пер!од.
Формування л!мфатично! системи серця в пре-натальному кардюгенез! в останн! часи було недо-статньо висв!тлено у зв'язку з вщсутнютю специф!ч-них до л!мфатичного ендотелю бюмаркер!в.
Метою роботи було вивчення особливостей бу-дови л!мфатично! системи серця у плод!в людини.
0б'ект I методи дослщження. Для реал!заци мети нашо! роботи були доотджен! серця плод!в
уа!епка@1.иа
людини з 9-го по 32-й тиждень пренатального пе-рюду розвитку. Серця та фрагменти сердець плод!в людини одержували в пнеколопчних в!ддтеннях МКЛ №2 та МКЛ № 9 м. Днтропетровська, патоло-го-анатом!чному вщдтенн! обласно! дитячо! лкарн! у в!дпов!дност! з !снуючими нормативно-правовими актами, а також використовували арх!вний матер!-ал цих заклад!в. Досл!дження проведено з дотри-манням основних б!оетичних положень Конвенц!! Ради бвропи про права людини та бюмедицину (вщ 04.04.1997 р.), Гельсшсько! деклараци Всесв!тньо! медично! асощацп про етичн! принципи проведен-ня наукових медичних дослщжень за участю людини (1964-2008 рр.), а також наказу МОЗ Укра!ни № 690 в!д 23.09.2009 р.
Отриманий вологий матер!ал занурювали у 10 % розчин нейтрального забуференого формалшу терм!ном на 24 години з метою ф!ксац!! та стаб!л!-зацп кл!тино-тканинних структур. Проводку у спиртах морфоматер!алу проводили пюля фксацм за стандартною методикою. Пюля проводки матер!ал заливали у парафш. Зр!зи товщиною 5- 7мкм ви-готовляли на мкротом! та забарвлювали гематокси-лшом-еозином. Пюля отримання мкропрепарат!в оцшювали !х з метою подальшого !мунопстох!м!ч-ного дослщження. Для цього були використан! пер-винн! моноклональн! антитта, а саме фактор тран-скрипцп Ргох-1 та маркер прол!фераци кл!тин К1-67. Для !дентиф!кац!! реакц!! наносили розчин хромогену 3-д!ам!нобензидин тетрахлориду, який прояв-лявся у вигляд! насичено коричневого забарвлення чутливих кл!тин ст!нки серця. Р!вень експрес!! бшюв Ргох-1 та К1-67 оц!нювали шляхом математичного визначення вщсотка !мунопозитивних кл!тин вщ за-гально! к!лькост! г!столог!чно щентифкованих кл!тин (в середньому 150-300), пщрахованих у 5 випадко-во обраних полях зору м!кроскопа. Морфометричн! параметри обробляли за допомогою статистичних метод!в з використанням стандартних формул з визначенням середнього, помилки середньоариф-метично! та 1:-критер!ю при пор!внянн! середн!х величин.
Результати досл1джень та Ух обговорення.
Розкриття питань щодо механ!зм!в розвитку та становлення р!зних ланок судинних компонент!в серця, особливо л!мфатичного сегменту в!нцево! системи залежало вщ метод!в !дентиф!кац!! ендотел!аль-них л!мфатичних кл!тин. Застосування !н'екц!йних способ!в виявлення л!мфатичних судин, електро-нно-м!кроскоп!чних метод!в, скануючо! електронно!
мкроскопп не дозволяло дослщникам в достатньо-му обсяз1 висвптпити дан щодо приналежност судин до л1мфатичноТ системи, Тх топологи та псто-функ-цюнальних особливостей на етапах пренатального кардюгенезу. 3 появою нових бшьш чутливих л1мфа-тичних маркер1в з'явилася можливють ¡дентифкацп ендотел1альних л1мфатичних кл1тин на раншх етапах пренатального перюду.
