CC BY
794
Л Журнал фундаментальной медицины и биологии УДК 591.2.001.5(083.74)
Коробейникова Е.П., Комарова Е.Ф.
ОБЗОРЫ
ЛАБОРАТОРНЫЕ ЖИВОТНЫЕ - БИОМОДЕЛИ И ТЕСТ-СИСТЕМЫ
В ФУНДАМЕНТАЛЬНЫХ И ДОКЛИНИЧЕСКИХ ЭКСПЕРИМЕНТАХ В СООТВЕТСТВИИ СО СТАНДАРТАМИ НАДЛЕЖАЩЕЙ ЛАБОРАТОРНОЙ ПРАКТИКИ (НЛП/GLP)
Ростовский научно-исследовательский онкологический институт, Испытательный лабораторный центр Россия, 344037, г. Ростов на Дону, 14 линия, 63 E-mail: korobeynikovaep@gmail.com
Международная система норм и правил «Надлежащая лабораторная практика» (НЛП) регламентирует проведение исследований с использованием лабораторных животных (тест-систем). Тест-системы, а именно их выбор, качество и соблюдение принципов биоэтики при их использовании в этой системе являются ключевой позицией. Соблюдение правил НЛП обеспечивает приемлемость научных результатов исследования и повышает их ценность.
Ключевые слова: тест-системы, надлежащая лабораторная практика, биоэтика.
Korobeynikova E.P., Komarova E.F.
LABORATORY ANIMALS - BIOMODELS AND TEST SYSTEMS
IN FUNDAMENTAL AND PRECLINICAL EXPERIMENTS ACCORDING TO THE GOOD LABORATORY PRACTICE (GLP) STANDARDS
Rostov Research Institute of Oncology, Research Laboratory Center 63 14th liniya st., Rostov-on-Don, Russia, 344037 E-mail: korobeynikovaep@gmail.com
International system of norms and rules, Good Laboratory Practice (GLP) regulates researches involving laboratory animals (test systems). Test systems, and specifically their choice, quality and abidance by the principles of bioethics when using them in this system, are the key point. Adherence to the GLP guidelines provides acceptability of scientific research results and increases their value.
Key words: test systems, Good Laboratory Practice, bioethics.
Проведение исследований на животных — неотъемлемая часть работы современной лаборатории, будь то государственный университет или частная исследовательская компания. Назвать точные цифры сложно, но ежегодно приблизительно 100 млн млекопитающих привлекаются к экспериментам. Результаты
исследований именно на животных имеют решающее значение для заполнения пробелов в знаниях о здоровье и болезнях как человека, так и животных. Ряд исследований на животных привели к значимым результатам для диагностики и лечения заболеваний людей (табл. 1).
Таблица 1.
Результаты исследований с использованием различных лабораторных животных
Модельное животное Результат
Собака Открытие инсулина
Обезьяна Вакцина против полиомиелита
Мышь Вакцина против бешенства
Свинья Пересадка кожи для ожоговых больных
Свинья Сканирование компьютерной томографией
Кролик Трансплантация роговицы
Крыса Тестирование канцерогенов
К этому списку можно добавить создание антитоксической противодифтерийной сыворотки, сульфаниламидных препаратов, а также некоторые методы современной хирургии и многие другие достижения медицины. В свете множества ошибок в прогностической оценке безопасности лекарств, тесты по проверке безопасности лекарств на животных признаны лучшим способом оценки новых фармакологических препаратов.
По умолчанию нормой для исследователя в цивилизованном обществе является неукоснительное соблюдение этических норм и правил при проведении любых исследований с использованием животных. Это не только актуальный вопрос для общества, существующего в координатах гуманизма и общечеловеческих ценностей, но и требования стандарта GLP - правильной лабораторной практики.
