CC BY
24
RUSSIAN CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS. 2020; 65(6) DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-6-368-374
MICROBIOLOGY
МИКРОБИОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2020
Макарова М. А.1,2, Матвеева З. Н.1, Смирнова Е. В.3, Семченкова Л. И.3, Деревянченко И. А.3, Сокольник С. Е.4, Жирнова Л. Ю.4, Котова Н. К.4, Пеленко Т. Ф.4, Дудников Д. С.4, Васильева Н. В.25, Кафтырева Л. А.12
ЛАБОРАТОРНЫЕ ОШИБКИ ИДЕНТИФИКАЦИИ ШТАММОВ ESCHERICHIA COLI
СЕРОЛОГИЧЕСКИХ ГРУПП О6 И О25 КАК ВОЗБУДИТЕЛЕЙ ОСТРЫХ КИШЕЧНЫХ ИНФЕКЦИЙ 6 25
1ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера Роспотребнадзора, 197101, Санкт-Петербург, Россия; 2ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И.И. Мечникова Минздрава РФ, кафедра медицинской микробиологии, 191015, Санкт-Петербург, Россия;
3ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Санкт-Петербург», филиал № 3, 192012, Санкт-Петербург, Россия; 4ФБУЗ «Центр гигиены и эпидемиологии в городе Санкт-Петербург», филиал № 6, 198329, Санкт-Петербург, Россия; 5ФГБОУ ВО СЗГМУ им. И. И. Мечникова Минздрава РФ, НИИ медицинской микологии им. П.Н. Кашкина, 194291, Санкт-Петербург, Россия
Изучены гены, кодирующие факторы вирулентности 221 штамма: E. coli О6:Н1 (194) и E. coli О25:Н4 (27), выделенных в 2014-2018 г.г. из проб испражнений детей и взрослых, обследованных по эпидемическим показаниям. Молекулярные методы включали ПЦР с гибридизационно-флуоресцентной и с электрофоретической детекцией продуктов амплификации. Штаммы не имели генов вирулентности диареегенных E. coli (DEC) патогрупп EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, EAggEC, принадлежали к филогенетической группе В2. Содержали от четырёх до восьми генов, кодирующих факторы вирулентности ExPEC - возбудителей внекишечныхзаболеваний: E. coli О6:Н1 -рар (68,6%), sfa (87,6%), fimH (96,4%), hly (62,4%), cnf (74,7%), iutA (97,9%), fyuA (95,9%), chu (100%); E. coli О25:Н4 - рар (66,7%), afa (22,2%), fimH (100%), hly (44,4%), cnf (44,4%), iutA (100%), fyuA (100%), chu (100%). Определение чувствительность кв-лактамам, фторхинолонам, аминогли-козидам, нитрофурантоину, сульфаниламиду, триметоприм/сульфаметоксазолу - в соответствии КР 2018. Чувствительны к АМП 60,3% E. coli О6:Н,, штаммы E. coli О25:Н4 сохраняли чувствительность к карбапенемам и нитрофуранам. Резистентность к цефалоспоринам расширенного спектра обусловлена продукцией БЛРС (CTX-M). MDR фенотипом характеризовались 57,1%% резистентных штаммов E. coli О6:Н1 и 100% штаммов E. coli 025:Н. Фенотип XDR имел каждый пятый MDR штамм E. coli О'Н, и E. coli 0'Н. Все штаммы E. coli О'Н. относились к ST131. Учитывая
6 1 25 4 25 4
важную роль E. coli в патологии человека, детекцию генов вирулентности следует проводить для подтверждения этиологической значимости, выделенного штамма.
Ключевые слова: E. coli О^Н; О25:Н4; гены вирулентности; резистентность; сиквенс-тип 131.
Для цитирования: Макарова М. А., Матвеева З. Н., СмирноваЕ. В., Семченкова Л. И., Деревянченко И. А., Сокольник С. Е., Жирнова Л. Ю., Котова Н. К., Пеленко Т. Ф., Дудников Д. С., Васильева Н. В., Кафтырева Л. А. Лабораторные ошибки идентификации штаммов Escherichia coli серологических групп О6 и О25 как возбудителей острых кишечных инфекций. Клиническая лабораторная диагностика. 2020; 65 (6): 368-374. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-6-368-374
MakarovaM. A.12, Matveeva Z. N.1, SmirnovaE. V.3, SemchenkovaL. I.3, DerevianchenkoI. A.3, Sokol'nikS.E.4, ZchirnovaL.Y.4, Kotova N.K.4, Pelenko T.V.4, Dudnikov D.S.4, Vasilyeva N.V.25, Kaftyreva L. A.12,
LABORATORY ERRORS FOR IDENTIFICATION OF THE ESCHERICHIA COLI STRAINS OF THE SEROLOGICAL GROUPS O, AND O„ AS ACUTE INTESTINAL INFECTIONS
6 25
1Saint-Petersburg Pasteur Institute, 197101, Saint-Petersburg, Russia;
2North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov, the medical microbiology department, 191015, Saint-Petersburg, Russia;
3FBUZ «Center for Hygiene and Epidemiology in St. Petersburg», division № 3, 192012, Saint-Petersburg, Russia; 4FBUZ «Center for Hygiene and Epidemiology in St. Petersburg», division № 6, 198329, Saint-Petersburg, Russia; 5North-Western State Medical University named after I. I. Mechnikov, Kashkin Research Institute of Medical Mycology, 194291, Saint-Petersburg, Russia
Were studied the genes encoding the virulence factors of 221 strains: E. coli O6:H1 (194) and E. coli O25:H4 (27), isolated in 20142018 from stool samples of children and adults examined according to epidemic indications. Molecular methods included PCR with hybridization-fluorescence and electrophoresis detection of amplified products. The strains did not have virulence genes for diarrheagenic E. coli (DEC) pathogroups EPEC, ETEC, EIEC, EHEC, EAggEC, and belonged to the phylogenetic group B2. They contained from four to eight genes encoding virulence factors of ExPEC: E. coli O6:H1 - pap (68,6%), sfa (87,6%), fimH (96,4%), hly (62,4%), cnf (74,7%), iutA (97,9%), fyuA (95,9%), chu (100%); E. coli O2S:H4-pap (66,7%), afa (22,2%), fimH (100%), hly (44,4%), cnf (44,4%), iutA (100%) ,fyuA (100%), chu (100%). The antimicrobia4.susceptibility testing to 6classes of antimicrobials (beta-lactams, fluoroquinolones, aminoglycosides, nitrofurantoin, sulfanilamide, trimethoprim / sulfamethoxazole)
