CC BY
269
Химия растительного сырья. 1998. №1. С. 15-18
УДК. 577.152.1
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ. ПЕРОКСИДАЗА
© Г.Ф. Давыдова, О.А. Ермаков, А.И. Панасенко, А.М. Тищенко
Тамбовский государственный университет им. Г.Р. Державина, г. Тамбов (Россия) E-mail: nauka@bold.tambov.ru
Авторы выражают глубокую благодарность фонду НТП "Биологические системы, биотехнологические процессы и переработка растительного сырья" Государственной технологической академии г. Красноярска за финансовую поддержку.
Пероксидаза является одним из существенных ферментов, присутствующих как в организме животных, так и в клетках растений. В статье представлены результаты исследования активности корня хрена, произрастающего в различных районах Тамбовской области. Из каждой партии корня получен экстракт, в котором после соответствующей очистки определено содержание белка, углеводов, железа и пероксидазная активность по пирокатехину (пирокатехин + пероксид водорода + растительный экстракт). Полученные результаты использованы для отбора качественного посевного материала.
Классическая пероксидаза (ЕС 1.11.1.7.) — фермент класса оксидоредуктаз, катализирующий окисление субстратов различной функциональности, в отличие от других типов пероксидаз обладает высокой специфичностью в отношении окислителя — пероксида водорода. Уникальные свойства этого фермента, хорошая растворимость в воде, высокая специфичность по окислителю, устойчивость при хранении, широкий спектр биологической активности обусловливают ее применение в медицине, науке и технике.
В растительных клетках имеется особый вид ор-ганелл, содержащих пероксидазу и выполняющих защитную антимикробную функцию. Действие пе-роксидазы проявляется в присутствии пероксида водорода, образующегося в растительной клетке. Кроме того, пероксидаза принимает участие в синтезе лигнина и в процессе его разрушения [1]. В ходе лигнификации происходит синтез фенилпропа-
ноидных предшественников лигнина и их последующая полимеризация в присутствии пероксида водорода.
В медицине пероксидаза применяется для диагностики острых, хронических бактериальных и вирусных (в том числе СПИД), инфекционных, аллергических, аутоиммунных, эндокринологических заболеваний и злокачественных новообразований методом иммунологического анализа [2]. Перокси-даза используется также для проявления гликопротеидов после периодатного окисления, для синтеза меченых углерод-14 пероксидаз и в качестве иммуногена при синтезе моноклональных антител.
А.А. Аверьянов и В.П. Лапикова [3] изучили пе-роксидазную активность выделений здоровых и зараженных пирикуляриозом листьев риса. Авторы установили, что пероксидазная активность и фунги-токсичность пораженных листьев выше, чем у здо-
ровых, что хорошо согласуется с известными бактерицидными свойствами фермента пероксидазы.
Широкий спектр применения и очень высокая цена чистого препарата [4] послужили мощным стимулом к развитию поиска новых источников получения фермента пероксидазы и методов ее выделения.
Экспериментальная часть
Для получения экстракта корни хрена подвергли очистке стандартным методом и обработали на винтовом прессе из нержавеющей стали [5].
Реактивы для анализа на белок, углеводы, железо использовали марки "ч" и "х. ч." без дополнительной очистки. Все аналитические растворы готовили исключительно на бидистилляте.
Определение значений E и рH выполнено на ио-номере ЭВ-74 с применением соответствующих электродов.
Анализ экстракта растительного субстрата на пероксидазную активность выполнен согласно методике, описанной Кейли и Хартри [5].
Обсуждение результатов
Как правило, для получения пероксидазы используют корень хрена, обеспечивающий наибольший выход фермента. Наряду с хреном известно выделение пероксидазы из редьки японской, репы, причем ряд препаратов получен в кристаллическом виде [6]. Сотрудниками института ботаники АН Казахстана [7] разработан метод выделения перок-сидазы из листьев полыни водным раствором хлорида натрия с концентрацией соли 0,49-0,51 М. Полученный экстракт фермента фракционируют сульфатом аммония по стандартной методике, после чего препарат очищают методом гель-фильтрации и затем — ионообменной хроматографии на карбок-симетилцеллюлозе. Фермент со степенью очистки 460 и удельной активностью 9250 мкмоль/мин на 1
мг получают с выходом 29%. Следует отметить, что большинство авторов при описании методик выделения фермента пероксидазы используют разные субстраты и, соответственно, разные единицы активности, что не позволяет сравнить активность препаратов, полученных из различных растительных субстратов отдельными авторами. Так, например, описано получение пероксидазы чайного листа вышеуказанным методом [8]. Методом электрофореза найдены М.м. отдельных фракций пероксида-зы: 26000±1100, 45000±1200, 52000±1100.