Стандарт GLP («Good Laboratory Practice» Правильная Лабораторная Практика) — система норм, правил и указаний, направленных на обеспечение согласованности и достоверности результатов лабораторных исследований. Работает в комплексе со стандартами GMP и GCP. Этот свод правил и рекомендаций, состоящий из трёх стандартов, создан для обеспечения контроля качества фармацевтических препаратов на всех этапах их продвижения от разработчика к потребителю. Для того чтобы не только разрабатывать, но и проводить клинические испытания препаратов, а также производить новые лекарства (то есть осуществлять полный цикл разработки), необходимо соблюдение двух других стандартов — GСP (Good Clinical Practice/Надлежащая Клиническая Практика) и GMP (Good Manufacturing Practice/Над-лежащая Производственная Практика).
Система GLP разработана в США, действует уже более 20 лет и получила распространение в международном масштабе. Национальным аналогом GLP в РФ является ГОСТ Р 53434-2009
«Принципы надлежащей лабораторной практики», текст которого идентичен GLP.
Назначение Правил GLP — обеспечение приемлемости результатов научных исследований на этапе экспериментального изучения новых лекарственных препаратов. Под приемлемостью понимается, с одной стороны, доказательность и надежность данных, с другой — соблюдение принципов гуманного обращения с лабораторными животными.
Правила GLP включают в себя:
• требования к организации испытаний;
• требования к личному составу исследователей;
• требования к помещениям, в которых проводятся испытания и содержатся животные;
• требования к качеству животных, к условиям их содержания и кормления;
• требования к лабораторному оборудованию и его калибровке;
• требования к испытуемому и контрольному веществу;
• требования к составлению и проведению подробной стандартной методики экспериментальных работ и к порядку проведения испытаний;
• требования к регистрации данных и оформлению отчета;
• требования к службе контроля качества испытаний;
• стандартные методики экспериментальных работ.
Корректный выбор и этичное использование тест-систем, обеспечение прозрачности документации эксперимента и система контроля качества исследования составляют три основополагающих элемента, призванных обеспечить высокий уровень экспериментального исследования.
GCP — правила организации клинических испытаний новых лекарственных средств.
Назначение правил проведения клинических испытаний по GCP стандарту — обеспечить по-
лучение достоверных результатов эффективности нового лекарственного средства в клинике. Лекарственное средство допускается к клиническим испытаниям только после проведения лабораторных испытаний.
В правилах GCP изложены права больных и добровольцев:
• испытуемые должны быть информированы о том, что им вводится новый лекарственный препарат и о его свойствах;
• больные имеют право на финансовое вознаграждение;
• должен быть обеспечен контроль за ходом испытаний со стороны медиков.
В России наиболее распространён пока стандарт GMP — правила организации производства лекарственных средств и контроля их качества.
Это единая система требований к производству и контролю процесса производства лекарственного средства.
Лабораторные животные (или тест-системы) являются ключевой позицией, так как именно их выбор, качество и соблюдение принципов биоэтики при их использовании влияют на корректность результата всех последующих этапов. Термин «лабораторные животные» при всей своей очевидности требует определения.
К лабораторным животным относят специально разводимые виды в лабораториях, вивариях и питомниках с целью дальнейшего их использования в экспериментах.
В зарубежных странах существует четкая система, регулирующая правовые отношения в системе «исследователь — объект исследования» (табл. 2).
Таблица 2
Законодательные акты, регулирующие использование лабораторных животных в научных и учебных учреждениях стран Европы и Америки
Страна Закон Контролирующие органы и должностные лица
Германия Закон о защите животных 1972 г. ст. 5 и 6, улучшен в 1986 r.Animal Protection Law 1975, part 5 and 6. Академия наук Германии. Министерство пищевой промышленности, сельского и лесного хозяйства. Германский центр по развитию и валидации альтернатив экспериментам на животных (ZEBET).
Италия Закон о защите животных 1931 г., усовершенствован в 1941 г., 1992 г. Национальные правила. Animal protection Law 1931, amended 1941, 1992. Министерство здравоохранения и культуры. Надзор ведется местной медицинской и ветеринарной службой. Ответственность за эксперименты на животных возлагается на директоров институтов.