В нашому дослщженш, використовуючи досить новий ¡мунопстох1м1чний маркер л1мфатичного ен-дотелш Ргох-1, були простежеш в серцях у плод1в людини деяю морфолопчш ¡нтрам1окард1альн1 осо-бливост л1мфатичних судин.
Вщомо, що елементи л1мфатичноТ судинноТ Ытки з'являються пюля розмежування артер1ального та венозного сегмен^в. Починаючи з 6-го тижня емб-рюгенезу в дшянщ аорти та легеневого стовбура у вщповщност до л^ературних джерел [11] були ¡ден-тифковаш скупчення ендотелiоцитiв, якi за своТми характеристиками вiдрiзнялися вiд артерiальних та венозних. Розвиток та поява лiмфатичного русла, на наш погляд, були обумовлеш розшаруванням венозного ендотел^ та формуванням венозних судин з базальною мембраною та лiмфатичних судин без неТ.
Реeстрацiя експресiТ бшка Ргох-1 в мiокардi пло-дiв людини дозволила нам детермiнувати лiмфа-тичнi ендотелiальнi клiтини, якi формували досить численш судиннi сплетення поряд з артерiальними ¡нтрамуральними судинами (рис. 1).
Лiмфатичнi iнтрамiокардiльнi судини ^¡мфока-пiляри) на гiстологiчних зрiзах виглядали у виглядi слiпих кармашв та рукавiв з широкими просвтами. Tопологiчна близькiсть стiнок лiмфокапiлярiв зi стш-ками артерiальних судин мае функцюнальне зна-чення для забезпечення, на наш погляд, дренажноТ функцп лiмфатичноТ системи серця при скороченнях кровоносних судин.
У порiвняннi з артерiальними та венозними судинами лiмфатичнi судини вiдрiзнялися за цшою низкою морфологiчних характеристик. Вони мали значно бшьшу площу просвiту, овально-видовжену форму та розташовувалися у виглядi розгалуженоТ системи трубок. В залежнос^ вiд локалiзацiТ судин-ний просв^ та форма лiмфатичних капiлярiв змшю-валися. Лiмфатичнi судини в товщi мiокарду скла-далися з лiмфокапiлярiв, якi мали рiзний дiаметр, капшярних сплетень та дренуючих лiмфатичних судин (рис. 2).
Рiвень експресiТ бшюв транскрипцiТ (Ргох-1) та пролiферацiТ (К1-67) в мiокардi плодiв людини упро-довж дослiджуваних термiнiв пренатального перюду мав не тшьки топологiчнi але й хронолопчш вiдмiн-ностi (табл.).
Висновок. Незважаючи на досить велику кшь-кiсть дослiджень, присвячених молекулярним та функцiональним характеристикам судинного ен-дотелiю, ще недостатньо вiдомо про мехашзми, якi контролюють диференцiювання та функцш лiм-фатичних судин. 3а нашими даними лiмфосудини були розташоваш як в субепiкардiальному просторi, iнтрамiокардiально, так i субендокардiально. При-чому в залежнос^ вiд локалiзацiТ лiмфо судини мали
Рис. 1. Стшка правого шлуночка серця плода людини в1ком 20 тижн1в. Реакц1я кл1тин л1мфатичного ендоте-л1ю з маркером Ргох- 1. Зб. х400.
Рис. 2. Стшка правого передсердя серця плода людини в1ком 22 тижш. Реакцт з маркером Ргох- 1. Зб. х100. Стр1лками вказаш л1мфатичн1 судини.
Таблиця
Р1вень експресГГ б1лк1в Ргох-1 та К1-67 у плод1в людини
В^т серця Ргох-1, М ± т К1-67, М ± т
ПШ 24,2 % ± 1,3 % 45,1% ± 2,3 %
ЛШ *45,7 % ± 2,2 % *22,2 % ± 0,8 %
Прим1тка: * вщмлнносп мiж лiвим та правим шлуночками достовiрнi на рiвнi Р<0,05.
