CC BY
59
УДК 616.831-005.1-076
ЛАКУНАРНЫЙ ИНСУЛЬТ У ЖЕНЩИН: КЛИНИЧЕСКИЕ ДАННЫЕ И ПОКАЗАТЕЛИ
ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕМОСТАЗА
© Голдобин В.В., Клочева Е.Г., Бибулатов Б.В., Вавилова Т.В., Сироткина О.В., Ласковец А.Б.,
Машкова Н.П., Лачинова Т.М.
Кафедра невропатологии
Северо-Западного государственного медицинского университета им. И.И. Мечникова, Санкт-Петербург
E-mail: vgoldobin@inbox. ru
В остром периоде лакунарного инсульта были обследованы 20 женщин в возрасте от 48 до 84 лет. Контрольную группу составили 12 женщин. Выполнялись стандартный неврологический осмотр, оценка состояния в баллах по шкале инсульта Американского национального института здоровья (NIHSS) и шкале Ранкина, исследование клинического анализа крови, АДФ индуцированной агрегометрии и проточной цитометрии, молекулярно-генетический анализ мутации гена 1Ьа. Методом проточной цитометрии в основной группе выявлена активация тромбоцитарного звена гемостаза, коррелирующая с баллом по NIHSS. Показана неинформативность стандартной агрегометрии для оценки активации тромбоцитов у пациенток с лакунарным инсультом, отсутствие различия встречаемости мутации гена рецептора 1Ьа в основной и контрольной группах.
Ключевые слова: лакунарный инсульт, тромбоцитарный гемостаз, проточная цитометрия, молекулярногенетический анализ.
LACUNAR STROKE IN WOMEN: CLINICAL DATA AND PARAMETERS OF PLATELET HEMOSTASIS
Goldobin V. V., Klocheva E. G., Bibulatov B. V., Vavilova T. V., Sirotkina O. V., Laskovets A.B.,
Mashkova N.P., Lachinova T.M.
Neuropathology Department of the I.I. Mechnikov North-West State Medical University, Saint-Petersburg
20 women (aged 48 - 84) were examined during the acute stage of lacunar stroke. The control group consisted of 12 women. The neurological examination was performed, the patients’ condition was estimated with NIHSS and Rankin scale. The set of investigation included clinical blood analysis, ADP-induced agregometry and flow-cytometry, molecular genetic analisis of gene Iba. The flow-cytometry revealed the platelet activation in patients with lacunar stroke. The degree of activation correlated with the point of NIHSS. The conventional optic agregometry was not helpful for revealing the platelet activation. There was no difference in incidence of Iba gene mutation between patients with lacunar stroke and the control group.
Keywords: lacunar stroke, platelet hemostasis, flow-cytometry, molecular genetic analisis.
Термин «лакунарный инсульт» (ЛИ) является общепринятым для инфарктов вещества головного мозга, возникающих при поражении пенетри-рующих артерий. В структуре ишемических инсультов ЛИ составляют до 30% [1, 2, 3]. Клиническое течение ЛИ характеризуется низкой летальностью и хорошим восстановлением нарушенных функций. В проспективных клинических исследованиях было показано возникновение повторных ЛИ у 23,5% пациентов, перенесших ЛИ, в год в течение 3 лет [9], несмотря на проводимую вторичную профилактику, основу которой составляют антиагрегантные препараты.
Гендерные различия при ишемических инсультах изучены на примере атеротромботиче-ского и кардиоэмболического инсультов. У женщин инсульты возникают позже и имеют более тяжелое течение, чаще наблюдаются кардиоэмбо-лические варианты. Гендерные особенности ЛИ изучены мало.
Целью данного исследования являлось изучение клинических данных и показателей тромбо-
цитарного гемостаза у женщин, перенесших ЛИ, имеющих значение для последующей вторичной профилактики.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
В остром периоде ЛИ были обследованы 20 больных женщин, проходивших обследование и лечение в клинике нервных болезней СПбГМА им. И.И. Мечникова и ГУЗ Городская больница святой преподобномученицы Елизаветы. Диагноз ЛИ был подтвержден данными компьютерной томографии - у 14 или магнитно-резонансной томографии - у 6 пациенток (рис. 1).
Возраст обследуемых составлял от 48 до 84 лет (средний - 69,7±9,8 лет). В исследование не включали женщин с кардиоэмболическим вариантом инсульта, а также с хронической почечной недостаточностью на гемодиализе, идиопатиче-ской тромбоцитемией, острым коронарным синдромом, так как доказана активация тромбоцитов
Рис. 1. КТ головного мозга у пациентки Н. (стрелкой указан очаг ЛИ).