Канада Закон по исследованиям на животных 1971 г., улучшен в 1984 г., 1995 г. Отдельные провинции Канады имеют собственные законы о работе с лаб. животными. Animal for Research Act 1971. Специальные советы в учреждениях. Для выполнения институтами работ с использованием животных требуется согласие со стороны MRC (Медицинский научный совет) и NSERC (Совет в области научных и инженерных исследований).
Норвегия Закон о благосостоянии животных, 1974 г. Правила проведения биологических экспериментов на животных 1977 г. Welfare of Animals Act 1974; Regulations concerning Biological Experiments on Animals 1977. Министерство сельского хозяйства. Лицензия выдается директорам институтов. Индивидуальное лицензирование в исключительных случаях.
США Закон о благосостоянии животных, 1966 г. Дополнение о правилах использования экспериментальных животных 1986 г. The Animal Welfare Act 1966 Конгресс. Министерство сельского хозяйства (USDA). Служба инспекции здоровья животных и растений (APHIS). Академия наук. Министерство здравоохранения. Научный центр охраны животных США (SCAW). Институт ресурсов лаб. животных (ILAR). Национальный институт здоровья (NIH). Институт благополучия животных (AWI). Институт этики им. Кеннеди. Центр Дж. Хопкинса по альтернативам в экспериментах на животных (CAAT).
Финляндия Акт о защите лаб. животных 1977 г., акт 777/85 и акт 1076/86. Animal Welfare Act 1986. Департамент ветеринарной медицины. Министерство сельского и лесного хозяйства выдает лицензию.
В Российской Федерации в настоящее время нет Федерального закона, определяющего порядок проведения экспериментальной работы в учебных и научных целях с использованием лабораторных животных. ГОСТ Р 53434-2009 «Принципы надлежащей лабораторной практики», как и все ГОСТы, имеет статус рекомендательного документа, т.е. им предложено пользоваться, но он не обязателен к исполнению, в отличие от Федеральных законов. Однако, Россия подписала Хельсинскую декларацию о защите прав животных. Это значит, что условия содержания и использования экспериментальных животных в питомниках и научных учреждениях России должны соответствовать положениям этой декларации, и Россия признаёт необходимость строго придерживаться принципов гуманного отношения к животным как к объектам исследования
Основными условиями использования животных в эксперименте в соответствии со стандартом GLP являются научная методология, возможность применения принципа «трех R», оценка баланса между страданиями животных и важностью целей исследования. Этический аспект возникает неизбежно, так как в экспериментах на животных часто приходится применять методические приемы, недоступные и невозможные в исследованиях на человеке.
Впервые термин «биоэтика» возник в 1971 г. Его ввел Р. В. Поттер [1,2]. Но это не означает, что это понятие возникло в 70-е гг. Вопрос имеет свою историю, уходящую далеко вглубь времен, неразрывно и органично связанную с развитием экспериментальной биологии и медицины, поучительную и драматичную. Уже в XVII в. F. Magendie пишет первое руководство по экспериментальной физиологии в двух томах (1816-1817) [3]. Это был новый для того времени тип учебника по физиологии, ориентирующий исследователя на эксперимент. С тех пор эксперимент в биологии и медицине из прошлого до наших дней прошел путь от рассечения трупов животных, через вивисекцию в донаркозную эпоху, острый опыт в период, предшествующий внедрению асептики и антисептики, до хронического наблюдения за оперированными животными
В 1959 г. увидела свет книга У. Рассела и Р. Берча «The Principles of Humane Experimental Technique» [4]. В этой книге учёные мира опубликовали свой манифест, обосновывая необходимость гуманного использования животных в экспериментах. По существу, это был первый опыт приложения понятий этики к сугубо эмпирической сфере деятельности человека. У. Рассел и Р. Бэрч в том самом 1959 г. впервые ввели правило 3R, или концепцию 3R, имеющую непосредственное отношение к использованию животных по стандарту GLP. Справедливо будет сказать, что концепция 3R — основа GLP-стандарта в разделе, касающемся тест-систем. Вот эти 3R:
