CC BY
34
УДК 616.831-005.1:616-005.6
Вестник СПбГУ. Сер. 11. 2012. Вып. 4
В. В. Голдобин, Е. Г. Клочева, О. В. Сироткина, Т. В. Вавилова, А. Б. Ласковец
КЛИНИЧЕСКИЕ ПРОЯВЛЕНИЯ И ПАРАМЕТРЫ ТРОМБОЦИТАРНОГО ГЕМОСТАЗА У ПАЦИЕНТОВ С АТЕРОТРОМБОТИЧЕСКИМ ИНСУЛЬТОМ
ГОУ ВПО «Северо-Западный государственный медицинский университет им. И. И. Мечникова», Санкт-Петербург
Церебральный инсульт является одной из ведущих медико-социальных проблем, что обусловлено высокой летальностью и инвалидизацией пациентов [1]. Несмотря на проводимое профилактическое лечение, повторное развитие инсультов в течение 5 лет наблюдается у 16-42% больных [2]. До настоящего времени механизмы развития ишемического инсульта окончательно не ясны. Определяющую роль в патогенезе ате-ротромботического инсульта (АТИ) играет взаимодействие тромбоцитов и эндотелия сосудистой стенки [3]. Вследствие этого основной составляющей вторичной профилактики АТИ является назначение антитромбоцитарных препаратов.
Целью данного исследования явилось изучение клинических данных и показателей тромбоцитарного гемостаза у пациентов с АТИ, что может иметь значение для совершенствования вторичной профилактики.
Материалы и методы исследования. В остром периоде АТИ обследовали 102 пациента: мужчин — 60 (58,8%), женщин — 42 (41,2%), средний возраст — 65,4±12,3 года, проходивших обследование и лечение в клинике неврологии Северо-Западного государственного медицинского университета имени И. И. Мечникова и Городской больнице святой преподобномученицы Елизаветы. Диагноз АТИ устанавливали на основании сочетания: стеноза соответствующей очагу артерии более 50% по данным дуплексного сканирования, отсутствия данных за кардиогенную эмболию и размера очага поражения головного мозга более 20 мм при КТ (рис. 1) [4-6].
На момент обследования 101 пациент принимал препараты ацетилсалициловой кислоты, 1 больной — клопидогрель.
В исследование не включали пациентов с кар-диоэмболическим вариантом инсульта, а также больных с хронической почечной недостаточностью на гемодиализе, больных с идиопатической тромбоцитемией, острым коронарным синдромом, так как активация тромбоцитов при данных состояниях доказана. Кроме того, исключались пациенты, принимающие антидепрессанты из группы селективных ингибиторов обратного захвата серотони-на, поскольку у больных, длительно принимающих данные препараты, отмечается снижение агрегации тромбоцитов. В качестве контрольной группы были обследованы 37 человек, не имеющих клинических признаков сосудистой патологии головного мозга.
© В. В. Голдобин, Е. Г. Клочева, О. В. Сироткина, Т. В. Вавилова, А. Б. Ласковец, 2012
Шт
Рис. 1. КТ головного мозга пациентки Н. с АТИ, стрелкой указан очаг инсульта
Комплексное обследование включало: клинико-неврологическое обследование, а также инструментальное и лабораторное исследования. На каждого больного заполнялась специально разработанная карта.
Неврологический осмотр выполнялся по стандартной методике. Также проводилась оценка состояния пациентов на момент поступления и при выписке в баллах по общепринятым шкалам. Шкала инсульта Американского национального института здоровья (NIHSS) характеризует основные функции, нарушающиеся при церебральном инсульте [7, 8]. Шкала Ранкина позволяет оценить степень зависимости в повседневной жизни и функциональную независимость [9, 10].
Лабораторное исследование включало клинический анализ крови при поступлении и на 10-й день от развития АТИ, а также аденозиндифосфат (АДФ) индуцированную агрегатометрию и проточную цитометрию на 10-й день от развития инсульта. Венозную кровь забирали в утреннее время, натощак. В условиях процедурного кабинета под венозным жгутом проводилась венепункция локтевой вены иглой 21G со свободным током крови через вакутейнер в вакуумные полипропиленовые пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта К2 и К3 соль этинилдиаминтетрауксусной кислоты (для гематологического анализа) и 3,8% цитрата натрия (для аггрегометрии и проточной цитометрии). Выполнение клинического анализа крови с подсчетом количества тромбоцитов осуществляли кондуктометрическим методом на автоматических гематологических анализаторах «Beckman Coulter LH 500» и «MaxM» (США). Показатель среднего объема тромбоцитов (MPV) рассчитывался прибором автоматически из гистограммы тромбоцитов.
АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали фотометрическим методом на агрегометре «SOLAR» (Беларусь). Концентрация индуктора составляла 2,5 мкМ, 5 мкМ (АДФ производства «Sigma-Aldrich», США). Результат оценивали по изменению степени светопропускания в точке максимума, а также по скорости агрегации через 30 с после добавления АДФ. Перед исследованием на проточном цитометре проводили центрифугирование полученной крови при 1500 об/мин в течение 5 мин при комнатной температуре для получения плазмы, богатой тромбоцитами (БТП). Плазму, обедненную тромбоцитами (ОТП), получали путем центрифугирования БТП при 3000 об/мин в течение 15 мин. ОТП использовали для разведения БТП до 300 тысяч кл/ мкл, если это было необходимо, а также калибровки агрегометра на уровень Т = 100%. Содержание GP IIb/IIIa и GP Iba на поверхности тромбоцитов, а также число клеток, экспрессирующих Р-селектин, определяли на проточном цитометре «CYTOMICS FC 500» («Beckman Coulter», США). Использовались флуоресцентно меченые моно-клональные антитела CD61-FITC, VM16d-FITC и CD62P-PE. Количество GP IIb/IIIa и GP Iba на поверхности тромбоцитов до и после индукции 10 мкМ АДФ оценивали по показателю средней интенсивности флуоресценции. Экспрессию Р-селектина на поверхности тромбоцитов оценивали как процент клеток, меченых CD62P-PE до и после индукции 10 мкМ АДФ. Математически рассчитывались параметры:
1) AGP IIb/IIIa, который показывает увеличение в % количества рецепторов GP IIb/IIIa на поверхности тромбоцитов после индукции АДФ;
2) АР-селектина, показывающий увеличение % тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин после индукции АДФ.
Молекулярно-генетическое исследование включало выявление точечной мутации гена тромбоцитарного гликопротеида 1ba, локализованого в 13 локусе короткого
плеча 17 хромосомы (с.3550С > T — замена С на Т в 3550 позиции). Наличие данной миссенс мутации приводит к замене триптофана на метионин в 145 положении аминокислотной последовательности белка (Thr145Met), в результате чего изменяется функциональная активность рецептора к фактору Виллебранда, что предрасполагает к тромбообразованию и увеличивает риск развития сердечно-сосудистых заболеваний почти в 3 раза [11].
Дезоксирибонуклеиновую кислоту (ДНК) выделяли из лейкоцитов крови стандартным фенол-хлороформным методом. Лизис клеток проводили по методу Канкеля с использованием реактивов фирмы «Хеликон» (Россия). Выход ДНК составлял 4050 мкг ДНК из 500 мкл цельной крови. Для идентификации однонуклеотидных замен использовали амплификацию соответствующего участка гена методом полимеразной цепной реакции (ПЦР) с последующим рестрикционным анализом. Амплификацию проводили на амплификаторе «Терцик» (термостат программируемый четырехканаль-ный для проведения ПЦР анализа ТП4-ПЦР-01 — «Терцик» ТУ 9452-001-46482062-98, НПФ «ДНК-Технология», Россия) при помощи термостабильной высокопроцессивной рекомбинантной Taq ДНК полимеразы фирмы «Fermentas» (Литва). В результате реакции получали фрагмент 587 полинуклеотидов, который подвергался ферментативному расщеплению с помощью рестриктазы Hin 1I (1 ед.) в рестрикционном буфере. Продукт рестрикционного анализа электрофоретически разделяли при 30 мА (150В) в геле в трис-боратном буфере. Результаты визуализировали в ультрафиолетовом свете после окрашивания бромистым этидием. В случае нормального аллельного варианта (Thr) определялись фрагменты 270 полинуклеотидов, 201 полинуклеотид и 1163 поли-нуклеотида, при мутации образуются фрагменты 386 полинуклеотидов и 201 полину-клеотид (Met).
Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Statistica 6,0 for Windows (StatSoft Inc.). Изучаемые количественные признаки представлены в виде М±а, где М — среднее, а — одно стандартное отклонение. Проверка нормальности распределения проводилась по критерию Шапиро—Уилка. Для проверки гипотезы о равенстве средних для двух групп использовались параметрические (t-Стьюдента для независимых выборок; t-Стьюдента для связанных выборок) или непараметрические (х2, Манна—Уитни, Вилкоксона) критерии. Различия считались статистически значимыми при p < 0,05.
Результаты. Клиническая картина у пациентов основной группы представлена на рисунке 2.
Среди обследованных пациентов наиболее часто наблюдались двигательные расстройства.
Показатель шкалы Ранкина при поступлении составил 3,3±1,0 балла, при выписке — 2,3±1,0 балла. Результат NIHSS при поступлении был равен 10,3±5,1 балла, что позволяет оценивать инсульт в данной группе как средней степени тяжести, при выписке — 5,4±3,9 балла. Наблюдалось значимое уменьшение баллов указанных шкал за время госпитализации (р < 0,05), что свидетельствовало об улучшении состояния пациентов.