Представляет интерес выделение пероксидазы из дереворазрушающих грибов [9]. Найдено, что грибная пероксидаза не является лигнин- или Мп-зависимой пероксидазой, а относится к классу секреторных грибных пероксидаз типа классических пероксидаз растений.
Целью нашей работы является изучение ферментативной активности корней хрена, произрастающего на территории Тамбовской области — одного из интереснейших районов центральной России с природными признаками лесной и лесостепной растительности и черноземных почв. Нами собраны и переработаны по оригинальной методике с целью получения сока образцы корня хрена из 14 районов области. Активность полученного экстракта по пирокатехину составляет 152—300 мкмоль/мин.г, содержание белка 17—34 мг/мл, железа 1,25— 1,95х10-3 мг/мл. Значение Е равно 210—260 мВ, рH 4,8—5,4 ед.
Как и следовало ожидать, химический состав сока и его пероксидазная активность зависят от факторов, определяющих условия произрастания растения — количества влаги, состава почвы и освещенности. Согласно предварительным данным можно отметить, что корни хрена, собранные на открытой возвышенной местности с супесчанной почвой, дают наименьшее количество сока с низким содержа-
ЛЕКАРСТВЕННЫЕ ПРЕПАРАТЫ ИЗ РАСТИТЕЛЬНОГО СЫРЬЯ
17
нием белка и минимальной ферментативной активностью.
В производстве любого продукта очень важным показателем является выход целевого продукта на единицу массы сырья, а в случае растительного активного вещества большую роль дополнительно играют урожайность растения, стоимость его уборки и переработки. Согласно данным [6], пероксида-за, полученная из редьки японской, имеет М. м.
55000, что значительно выше 40000, соответствующей величины для пероксидазы из корня хрена. Представляло интерес оценить пероксидазную активность редьки черной, поскольку товарные показатели для редьки выглядят более экономичными, чем для корня хрена. Полученные результаты представлены в таблице.
Первичные параметры для оценки пероксидазной активности экстрактов из редьки и хрена
Наименование субстрата Время (х) окрашивания, сек Содержание белка, г/л RZ^)
Сок хрена 10-25 15-20 0,63
Сок редьки 15 17,1 0,62
х — время окрашивания — качественная реакция на пероксидазную активность образца. Определяется по времени окрашивания раствора пирогаллола стандартной концентрации при добавлении одной капли перекиси водорода в присутствии 0,025 мл растительного сока.
хх — RZ — показатель чистоты пероксидазы [4]. Однако возможны случаи, что образец будет иметь высокое значение RZ и отсутствие пероксидазной активности.
Сок редьки черной был получен по стандартной методике и испытан в идентичных условиях относительно сока хрена. Проба на окисление пирогаллола пероксидазы редьки равна, а в ряде случаев превышает соответствующий показатель для сока хрена.
Выводы
1. Изучена ферментативная активность корня хрена, произрастающего на территории Тамбовской области.
2. Найдено, что пероксидазная активность экстракта корня хрена в значительной мере зависит от условий произрастания растений.
3. Экспериментально показана высокая перок-сидазная активность экстракта редьки черной, что
позволяет сделать вывод о целесообразности развития работ по селекции наиболее продуктивных сортов растительного сырья.
Литература
1. Роговин В.В., Муравьев Р.А., Фомина В.А., Муштакова В.М. // Изв. РАН. Сер. биологическая. 1996. (1). 16.
2. Ронин В.С., Старобинец Г.М., Руководство к практическим занятиям по методам клинических лабораторных исследований. М., 1989.
3. Аверьянов А.А., Лапикова В.П. // Доклады акад. наук. 340. (5). 702. (1995).
4. Biochemical organic comрounds and diagnostic reagents. Каталог фирмы "Sigma" Chemical Comрany USA.
5. Keilin D., Hartree E.F. // Biochim. 1951. 81.
6. Диксон М., Уэбб Э. Ферменты. М., 1966.
7. А. с. 1108102 (1982) // БИ. №30. 15.08.1984.
8. Пруидзе Г.Н., Григорашвили Г.З., Ча-чуа Л.Ш., Тохадзе М.В. // Биохимия. 41. (10). 1819 (1976).
9. Ахмедова З.Р. // Биохимия. 61. (8). 1375 (1996).
10. Газарян И.Г., Решетников И.А., Досеева В.В.,
Беккер Е.Г. // Биохимия. 60 (7). 1017 (1995).
Поступило в редакцию 14.02.98