1. Replacement: выбор и замена;
2. Reduction: уменьшение количества животных в эксперименте;
3. Refinement: уменьшение дистресса, боли и страданий.
1. Replacement: выбор и замена
Замена высокоорганизованных видов животных более низкоорганизованными видами, замена экспериментов на животных альтернативными методами: экспериментами на культуре клеток и тканей (методы in vitro), работа с изолированными органами, физико-химическими и биохимическими системами, экспериментами на микроорганизмах и растительных объектах, компьютерными и математическими моделями.
Следует признать, что в настоящее время не существует технологий, способных заменить тесты на животных. Значит, пока для ряда исследований замена животных на культуры клеток, тканей, органов невозможна. Замена в опыте, когда это возможно, высокоорганизованных лабораторных животных менее развитыми живыми объектами — более реальная задача.
Например, замена млекопитающих животных рыбами. Большое количество исследований выполняют сейчас с использованием рыб, в частности, аквариумных рыбок семейства карповых данио ре-рио (Danio rerio, английское название Zebrafish).
Данио рерио относится к так называемым модельным организмам биологии развития. Благодаря простоте содержания, размножения, высокой скорости развития эмбриона она стала своего рода лабораторной белой мышью для ихтиологии.
Информация о существующих альтернативных методах регулярно публикуется во многих международных журналах, наиболее популярным из которых признан ATLA (Alternatives To Laboratory Animals). В настоящее время ведутся работы по разработке методов исследований, заменяющих животных в эксперименте.
Частичное замещение животных альтернативными моделями или полное исключение животных из экспериментов — вот суть периодически вспыхивающих в околонаучной среде дискуссий. Исследователи справедливо полагают, что не только исключение, но и простое ограничение использования лабораторных животных высокого качества (SPF, гнотобиоты) и необходимого разнообразия (инбредные, гетерогенные, трансгенные, нокаут-ные) не просто затормозит, но и попросту остановит прогресс в познании живых систем. Это создаст угрозу для безопасности человечества в условиях агрессии биологических, химических и физических факторов, ограничит возможности человека влиять на материальный мир.
Более того, принятый билль о безопасности лекарств [5] требует прямого сравнения безопасности лекарства в тестах на животных с батареями тестов, базирующихся на биологических основах человека.
GLP — стандарт в соответствии с Хельсинской декларацией запрещает использование в эксперименте животных, пойманных на воле [6]. Т.е. животных для лабораторных опытов разводят специальные организации и эти же компании поставляют животных в лаборатории.
Долгое время лабораторные крысы были одни из самых распространённых экспериментальных животных. Основанием являлся тот факт, что ге-
ном крысы имеет до 90% сходства с геномом Homo sapiens.
До сих пор существует мнение, что линии крыс с определёнными заболеваниями служат хорошими моделями для изучения механизма болезни, развития и тестирования новых лекарственных препаратов. Линии дали возможность проводить ряд прежде недоступных исследований. Для решения конкретных задач было выведено около двух сотен линий крыс. Например, линия крыс со спонтанной гипертонией (spontaneously hypertensive rats, SHR), известная с 1960-х гг., линия крыс-эпилептиков, животных, отличающихся повышенной возбудимостью нервной системы и слабой активностью тормозных нейронов. В попытках создать валидные модели для изучения различных патологических процессов было создано разнообразие линий крыс, поскольку в фундаментальных исследованиях важными являются проблемы валидности моделей. Крыса не является идеальным модельным организмом. У крыс гораздо сильнее, чем у человека развита система утилизации токсинов, защита организма от ядов. Эти животные часто нечувствительны к ядам и быстро развивают устойчивость к новым токсичным веществам. Именно поэтому лекарства, признанные безопасными в опытах на крысах, нуждаются в дальнейшем тестировании на других видах, а затем уже на человеке.
С середины 70-х гг. прошлого столетия популярность лабораторной крысы стала уступать место мышам.
