CC BY
22
УДК 616.132.5-007.5:616.155.2-08
активация тромбоцитов у пациентов с извитостью брахиоцефальных артерий и возможности её коррекции
Е.Г. Клочева 1, В.В. Голдобин 1, С.М. Туаршева 1, Т.В. Вавилова 1, О.В. Сироткина 12, А.Б. Ласковец 1
1 Северо-Западный государственный медицинский университет им. И.И. Мечникова,
Санкт-Петербург, Россия 2 Петербургский институт ядерной физики им. Б.П. Константинова, Гатчина, Россия
PLATELET ACTIVATION IN PATIENTS WITH BRACHIOCEPHALIC ARTERY TORTUOSITY AND ITS CORRECTION POSSIBILITIES
E.G. Klocheva 1, V.V. Goldobin 1, S.M. Tuarsheva 1, T.V. Vavilova 1, O.V. Sirotkina 12, A.B. Laskovets 1 1 North-West State Medical University named after I.I. Mechnikov, Saint-Petersburg, Russia
2 Petersburg Institute of nuclear physics named after B.P. Konstantinov, Gatchina, Russia
© Коллектив авторов, 2013
Представлены клинические данные и показатели тромбоцитарного гемостаза у больных с патологической извитостью магистральных артерий головы на ранних стадиях недостаточности мозгового кровообращения. Прием дипиридамола в течение месяца сопровождался изменением данных агрегометрии и проточной цитометрии. Наиболее чувствительными показателями были скорость агрегации тромбоцитов на индукцию 5 мкмоль аденозиндифосфата, степень агрегации на индукцию коллагеном, экспрессия тромбоцитами Р-селектина, стимулированная 10 мкмоль аденозиндифосфата. Резистентность к дипиридамолу была выявлена у 36% обследованных.
ключевые слова: патологическая извитость магистральных артерий головы, тромбоциты, агрегация тромбоцитов, проточная цитометрия, Р-селектин, дипиридамол, резистентность к дипиридамолу.
Clinical data and platelet hemostasis parameters in patients with pathologic tortuosity of brachiocephalic arteries in early stages of brain blood circulation insufficiency. Dipyridamole intake in 1 month leaded to aggregometry and flow cytometry changes. The mostly sensitive parameters were the velocity of platelet aggregation after 5 umol adenosindiphosphate induction, degree of aggregation after collagen induction and P-selectin expression on platelet surface after 10 umol adenosindiphosphate stimulation. Dipyridamole resistance was revealed in 36% of patients.
Key words: pathologic tortuosity of brachiocephalic arteries, platelet, platelet aggregation, flow cytometry, P-selectin, dipyridamole, dipyridamole resistance.
Цереброваскулярные заболевания являются важнейшей медико-социальной проблемой и занимают второе место среди причин смертности и первое место среди причин инвалидизации населения [1]. Одной из причин церебрального ишемического инсульта является патологическая извитость магистральных артерий головы (ПИМАГ) [2]. ПИМАГ предрасполагает к нарушению гемодинамики за счет перепада давления на внутренней и наружной стенке изгиба артерии, что приводит к турбулентному току крови. Дополнительным фактором тром-бообразования у данных пациентов является замедление кровотока за счет перегиба сосуда [3]. Современные методы нейровизуализации: магнитно-резонансная ангиография (МРА) церебральных артерий, рентгенконтрастная ангиография церебральных артерий при спи-
ральной компьютерной томографии позволяют выявлять ПИМАГ у больных с признаками дис-циркуляторных нарушений на ранних стадиях недостаточности мозгового кровообращения.
Нехирургическая профилактика ишемических нарушений у данных пациентов направлена на коррекцию гемореологических показателей. Активация тромбоцитов является наиболее вероятной реакцией клеточного гемостаза в условиях турбулентного кровотока с перепадом давлений (shear stress phenomenon) и предполагает назначение препаратов, препятствующих конформационному изменению тромбоцитов у данных пациентов.