при данных состояниях. В исследование не включали пациенток, принимавших антидепрессанты из группы селективных ингибиторов обратного захвата серотонина, поскольку в литературе показано снижение агрегации тромбоцитов у больных, длительно принимающих данные препараты.
В качестве контрольной группы показателей агрегометрии и проточной цитометрии были обследованы 12 женщин, соответствующих по возрасту, не имеющих клинических признаков сосудистой патологии головного мозга.
Комплексное обследование включало: клинико-неврологическое, инструментальное и лабораторное исследования. На каждую больную заполнялась специально разработанная карта.
Неврологический осмотр выполняли по стандартной методике. Также проводилась оценка состояния пациентов на момент поступления и при выписке в баллах по общепринятым шкалам: шкале инсульта Американского национального института здоровья (NIHSS), которая характеризует основные функции, нарушающиеся при церебральном инсульте [4, 6], и шкале Ранкина, которая позволяет оценить степень инвалидизации пациентов в повседневной жизни и функциональную независимость [5, 8].
Лабораторные исследования включали исследование клинического анализа крови при поступлении и на 10-й день от развития ЛИ, аденозин-дифосфат (АДФ) индуцированную агрегометрию и проточную цитометрию на 10-й день от развития инсульта, молекулярно-генетическое исследование точечной мутации гена Iba. Венозную кровь забирали в утреннее время, натощак. В ус-66
ловиях процедурного кабинета под венозным жгутом проводилась венепункция локтевой вены иглой 21G со свободным током крови через ваку-тейнер в вакуумные полипропиленовые пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта К2 и К3 соль этинилдиаминтетрауксусной кислоты (для гематологического анализа, молекулярногенетического исследования) и 3,8% цитрата натрия (для агрегометрии и проточной цитометрии). Выполнение клинического анализа крови с подсчетом количества тромбоцитов осуществляли кондуктометрическим методом на автоматических гематологических анализаторах «Beckman Coulter LH 500» и «MaxM» (США). Показатель среднего объема тромбоцита (MPV) рассчитывался прибором автоматически из гистограммы тромбоцитов.
АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали фотометрическим методом на агрегометре «SOLAR» (Беларусь). Концентрация индуктора составляла 2,5 мкМ, 5 мкМ и 10 мкМ (АДФ производства «Sigma-Aldrich», США). Результат оценивали по изменению степени свето-пропускания в точке максимума, а также по скорости агрегации через 30 секунд после добавления АДФ. Перед исследованием на проточном цитометре проводили центрифугирование полученной крови при 1500 оборотов/мин в течение 5 минут при комнатной температуре для получения плазмы богатой тромбоцитами (БТП). Плазму обедненную тромбоцитами (ОТП) получали путем центрифугирования БТП при 3000 оборотов/мин в течение 15 минут. ОТП использовали для разведения БТП до 300 тысяч клеток/мкл, ес-
ли это было необходимо, а также калибровки аг-регометра на уровень Т=100%. Содержание GP IIb/IIIa и GP Iba на поверхности тромбоцитов, а также число клеток, экспрессирующих Р-селектин, определяли на проточном цитометре «CYTOMICS FC 500» («Beckman Coulter», СшА). Использовались флуоресцентно меченые моноклональные антитела CD61-FITC, VM16d-FITC и CD62P-PE. Количество GPIIb/IIIa и GPIba на поверхности тромбоцитов до и после индукции 10 мкМ АДФ оценивали по показателю средней интенсивности флуоресценции. Экспрессию Р-селектина на поверхности тромбоцитов оценивали как процент клеток, меченых CD62P-PE до и после индукции 10 мкМ АДФ. Математически рассчитывались коэффициенты:
1) AGP IIb/IIIa, который показывает увеличение в % количества рецепторов GP IIb/IIIa на поверхности тромбоцитов после индукции АДФ;
2) АР-селектина, показывающий увеличение % тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин после индукции АДФ.
Молекулярно-генетическое исследование включало выявление точечной мутации гена тромбоцитарного гликопротеида 1ba, локализо-ваного в 13 локусе короткого плеча 17 хромосомы (с.3550С>Г - замена С на Т в 3550 позиции). Наличие данной миссенс мутации приводит к замене триптофана на метионин в 145 положении аминокислотной последовательности белка (Thr145Met), в результате чего изменяется функциональная активность рецептора к фактору Вил-лебранда, что предрасполагает к тромбообразова-нию и увеличивает риск развития сердечнососудистых заболеваний почти в 3 раза [7].
Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом. Лизис клеток проводили по методу Канкеля с использованием реактивов фирмы «Хеликон» (Россия). Выход ДНК составлял 40-50 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови. Для идентификации однонуклеотидных замен использовали амплификацию соответствующего участка гена методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Амплификацию проводили на амплифика-торе «Терцик» (термостат программируемый четырехканальный для проведения ПЦР анализа ТП4-ПЦР-01 - «Терцик» ТУ 9452-001-4648206298, НПФ «ДНК-Технология», Россия) при помощи термостабильной высокопроцессивной рекомбинантной Taq ДНК полимеразы фирмы «Fermentas» (Литва). В результате реакции получали фрагмент 587 п.н., который подвергался ферментативному расщеплению с помощью рест-риктазы Hin 1I (1 ед.) в рестрикционном буфере. Продукт рестрикционного анализа электрофоре-
тически разделяли при 30 мА (150В) в геле в трис-боратном буфере. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания бромистым этидием. В случае нормального аллельного варианта (Thr) определялись фрагменты 270 п.н., 201 п.н. и 1163 п.н., при мутации образуются фрагменты 386 п.н. и 201 п.н. (Met).
Статистическую обработку полученных результатов выполняли с использованием пакета программ Statistica 6,0 for Windows (StatSoft Inc.). Изучаемые количественные признаки представлены в виде M±s, где М - среднее, s - одно стандартное отклонение. Проверка нормальности распределения проводилась по критерию Шапиро -Уилка. Для проверки гипотезы о равенстве средних для двух групп использовались параметрические (t-Стьюдента для независимых выборок; t-Стьюдента для связанных выборок) или непараметрические (Манна - Уитни, Вилкоксона) критерии. Различия считались статистически значимыми при p<0,05. Для корреляционного анализа применялись коэффициенты корреляции Пирсона или Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Неврологическая симптоматика чаще характеризовалась двигательными расстройствами. На рис. 2 представлены клинические данные у пациенток с ЛИ. Показатель шкалы Ранкина при поступлении составил 2,3±0,5 балла, на 10-е сутки 1,2±0,4 балла. Значение по шкале NIHSS при поступлении было 4,5±2,5 балла, что указывало на нетяжелый инсульт, при выписке - 2,1±1,0 балла. Наблюдалось достоверное (p<0,05) уменьшение значений указанных шкал, что свидетельствовало о положительной динамике течения заболевания.
Уровень тромбоцитов при поступлении был равен 242,4±99,5*109/л, на 10-е сутки 237,6±67,3*109/л. MPV при поступлении был 10,3±1,0 фл, на 10-е сутки - 8,8±0,9 фл. Отмечалось значимое уменьшение MPV к 10-м суткам течения инсульта (р<0,05). Не выявлено достоверного различия указанных показателей в основной и контрольной группах (р>0,05).
Степень агрегации тромбоцитов при стимуляции 2,5 мкмоль АДФ составила 57,1±24,2%, скорость - 26,6±15,5%/мин; при стимуляции 5 мкмоль АДФ степень агрегации была равна 69,1±24,3%, скорость - 31,2±14,8%/мин. В контрольной группе данные показатели составили соответственно 73,9±22,2%, 34,3±14,8%/мин;
72,0±17,2%, 37,3±18,7%/мин. Не наблюдалось достоверного различия показателей АДФ-индуцированной агрегации тромбоцитов у пациенток основной и контрольной групп (р>0,05).
100п
9О 8О 70 ВО 50 40 ЗО 20 10 0
Рис. 2. Клиническая картина у пациенток с ЛИ.
□ головная боль
□ гемипарез
□ атаксия
□ афазия
□ гемигипестезия
Таблица 1
Экспрессия Р-селектина на тромбоцитах при проточной цитометрии
Группа Тромбоциты, экспрессирующие Р-селектин, %
до стимуляции АДФ после стимуляции АДФ A
основная 4,0±3,8* 33,1±17,0* 84,6±14,5*
контрольная 1,6±0,8* 10,2±0,7* 62,0±9,3*
Примечание: * - р<0,05
Таблица 2
Количество рецепторов IIb/IIIa на тромбоците
Группа средняя интенсивность флюоресценции
до стимуляции АДФ после стимуляции АДФ A, %
основная 7,3±1,6* 7,9±1,4* 10,4±4,8
контрольная 9,2±1,8* 10,2±2,3* 9,8±8,0
Примечание: * - р<0,05
В табл. 1 представлено процентное количество тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин.
Выявлены достоверно (р<0,05) большие значения экспрессии Р-селектина тромбоцитами у пациенток основной группы по сравнению с контрольной, что свидетельствовало об активации тромбоцитов при ЛИ.