Лабораторные мыши как объект существуют так же, как и крысы во множестве линий. Сегодня существует к тому же несколько сотен линий мышей, генетически модифицированных с использованием методики генетического нокаута, т.е. когда ген блокирован или вживлён новый ген. Так были получены АПП трансгенные мыши. Аббревиатура АПП происходит от «амилоидного предшественника протеина». Этот предшественник даёт начало белку, который служит причиной болезни
Альцгеймера. АПП трансгенным мышам вживлён ген болезни Альцгеймера, полученный от шведской семьи, страдающей этим недугом. У трансгенных мышей этой линии нарушены нейрональные функции, животные страдают от недостатка памяти, плохо приспосабливаются к новым условиям, зато служат хорошей моделью для изучения склероза и тестирования лекарств, укрепляющих память. Экспериментаторы вынуждены признать, что модель не может быть полностью валидна, однако, именно использование линейных животных в экспериментах позволяет решить задачу второго «R».
2. Reduction - уменьшение количества животных в эксперименте без ущерба для качества исследования
Для решения этой задачи важен адекватный выбор лабораторных животных; оптимальное планирование и, что крайне важно, использование статистических методов не только при обработке полученных данных, но и на стадии планирования.
Одним из наиболее надежных путей снижения количества животных, используемых в экспериментах, является дальнейшее развитие и осуществление стандартизации лабораторных животных по генотипу, микрофлоре и экологическим параметрам. Примером такого подхода как раз и является использование линейных животных — животных, стандартизованных по генотипу. Провести стандартизацию животных по микрофлоре позволяет использование линейных животных SPF статуса — животных, свободных от патогенной флоры. Это способствует уменьшению неконтролируемых артефактов.
FELASA — некоммерческое партнёрство «Объединение специалистов по работе с лабораторными животными» — разработало и предложило перечень патогенов лабораторных мышей и крыс, которые надо контролировать при содержании животных в вивариях (табл. 3, 4).
Таблица 3
Список патогенов для мышей (FELASA)
Ежеквартальный мониторинг Дополнительно 1 раз в год
Вирусы - Mouse hepatitis virus; - Mouse rotavirus (EDIM); - Mouse norovirus; - Parvovirus: Minute virus of mice; - Parvovirus: Mouse parvovirus; - Theiler's murine encephalomyelitis virus - Lymphocytic choriomeningitis virus; - Mouse adenovirus type 1 (FL); - Mouse adenovirus type 2 (K87); - Ectromelia virus; - Pneumonia virus of mice; - Reovirus type 3; - Sendai virus
Бактерии - Helicobacter spp.; - Pasteurella pneumotropica; - Streptococci b-haemolytic (not group D); - Streptococcus pneumoniae - Citrobacter rodentium; - Clostridium piliforme (Tyzzer's disease); - Corynebacterium kutscheri; - Mycoplasma pulmonis; - Salmonella spp.; - Streptobacillus moniliformis
Эндопаразиты
Эктопаразиты
Таблица 4
Список патогенов для крыс (FELASA)
Ежеквартальный мониторинг Дополнительно 1 раз в год
Вирусы - Parvovirus: Kilham rat virus; - Parvovirus: Rat parvovirus; - Toolan's H-1 virus; - Pneumonia virus of mice; - Sialodacryoadenitis/Rat Coronavirus; - Rat theilovirus - Hantaviruses; - Mouse adenovirus type 1 (FL); - Mouse adenovirus type 2 (K87); - Reovirus type 3 - Sendai virus
Бактерии - Clostridium piliforme (Tyzzer's disease); - Helicobacter spp.; - Mycoplasma pulmonis; - Pasteurella pneumotropica; - Streptococci b-haemolytic (not group D); - Streptococcus pneumoniae - Cilia-associated respiratory bacillus; - Pneumocystis spp.; - Salmonella spp.; - Streptobacillus moniliformis
Эндопаразиты
Эктопаразиты
Стандартизация по экологическим параметрам означает использование стандартизованных кормов, контроль чистоты воды и содержания вредных примесей в воздухе вивария. Поддержание оптимальных параметров среды обитания лабораторного животного уменьшает стрессирование животного. Все эти мероприятия уменьшают количество переменных факторов и способствуют получению более надежных результатов на меньшем количестве животных.