репональш вiдмiнностi. Що стосуеться специфiч-нос^ судинних ланок в кiнцi ембрюнального перiоду, то вже чiтко вщокремлювалися артерiальнi судини в субепiкардiальному вщд1ш стiнок передсердь та шлуночкiв. Використовуючи в якос^ специфiчного ендотелiального маркера бшок транскрипцiТ Ргох-1 в кш^ 8-го тижня ембрiонального перiоду та упро-довж плiдного перiоду вже можна було провести межу мiж венозним та лiмфатичним ендотелieм. Пролiферативнi процеси в мiокардi правого шлуночка у порiвняннi з лiвим були значно активнiшi, що пщтверджуеться рiвнем експресiТ К1-67, а в той же час детермша^я судинних елемен^в, зокрема лiм-фатичного компонента домЫувала в лiвому шлуноч-ку (рiвень експресiТ Ргох-1 достовiрно був бшьше у порiвняннi з правим шлуночком).
Перспективи подальших дослГджень. В по-дальшому плануеться вивчення встановлених за-кономiрностей будови лiмфатичного русла серця в постнатальному перюдк
Л1тература
1. AL- Rawi M. Molecular and cellular mechanisms of lymphangiogenesis / M. AI- Rawi, R. E. Mansel, W. G. Jiang // Eur J Surg Oncol. - 2005. - Vol. 2. № 31. - P. 117- 121.
2. Baluk P. Markers for microscopic imaging of lymph angiogenesis and angiogenesis / P. Baluk, D. M. McDonald // Ann N Y Acad Sci. - 2008. - № 1131:1- 12, doi: 10. 1196/annals. 1413.001.
3. Development of lymphatic vasculature and morphological characterization in rat kidney / M. Tanabe, A. Shimizu, Y Masuda [et al.] // Clin. Exp. Nephrol. - 2012. - Vol. 833- 42, № 6. - doi: 10.1007/s10157- 012- 0637z.
4. Early cardiac development: a view from stem cells to embryos / P. Van Vliet, S. M. Wu, S. Zaffran, M. Puci/iat // Cardiovasc Res. - 2012. - Vol. 3, № 96. - P. 352 - 362.
5. Kato S. Lymphangiogenesis and expression of specific molecules as lymphatic endothelial cell markers / S. Kato, H. Shi-moda, J. RC, M. Miura // Anat Sci Int. - 2006. - Vol. 2, № 81. - P. 71- 83.
6. Miller A. J. The grossly invisible and generally ignored lymphatics of the mammalian heart / A. J. Miller // Med Hypotheses -2011 - Vol. 4, № 76. - P. 604- 606. - doi: 10.1016
7. Morphogenesis, structure and properties of lymphatic vessels / A. Ratajska, E. Jankowska- Steifer, E. Czarnowska [et al.] // Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). - 2012. - 66:90112. doi:10 5604/17322693.1020753.
8. Myocardial heterogeneity in permissiveness for epicardium- derived cells and endothelial precursor cells along the developing heart tube at the onset of coronary vascularization / H. Lie-Venema, I. Eralp, S. Maas [et al.] // Anat. Rec. A Discov. Mol. Cell. Evol. Biol. - 2005. - Vol. 2, № 282. - P. 120-129.
9. Origin of coronary endothelial cells from epicardial mesothelium in avian embryos / J. M. P. Pomares, R. Carmona, M. G. Iriarte [et al.] // Int. J. Dev. Biol. - 2002. - № 46. - P. 1005- 1013.
10. Smart N. Epicardial progenitor cells in cardiac regeneration and neovascularisation / N. Smart, K. N. Dubi, P. R. Riley // Vas-cul Pharmacol. - 2013. - Vol. 3, № 58. - P. 164- 173.
11. Viragh S. The origin of the epicardium and the embryonic myocardial circulation in the mouse / S. Viragh, C. E. Challice // Anat. Rec. - 1981. - № 201. - P. 157- 168.