Наблюдалась прямая достоверная (р < 0,05) корреляция возраста больных и балла по NIHSS при поступлении, что отражало более тяжелое состояние при поступлении пациентов старших возрастных групп.
100 -I
□ гемипарез
□ гемигипестезия СО атаксия
ЕЭ дизартрия В афазия
□ игнорирование В гемианопсия
И парез взора
Рис. 2. Клинические проявления АТИ в обследуемой группе
Уровень тромбоцитов у больных с АТИ при поступлении был равен 231,6±66,8х109/л, на 10-й день от начала заболевания — 240,5±70,2х109/л. MPV при поступлении был 9,9±1,0 фл, на 10-й день от начала заболевания — 11,0±11,6 фл. Наблюдались значимо более высокие значения MPV у пациентов с инсультом по сравнению с контрольной группой. Наблюдалось достоверное увеличение значения MPV у больных в динамике АТИ (р < 0,05).
С целью углубленного изучения параметров тромбоцитарного гемостаза и проведения молекулярно-генетического исследования были выбраны 42 пациента.
Результаты агрегометрии представлены в таблице. Наблюдалась достоверно более высокая скорость агрегации тромбоцитов на стимуляцию 2,5 мкмоль АДФ у лиц контрольной группы (р < 0,05) по сравнению с основной, в то время как при стимуляции 5 мкмоль АДФ значимого различия не выявлено. Полученные результаты меньших значений агрегации тромбоцитов у пациентов с АТИ, вероятно, связаны с действием постоянной антиагрегантной терапии.
Таблица. Показатели агрегометрии у пациентов с АТИ и в контрольной группе
Обследуемые 2,5 АДФ 5 АДФ
степень, % скорость, %/мин степень, % скорость, %/мин
Пациенты с АТИ 58,4±27,1 24,8±10,0* 69,7±38,9 27,0±12,7
Контрольная группа 79,3±24,1 30,6±12,7* 76,8±23,0 31,5±15,1
Примечание: * — р < 0,05.
В основной группе количество рецепторов IIb/IIIa на тромбоците до активации АДФ составило 7,0±1,7; после активации — 7,9±1,8. Коэффициент изменения количества рецепторов IIb/IIIa на тромбоците (AIIb/IIIa) был равен 10,3±4,8%, что достоверно больше значения в контрольной группе — 8,0±5,0%, и указывал на более активное увеличение рецепторов IIb/IIIa на тромбоците под влиянием АДФ у больных с АТИ.
Тромбоциты, экспрессирующие Р-селектин, до стимуляции АДФ составляли 5,1±4,3%, после стимуляции — 35,6±17,3%, в контрольной группе соответственно — 3,6±3,9% и 21,6±15,7%. Было выявлено достоверно большее значение Р-селектина после стимуляции АДФ у пациентов с АТИ, что свидетельствовало о более высокой активности тромбоцитов в данной группе. Таким образом, у пациентов с АТИ наблюдалось несоответствие данных стандартной агрегометрии, указывающей на меньшую агрегацию тромбоцитов при стимуляции низкими дозами АДФ, чем в контрольной группе, и результатов проточной цитометрии, свидетельствующей о более высокой активности тромбоцитов.
Достоверного различия количества рецепторов 1ba на тромбоците в основной и контрольной группах не наблюдалось (соответственно 4,0±1,3 и 4,4±1,3; р > 0,05). Однако при корреляционном анализе в основной группе наблюдалась прямая достоверная корреляция экспрессии рецепторов к 1ba и суммы баллов по NIHSS при выписке (р < 0,05), что указывало на худшее восстановление пациентов с более высоким уровнем экспрессии фактора Виллебранда.
При молекулярно-генетическом исследовании мутантная аллель в основной группе выявлялась достоверно чаще, чем в контрольной (р < 0,05).
Обсуждение. Одним из факторов риска развития сердечно-сосудистых заболеваний является высокая агрегационная способность тромбоцитов. «Золотым стандартом» для анализа активности тромбоцитов признан оптический метод. Однако недостатком данной методики является зависимость оптических характеристик от нетром-боцитарных причин: липидемии, протеинемии, а также проводимой лекарственной терапии. В основе метода проточной цитометрии заложена высокоспецифичная реакция антиген-антитело, что, возможно, позволяет отражать ситуацию in vivo более адекватно по сравнению с оптической агрегометрией.