По литературным данным, назначение ди-пиридамола приводит к стабилизации формы тромбоцитов, препятствующей их активации [4]. Механизм стабилизации тромбоцитов
связывают с ингибированием высвобождения внутриклеточного кальция и отсутствием его влияния на актиновый компонент цитоскелета за счет модуляции активности протеинкиназ циклическими аденозинмонофосфатом и гуа-нозинмонофосфатом [5, 6].
целью исследования являлось изучение изменений показателей тромбоцитарного гемостаза и возможностей их коррекции приемом дипиридамола у пациентов с клинически мало-симптомной ПИМАГ.
материалы и методы
Были обследованы 33 пациента с ПИМАГ в возрасте 46,7±14,2 года, мужчин 6 (18%), женщин 27 (82%). Комплексное обследование включало клинико-неврологическое, инструментальное и лабораторное исследования. На каждого больного заполнялась специально разработанная карта.
Неврологический осмотр выполнялся по стандартной методике.
МРА церебральных артерий выполнялась на томографе «Signa EXCITE HD» с напряженностью магнитного поля 1,5 Тесла в режиме 3D TOF с определением калибра артерии, правильности её хода и отхождения. На рисунке 1 представлены различные типы извитости у обследованных пациентов.
Лабораторное исследование проводили при первичном обследовании и через месяц после начала терапии дипиридамолом. Лаборатор-
ное исследование включало клинический анализ крови, а также аденозиндифосфат (АДФ)-индуцированную агрегатометрию и проточную цитометрию. Венозную кровь забирали в утреннее время, натощак. В условиях процедурного кабинета под венозным жгутом проводилась венепункция локтевой вены иглой 21G со свободным током крови через вакутейнер в вакуумные полипропиленовые пробирки, содержащие в качестве антикоагулянта К2 и К3 соль этинил-диаминтетрауксусной кислоты (для гематологического анализа) и 3,8% цитрата натрия (для аггрегометрии и проточной цитометрии). Выполнение клинического анализа крови с подсчетом количества тромбоцитов осуществляли кондуктометрическим методом на автоматических гематологических анализаторах «Beckman Coulter LH 500» и «MaxM» (США). Показатель среднего объема тромбоцитов (MPV) рассчитывался прибором автоматически из гистограммы тромбоцитов.
АДФ-индуцированную агрегацию тромбоцитов исследовали фотометрическим методом на агрегометре «SOLAR» (Беларусь). Концентрация индуктора составляла 5 мкМ (АДФ производства «Sigma-Aldrich», США). Результат оценивали по изменению степени светопропу-скания в точке максимума, а также по скорости агрегации через 30 с после добавления АДФ. Перед исследованием на проточном цитометре проводили центрифугирование полученной крови при 1500 об/мин в течение 5 мин при
рис. 1. Извитость брахиоцефальных артерий у обследованных пациентов (стрелками указаны извитые артерии)
комнатной температуре для получения плазмы, богатой тромбоцитами (БТП). Плазму обедненную тромбоцитами (ОТП), получали путем центрифугирования БТП при 3000 об/мин в течение l5 мин. ОТП использовали для разведения БТП до 300 тысяч кл/мкл, если это было необходимо, а также калибровки агрегометра на уровень Т = l00%. Содержание GP IIb/IIIa на поверхности тромбоцитов, а также число клеток, экспрессирующих Р-селектин, определяли на проточном цитометре «CYTOMICS FC 500» («Beckman Coulter», США). Использовались флуоресцентно меченые моноклональные антитела CD6l-FITC, CD62P-PE (Beckman Coulter, США). Количество GP IIb/IIIa на поверхности тромбоцитов до и после индукции l0 мкМ АДФ оценивали по показателю средней интенсивности флуоресценции. Экспрессию Р-селектина на поверхности тромбоцитов оценивали как процент клеток, меченных CD62P-PE до и после индукции l0 мкМ АДФ. Математически рассчитывались параметры:
1) AGP IIb/IIIa, который показывает увеличение в % количества рецепторов GP IIb/IIIa на поверхности тромбоцитов после индукции АДФ;
2) АР-селектина, показывающий увеличение % тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин после индукции АДФ.