УДК 618. 29:616. 12:611. 42 Л1МФАНГЮГЕНЕЗ В СЕРЦ1 ПЛ0Д1В ЛЮДИНИ Яковець О. О.
Резюме. Метою роботи було вивчення особливостей будови л1мфатично! системи серця у плод1в людини. Матер1али серця та фрагменти сердець плод1в людини з 9-го по 32-й тиждень пренатального перюду розвитку. Для ¡мунопстох1м1чного доотдження використовували первинн моноклональн антитта, а саме Prox-1 i маркер прол1фераци кттин Ki-67. За нашими даними л1мфосудини були розташован як в субепкар-д1альному простор^ iнтрамiокардiально так i субендокардiально. Причому в залежност вщ локалiзацiI лiм-фосудини мали репональы вщмЫностг Що стосуеться специфiчностi судинних ланок в юнц ембрюнального перюду, то вже чтео вщокремлювалися артерiальнi судини в субепiкардiальному вщдьт стЫок передсердь та шлуночюв. Використовуючи в якост специфiчного ендотелiального маркера бток транскрипцп Prox-1 в юнц 8- го на початку 9 тижня ембрюнального перюду та упродовж плщного перюду вже можна було провести межу мiж венозним та лiмфатичним ендотелieм.
Ключов1 слова: Prox- 1, Ki-67, лiмфосудини, серце плодiв, людина.
УДК 618. 29:616. 12:611. 42
Лимфаангиогенез в сердце плодов человека. Яковец Е. А.
Резюме. Целью работы было изучение особенностей строения лимфатической системы сердца плодов человека. Материалы сердца и фрагменты сердец плодов человека с 9-ой по 32-ю неделю пренатального периода развития. Для иммуногистохимического исследования использовались первичные моноклональ-ные антитела, а именно Prox-1 и маркер пролиферации клеток Ki-67. По нашим данным лимфатические сосуды были расположены как в субэпикардиальном пространстве, интрамиокардиально так и субэндокар-диальное. Причем в зависимости от локализации лимфасосуды имели региональные отличия. Что касается специфичности сосудистых цепей в конце эмбрионального периода, то уже четко отделялись артериальные сосуды в субэпикардиальном отделе стенок предсердий и желудочков. Используя в качестве специфического эндотелиального маркера белок транскрипции Prox-1 в конце 8-й и начале 9 недели эмбрионального периода, а также на протяжении плодного периода уже можно было провести грань между венозным и лимфатическим эндотелием.
Ключевые слова: Prox- 1, Ki-67, лимфососуды, сердце плода, человек.
UDC 618. 29:616. 12:611. 42
Limfoangiogenez in the heart of the human fetus Yakovets O. O.
Abstract. The objective of this research is to investigate the features of the heart lymphatic system structure in the human fetuses.
Materials and methods of research. For the purpose of objective fulfillment we examined the hearts of the human fetuses (from 9 to 32 week of the prenatal development period). We received the hearts of the human
fetuses and heart fragments in the gynecology departments of the Dnipropetrovsk Municipal Clinical Hospital No. 2 and Municipal Clinical Hospital No. 9, in the department of morbid anatomy of the Regional Children Hospital in accordance with current laws and regulations. Besides we used the archival materials stored in these institutions. The wet material has been immersed in a 10 % neutral buffered formalin solution for a period of 24 hour for the purpose of fixation and stabilization of the cellular tissue structures. The preparation of specimens in alcohol for the morphological examination has been done after fixation according to the standard procedure. After preparation the specimens were embedded in paraffin. The slices 5 - 7 |im in thickness have been done using microtome and colored by hematoxylin and eosin. Following that microscopic specimens have been examined for the purpose of the further immune histochemical study. With this aim in view we used the primary monoclonal antibodies, especially Prox-1 transcription factor and Ki-67 marker for the cellular proliferation. For the reaction identification we used 3-diaminobenzidine tetrachloride chromogen solution, which was evident as the intense brown coloration of sensory cells of the wall of the heart. The pattern of Prox-1 and Ki-67 proteins expression has been examined by means of mathematical definition of the percentage of immunopositive cells of the total number of histologically identified cells (150-300 at the average) calculated in 5 randomly chosen microscope's fields of view. The morphological parameters have been processed using statistical methods by applying the standard formulas with determination of average, arithmetic mean error and t-criterion at the comparison of means.