В доступной нам литературе не встретилось данных об экспрессии рецепторов к фактору Виллебранда на тромбоците у пациентов с АТИ. Тромбообразование определяется взаимодействием фактора Виллебранда со специфическими рецепторами клеток крови, в первую очередь, тромбоцитов. Уровень фактора Виллебранда в крови у пациентов с АТИ значимо повышен в остром и в раннем восстановительном периодах инсульта [12, 13]. Мы наблюдали прямую значимую корреляцию уровня 1ba рецепторов с клиническими данными, что, возможно, отражает ухудшение восстановления пациентов с повышенным образованием комплекса «фактор Виллебранда — рецептор к фактору Виллебранда — фактор IX — фактор V».
Мутация гена c.3550C>T рецептора 1ba на тромбоците предполагает функциональную перестройку и более высокоактивное состояние рецепторного белка. В нашем исследовании мы определяли мутацию c.3550C>T в изолированном состоянии. Указанная мутация часто наблюдается совместно с различным числом тандемных повторов гена 1ba, определяющим длину активной «ножки» субъединицы 1b, при этом большая длина ножки обеспечивает более эффективное связывание с тромбоцитом.
Перспективным направлением терапии у данных пациентов могут быть препараты, влияющие на блокаду рецептора к фактору Виллебранда или комплекса «фактор Виллебранда — рецептор к фактору Виллебранда».
На основании проведенного исследования можно сделать выводы:
1. Для пациентов с атеротромботическим инсультом характерно более высокое значение среднего объема тромбоцитов. Увеличение данного показателя наблюдается в динамике атеротромботического инсульта.
2. Метод стандартной агрегометрии недостаточно информативен для оценки активации тромбоцитов у больных с атеротромботическим инсультом.
3. Метод проточной цитометрии позволяет выявить активацию тромбоцитарного звена гемостаза у пациентов с атеротромботическим инсультом.
4. Экспрессия рецепторов к фактору Виллебранда на тромбоците может иметь прогностическое значение для течения инсульта.
5. Мутация гена рецептора 1ba c.3550C>T на тромбоците у больных с атеротромботическим инсультом наблюдается чаще, чем у здоровых лиц.
Литература
1. Гусев Е. И., Скворцова В. И., Стаховская Л. В. Эпидемиология инсульта в России // Журн. неврологии и психиатрии. Прилож. Инсульт. 2003. С. 4-9.
2. Antithrombotic Trialists' Collaboration. Collaborative meta-analysis of randomised trials of antiplatelet therapy for prevention of death, myocardial infarction, and stroke in high risk patient // BMJ 2002. Vol. 324, N 7329. P. 71-86.
3. Суслина З. А., Танашян М. М., Ионова В. Г. Ишемический инсульт: кровь, сосудистая стенка, антитромботическая терапия. М.: Медицинская книга, 2005. 248 с.
4. Суслина З. А., Пирадов М. А. Инсульт: диагностика, лечение, профилактика. М.: МЕД-пресс-информ, 2009. 288 с.
5. Скворцова В. И., Евзельман М. А. Ишемический инсульт. Орел, 2006. 404 с.
6. Adams H. P. Jr., Bendixen B. H., Kappelle L. J. et al. Classification of sup-type of acute ischemic stroke. Definition for use in a multicenter clinical trial. TOAST. Trial of Org 10172 in acute stroke treatment // Stroke. 1993. Vol. 24, N 1. P. 35-41.
7. Biller J., Love B., Marsh III E. et al. Spontaneous improvement after acute ischemic stroke // Stroke. 1990. Vol. 21, N 7. P. 1008-1012.
8. Brott T., Adams H. P., Olinger C. P. et al. Measurement of acute cerebral infarction: a clinical examination scale // Stroke. 1989. Vol. 20, N 7. P. 864-870.
9. Bonita R., Beaglehole R. Modification of Rankin Scale: recovery of motor function after stroke // Stroke. 1988. Vol. 19, N 12. P. 1497-1500.
10. Rankin J. Cerebral vascular accidents in patients over the age of 60 // Scott Med J. 1957. Vol. 2, N 5. P. 200-215.
11. Gonzalez-Conejero R., Lozano M. L., Rivera J. et al. Polymorphisms of platelet membrane glycoprotein Ib associated with arterial thrombotic disease // Blood. 1998. Vol. 92, N 8. P. 2771-2776.
12. Шимохина Н. Ю., Петрова М. М., Савченко А. А. Состояние гемостаза, метаболическая активность тромбоцитов и прогнозирование повторных цереброваскулярных осложнений тромботического характера у сердечно-сосудистых больных в остром периоде ишемического инсульта // Клинико-лабораторный консилиум. 2010. Т. 33-34, № 2-3. С. 102-106.
13. Kozuka K., Kohriyama T., Nomura N. et al. Endothelial markers and adhesion molecules in acute ischemic stroke — sequential change and differences in stroke subtype // Atherosclerosis. 2002. Vol. 161, N 1. P. 161-168.
Статья поступила в редакцию 2 июля 2012 г.