3. Refinement: уменьшение дистресса, боли и страданий
Кроме улучшения условий содержания лабораторных животных это, прежде всего, уменьшение дистресса животных во время экспериментов и применение обезболивающих средств, но не в ущерб цели эксперимента. С точки зрения внешних проявлений и физиологии, животные реагируют на непереносимые боль и дискомфорт так же, как и люди. Концепция исследования боли на животных включает в себя представления о том, что животное не должно подвергаться боли в большей степени, чем может выдержать человек.
Очень важное место в GLP стандарте отведено контролю за использованием лабораторных животных. Функции контроля возложены на службу качества.
Службе качества в системе GLP отведено заметное место. Основные направления работы службы качества применительно к тест-системам можно обозначить как проверку следующих ключевых позиций:
• наличие утвержденного плана исследования и содержания в нем информации, необходимой для соблюдения принципов надлежащей лабораторной практики;
• наличие стандартных операционных процедур (СОП), перечисленных в протоколе исследования, необходимых для проведения данного исследования, в общем перечне СОП организации;
• наличие протокола биоэтической комиссии (БЭК) по данному исследованию;
• соответствие условий содержания животных «Руководству по содержанию и использованию лабораторных животных» и российским документам [7-9];
• наличие ветеринарного свидетельства на партию животных для проведения исследования по данному протоколу; Наличие СОП на рабочих местах и выполнение процедур и манипуляций в соответствии с СОП.
Таким образом, содержание и использование тест - систем для фундаментальных и доклинических исследований в соответствии со стандартом GLP — непростая задача, требующая для своего решения комплексного подхода. Однако, получить возможность работы с разнообразными экспериментальными моделями различных патологий, возможность использовать тест-системы, полученные из питомников мирового уровня, получать новые знания, которые будут признаны международным научным сообществом и принесут пользу значит внести достойный вклад в фундаментальные и прикладные исследования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Potter Van Rensselaer. Bioethics: Bridge to the future. Englewood Cliffs // N. J. Prentice-Halb - 1971. - 196 p.
2. Поттер В.Р. Биоэтика: мост в будущее. - К., 2002. - 216 с.
3. Magendie F. «Precis élémentaire де Physiologie». 2 тт.- Париж: Méquignon-Марвис.- 1816-1817.- 475 с. [Электронный ресурс] Режим доступа https://archive.org/details/ prcislment002mage
4. Russell W.M.S. The Principles of Humane Experimental Technique / Russell W.M.S. and Burch R.L.. // Methuen, London, 1959.- 238 p.
5. The Safety of Medicines (Evaluation) Bill, 2009 [Электронный ресурс] Режим доступа: http://www.publications.parliament. uk/pa/cm200809/cmbills/050/08050.i-i.html
6. European convention for the protection of vertebrate animals used for experimental and other scientific Strasbourg,
18.III. 1986. [Электронный ресурс] Режим доступа: https:// rm.coe.int/CoERMPublicCommonSearchServices/DisplayDCT MContent?documentId=090000168007a67b
7. Guide for the care and use of laboratory animals. National Academy press. - Washington, D.C. 1996. - 137 p.
8. Санитарно-эпидемиологические требования к устройству, оборудованию и содержанию экспериментально-биологических клиник (вивариев): постановление Главного государственного санитарного врача Российской Федерации от 29 августа 2014 г. N 51 // Рос. газ. - 2015.- 6 февр. -N 24/1 (специальный выпуск).
9. Об утверждении Правил лабораторной практики: приказ Минздравсоцразвития РФ от 23.08.2010 № 708н // Рос. газ. -2010.-22 окт.
ПОСТУПИЛА: 22.01.2016