Research results and discussion. The exploration of issues in regard to the mechanisms of development and generation of different elements of the vascular components of the heart, especially lymphatic segment of the coronary system, depended on the methods of endothelial lymphoid cells identification. The application of injection techniques for identification of lymphatic vessels, electron-microscopic analyses and scanning electron microscope investigation does not let the scientists deal adequately with data in respect of belonging vessels to the lymphatic system, their topology and hysto functional features at the stages of prenatal cardiogenesis. With the appearance of new more sensitive lymphatic markers it is become possible to identify endothelial lymphoid cells at the early stages of perinatal period. In our research because of the application of the new immunohistochemical marker for lymphatic endothelial cells Prox-1, we observed some morphological intramyocardial features of lymphatic vessels in the hearts of the human fetuses. It has been established that the elements of lymphatic vasculature reveal themselves after division of arterial and venous segments. In accordance with the sources of literature, beginning from the 6th week of embryogenesis, accumulations of endotheliocytes are identified in the section of aorta and main pulmonary artery. These endothelial cells differ from arterial and venous cells by their characteristics. We are of the opinion that development and occurrence of the lymphatic bed are due to stratification of the venous endothelium and formation of the venous vessels with basal membrane and lymphatic vessels without basal membrane. Registration of Prox-1 protein expression in the myocardium of the human fetuses let as determinate the endothelial lymphoid cells, which formed numerous blood vessel plexuses near arterial intramural vessels (Figure 1). Lymphatic intramyocardial vessels (lymph capillary vessels) at the histological samples looked like blind pockets and channels with wide lumens. We are of the opinion that topological nearness of the walls of the lymph capillary vessels to the walls of the arterial vessels has functional value for the provision of the drainage function of the lymphatic system of the heart during contraction of the blood vessels. In comparison with arterial and venous vessels, lymphatic vessels were different according to a wide range of morphological characteristics. They had a far greater luminal area, oblong oval form and located in the form of ramified system of the tubes. Vessel lumen and form of lymph capillary vessels changed depending on localization. Lymphatic vessels within interior myocardium consisted of lymph capillary vessels which had different diameter, plexuses of capillary vessels and draining lymphatic vessels. The expression pattern of the proteins regulating cell transcription (Prox-1) and proliferation (Ki-67) in the myocardium of the human fetuses throughout the terms of the prenatal period under investigation had not only topological but chronological differences.
Conclusion. Despite the fairly large number of researches devoted to molecular and functional characteristics of the vascular epithelium, we have insufficient evidence on the mechanisms, which control differentiation and function of the lymphatic vessels. According to our sources lymphatic vessels were located in subepicardial area, in intramyocardial segment and in subendocardial segment. Lymphatic vessels had regional differences depending on their localization. With respect to specificity of the vessel components at the end of the embryonic period, the clear distinction of the arterial vessels in the subepicardial segment of the walls of atria and ventricles was evident. When using the protein regulating cell transcription (Prox-1) as the specific endothelial marker at the end of the 8th week of the embryonic period and throughout the fetal period, it was possible to demarcate venous endothelium from lymphatic endothelium. Proliferation processes were more active in the myocardium of the right ventricle in comparison with the left ventricle, which is confirmed by Ki-67 expression level; at the same time determination of the vessel elements, especially lymphatic component, was prevalent in the left ventricle (It is reliably known that Prox-1 expression level was more active in comparison with the right ventricle).
Keywords: Prox- 1, Ki-67, lymphatic vessels, fetal heart, human.
Рецензент - проф. Шерстюк О. О.
Стаття надшшла 05. 03. 2015 р.