Статистическую обработку результатов выполняли с использованием пакета программ Statistica 6.0 for Windows (StatSoft Inc.). Изучаемые количественные признаки представлены в виде М±о, где М - среднее, о - одно стандартное отклонение. Проверка нормальности распределения проводилась по критерию Шапиро -
Уилка. Для проверки гипотезы о равенстве средних для двух групп использовались параметрические (t-Стьюдента для связанных выборок) или непараметрические (х2, Вилкоксона) критерии. Различия считались статистически значимыми при p<0,05.
Результаты. На повторное обследование не явились 8 (27%) пациентов, которые были исключены из статистического анализа.
Причинами обращения в клинику были жалобы на головную боль у 14 (56%), эпизоды головокружения у 17 (68%), синкопальное состояние у 1 (4%) больных. Основные очаговые симптомы представлены на рисунке 2.
Наиболее часто клиническая картина была представлена двигательными расстройствами в виде пирамидной недостаточности и атаксии.
Достоверного изменения числа тромбоцитов и MPV за время лечения выявлено не было (табл. 1).
В таблице 2 приведены показатели агрегации тромбоцитов в ответ на индукцию АДФ и коллагеном.
Было выявлено снижение скорости агрегации тромбоцитов на индукцию АДФ и степени агрегации на индукцию коллагеном, что может указывать на эффективность проводимого лечения.
Метод оптической агрегометрии в настоящее время является «золотым стандартом» для анализа активности тромбоцитов. Однако недостатком данной методики является зависимость оптических характеристик от нетромбоцитар-ных причин: липидемии, протеинемии. Кроме того, в процессе подготовки проб к исследованию in vitro происходит изменение активности тромбоцитов.
80
60
CD
S
| 40
го
X
со
20
пирамидная недостаточность | атаксия
| нарушение чувствительности I синдром Горнера
Клинические явления
рис. 2. Клинические проявления у обследованных пациентов с ПИМАГ
0
Таблица l
значения тромбоцитарных показателей гемограммы
Значение Исходно Через 30 дней р
Тромбоциты, хЮ9/л 244,8± 73,0 24l,4± 76,3 0,6l5
MPV, фл. 8,3±l,0 ll,2±l4,0 0,602
Таблица 2
Агрегация тромбоцитов у обследованных пациентов
Значение Исходно Через 30 дней р
Степень агрегации АДФ, % 79,4±l9,9 72,8±l5,4 0,277
Скорость агрегации АДФ, %/мин 35,8±ll,7 29,7±l4,2 0,024
Степень агрегации коллаген, % 88,7±22,6 79,8±l7,9 0,045
Скорость агрегации коллаген, %/мин 7,3±8,4 6,2±7,4 0,353
В основе метода проточной цитометрии заложена высокоспецифичная реакция антиген-антитело, что, возможно, позволяет отражать ситуацию in vivo более адекватно, по сравнению с оптической агрегометрией.
В таблице 3 указаны значения экспрессии на тромбоците рецепторов к фибриногену в единицах интенсивности флуоресценции. Не наблюдалось достоверного изменения экспрессии рецепторов в обследуемой группе под влиянием приема препарата, что объясняется генетической детерминированностью количества рецепторов к фибриногену на тромбоците и малой чувствительностью к экзо- и эндогенным влияниям.
В таблице 4 приведены значения тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин. Наблюдалось достоверное уменьшение количества тромбоцитов, экспрессирующих Р-селектин после индукции АДФ по сравнению с исходным уровнем. Экспрессия Р-селектина является специфическим маркером активации тромбоцита, отражающим его конформационные изменения, поскольку в неактивированном состоянии Р-селектин депонирован в а-гранулах внутри тромбоцита [7].