Наблюдалась значимая корреляционная связь % тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин после активации АДФ, со значением шкалы NIHSS при выписке, что указывало на худшее восстановление пациентов с более высоким уровнем активации тромбоцитов.
В табл. 2 представлены результаты проточной цитометрии рецепторов ПЪ/Ша.
Наблюдались достоверно (р<0,05) меньшие значения количества рецепторов к фибриногену на тромбоците у пациенток с ЛИ по сравнению с
контрольной группой. В то же время не наблюдалось достоверного различия показателя AIIb/IIIa, характеризующего увеличение количества рецепторов к фибриногену при индукции АДФ. Корреляционный анализ показателей основной группы выявил связь значений MPV с уровнем рецепторов IIb/IIIa, что свидетельствовало об увеличении числа рецепторов к фибриногену на тромбоците с увеличением его объема. В контрольной группе наблюдали отрицательную связь количества IIb/IIIa рецепторов с экспрессией тромбоцитами Р-селектина, что, возможно, было связано с уменьшением числа активных IIb/IIIa рецепторов при конформационных изменениях мембраны тромбоцита в процессе активации. Таким образом, меньшие значения количества рецепторов к фибриногену в основной группе могут быть объяснены уменьшением объема тромбоцита к 10-му
дню от развития ЛИ и конформационными изменениями мембраны активированных тромбоцитов.
Количество рецепторов 1ba на тромбоците у пациенток с ЛИ составляло 4,3±1,4, в контрольной группе 4,1±0,5, достоверного различия указанных показателей не наблюдалось (р>0,05). При молекулярно-генетическом исследовании достоверного различия частоты встречаемости мутантной аллели в основной и контрольной группах выявлено не было (р>0,05).
В основной группе наблюдалась положительная корреляция А Р-селектина с экспрессией рецепторов 1ba на тромбоците, что указывало на большую плотность рецепторов к фактору Вил-лебранда на активированных тромбоцитах.
Таким образом, на основании полученных результатов можно сделать выводы:
1. Методика стандартной агрегометрии неинформативна для оценки активации тромбоцитов у пациенток с лакунарным инсультом.
2. У пациенток с лакунарным инсультом наблюдается активация тромбоцитарного звена гемостаза, выявляемая методом проточной цитометрии.
3. Активированное состояние тромбоцитов может ухудшать восстановление пациенток с лакунарным инсультом.
4. При благоприятном течении нетяжелого лакунарного инсульта наблюдаются уменьшение среднего объема тромбоцита к 10-му дню течения инсульта, уменьшение активных рецепторов к фибриногену и незначительное увеличение рецепторов к фактору Виллебранда.
5. Мутация гена рецептора 1ba c.3550C>T на
тромбоците не является клинически значимой у
пациенток с лакунарным инсультом.
ЛИТЕРАТУРА
1. Гусев Е.И. Эпидемиология инсульта в России // Журн. неврологии и психиатрии. Прилож. Инсульт. - 2003. - С. 4-9.
2. Суслина З.А. Инсульт: диагностика, лечение, профилактика. - М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 288 с.
3. Bamford J., Sandercock P., Jones L. et al. The natural history of lacunar infarction: The Oxfordshire community stroke project // Stroke. - 1987. - Vol. 18, N3. - P. 545-551.
4. Biller J., Love B., Marsh IIIE. et al. Spontaneous improvement after acute ischemic stroke // Stroke. -1990. - Vol. 21, N7. - P. 1008-1012.
5. Bonita R., Beaglehole R. Modification of Rankin
Scale: recovery of motor function after stroke //
Stroke. - 1988. - Vol. 19, N12. - P. 1497-1500.
6. Brott T., Adams H.P., Olinger C.P. et al. Measurement of acute cerebral infarction: a clinical examination scale // Stroke. - 1989. - Vol. 20, N7. - P. 864870.
7. Gonzalez-Conejero R., Lozano M.L., Rivera J. et al. Polymorphisms of platelet membrane glycoprotein Ib associated with arterial thrombotic disease // Blood. -1998. - Vol. 92, N8. - P. 2771-2776.
8. Rankin J. Cerebral vascular accidents in patients over
the age of 60 // Scott. Med. J. - 1957. - Vol. 2, N.5. -
P. 200-215.
9. Staaf G., Lindgren A., Norrving B. Pure motor stroke from presumed lacunar infarct: Long-term prognosis for survival and risk of recurrent stroke // Stroke. -2001. - Vol. 32, N11. - P. 2592-2596.