Анализ экспрессии тромбоцитами Р-селек-тина, скорости АДФ-индуцированной агрегации и степени коллаген-индуцированной агрегации показал неодинаковую динамику среди
Таблица 3
Экспрессия рецепторов к фибриногену (IIb/IIIa) на тромбоците у обследованных пациентов
Время исследования Интенсивность флюоресценции
базальная стимулированная АДФ А, %
Исходно 6,9±0,8 7,6±0,9 8,5±4,5
Через 30 дней 7,0±0,8 7,6±0,8 7,5±4,4
р 0,423 0,756 0,7l7
Таблица 4
Экспрессия р-селектина на тромбоцитах у обследованных пациентов
Время исследования Экспрессия Р-селектина, %
базальная стимулированная АДФ А
Исходно 3,2±2,7 37,5±l4,2 90,6±9,2
Через 30 дней 2,9±2,2 32,0±l3,3 90,5±5,9
р 0,424 0,049 0,530
обследованных пациентов. Так, у 7 (28%) больных не наблюдалось уменьшения исследуемых показателей в динамике приема дипиридамола, у 2 (8%) пациентов уменьшение было меньше, чем 10% от исходного уровня, что можно рассматривать как отсутствие реакции на проводимую терапию. В настоящее время резистентность к дипиридамолу не имеет ясных клинико-лабораторных критериев. По данным литературы, агрегометрическое исследование у пациентов с транзиторными ишемическими атаками и ишемическим инсультом выявило резистентность к дипиридамолу у 56-59% больных [8]. В группе пациентов с ранними проявлениями церебральной дисциркуляции получены данные, позволяющие предположить резистентность к дипиридамолу у 36% обследованных.
Выводы
1. Назначение препаратов для первичной профилактики церебральных ишемических нарушений затруднено низкой приверженностью пациентов к лечению.
2. Наиболее чувствительными показателями антиагрегантной активности дипиридамола были скорость агрегации тромбоцитов под влиянием аденозиндифосфата, степень агрегации под влиянием коллагена, а также экспрессия Р-селектина на поверхности тромбоцитов после стимуляции аденозиндифосфатом.
3. Данное исследование позволяет говорить о резистентности к приему дипиридамола у 36% пациентов с патологической извитостью магистральных артерий головы в стадии начальных проявлений недостаточности мозгового кровообращения.
Литература
1. Суслина, З.А. Инсульт: диагностика, лечение, профилактика / З.А. Суслина, М.А. Пира-дов. - М.: МЕДпресс-информ, 2008. - 288 с.
2. Котов, С.В. Врожденная неполноценность соединительной ткани у взрослых больных с патологической извитостью сонных артерий / С.В. Котов, О.П. Сидорова, Н.М. Поплавская // Журн. невропатол. и психиат. им. С.С.Корсакова (приложение «Инсульт»). - 2007. - С. 225-226.
3. Верещагин, Н.В. Роль перегибов внутренних сонных и позвоночных артерий в возникновении тромбоза мозговых сосудов / Н.В. Верещагин, Г.Я. Левина, В.Г. Степанова // Архив патологии. - 1972. - № 6. - С. 28-33.
4. Dipyridamole synergizes with nitric oxide to prolong inhibition of thrombin-induced platelet shape change / B.O. Jensen [et al.] // Platelets. -2011. - Vol. 22, № 1. - P. 7-18.
5. Taming platelets with cyclic nucleotides / U.R. Schwarz [et al.] // Biochem. Pharmacol. -2001. - Vol. 62, №9. - Р. 1153-1161.
6. Smolenski, A. Novel roles of cAMP/cGMPdependent signaling in platelets / A. Smolenski // J.Thromb. Haemost. - 2012 - Vol. 10, № 2. -P. 167-176.
7. Harrison, P. Platelet a-granules / P. Harrison, E.M. Cramer // Blood Rev. - 1993. - Vol. 7, № 1. - P. 52-62.
8. Enhanced ex vivo inhibition of platelet function following addition of dipyridamole to aspirin after transient ischaemic attack or ischaemic stroke: first results from the TRinity AntiPlatelet responsiveness (TrAP) study / W.O. Tobin [et al.] // Br. J. Haematol. - 2011. - Vol. 152, № 5. - Р. 640-647.
В.В. Голдобин Тел.:+7-901-301-66-53 e-mail: [email protected]