Для корреспонденции: Макарова Мария Александровна, канд. мед. наук, ст. науч. сотр. лаб. идентификации патогенов; [email protected]
МИКРОБИОЛОГИЯ
according the EUCAST. 60,3% of E. coli O6:H1 were .sensitive to antibiotics, E. coli O25:H4 remained .sensitive to carbapenems and nitrofurans. Extended-spectrum cephalosporins resistance was due to the production ESBL (CTX-M). The 57,1°% resistant strains of E. coli O6:H1 and 100% of E. coli O25:H4 strains belonged to the MDR phenotype. The XDR phenotype had one in five MDR strains of E. coli O6:H1 andE. coli O25:H. All strains of E. coli O25:H4 belonged to ST131. Given the important role of E. coli in human pathology, detection of virulence genes should be performed to confirm the etiological significance of the isolated strain.
Keywords: E.coli O6:H1; O25:H4, virulence genes, resistance, sequins-type 131.
For citation: MakarovaM. A., Matveeva Z. N., SmirnovaE. V., SemchenkovaL. I., DerevianchenkoI. A., Sokol'nikS.E., Zchirnova L.Y., Kotova N.K., Pelenko T.V., Dudnikov D.S., Vasilyeva N.V., Kaftyreva L. A Laboratory errors for identification of the escherichia coli strains of the serological groups O6 and O25 as acute intestinal infections. Klinicheskaya Laboratornaya Di-agnostika (Russian Clinical Laboratory Diagnostics). 2020; 65 (6): 368-374 (in Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0869-2084-2020-65-6-368-374
For correspondence: Makarova M.A., PhD, senior researcher of laboratory of identification of pathogen of Saint-Petersburg Pasteur Institute; e-mail: [email protected]
Information about authors:
Makarova Mariia A., https://orcid.org/0000-0002-7589-0234;
Kaftyreva Lidiya A., https://orcid.org/0000-0003-0989-1404; ResearcherlD: K-2708-2014 Matveeva Zoya N., https://orcid.org/0000-0002-7173-2255;
Vasilyeva Natalia V., http://orcid.org/0000-0002-6951-6596; ResearcherlD: P-1132-2014 Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest. Acknowledgment. The study had no sponsorship.
Received 10.04.2020 Accepted 13.04.2020
Введение. Escherihia coli - облигатные синантропные микроорганизмы желудочно-кишечного тракта человека и животных. Высокая пластичность генома E. coli создает потенциал для появления штаммов, способных вызывать широкий спектр заболеваний человека кишечной и внекишечной локализации. Как возбудители острых кишечных инфекций (ОКИ), в зависимости от наличия генов вирулентности, кодирующих определённые факторы патогенности, диареегенные E. coli (DEC) разделены на шесть патогрупп (ЕРЕС - энтеропатогенные, ЕТЕС - энтеротоксигенные, ЕНЕС - энтерогеморрагические, EIEC - энтероинвазивные, EAggEC - энтероаггрега-тивные, DAEC - диффузно-адгерентные) [1, 2]. Описаны ещё две патогруппы адгезивно-инвазивные E. coli (AIEC), которые часто выделяют из проб испражнений при болезни Крона и шига-токсин (ST) продуцирующие энтероаггрегативные E. coli (STEAEC) [3]. Штаммы каждой патогруппы DEC характеризуются конкретными патогенетическими механизмами, обеспечивающими развитие воспалительного процесса в разных отделах кишечника человека, клинически проявляющегося диа-рейным синдромом [4]. E. coli, вызывающие заболевания внекишечной локализации, выделены в отдельную патогруппу экстраинтестинальных E. coli (ExPEC), которые объединяют три патотипа: уропатогенные (UPEC), вызывающие инфекции мочевыводящих путей (ИМП), менингиальные (NMEC), вызывающие менингит новорожденных, септицемические (SEPEC), вызывающие бактериемию и сепсис [5]. UPEC являются ведущими возбудителями заболеваний мочевыводящих путей во многих странах, имеют широкое распространение при инфекциях, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП) [6, 7]. Развитие резистентности у возбудителей инфекционных заболеваний к клинически значимым АМП (антимикробные препараты) является глобальной проблемой современности. В 2014 г. в докладе ВОЗ особое значение уделено семи видам бактерий (включая E. coli), которые вызывают жизнеугрожающие заболевания, такие как сепсис, диарея, пневмония, ИМП и др. [8]. В 2017 г. ВОЗ опубликовала список 12 «приоритетных»
патогенов, устойчивых к АМП, представляющих наибольшую угрозу для здоровья человека. Особое значение имеют грамотрицательные бактерии, характеризующиеся сочетанной устойчивостью к нескольким клинически значимым классам АМП. Штаммы E. coli с множественной устойчивостью по потребности в создании новых АМП отнесены к группе микроорганизмов с критически высоким уровнем приоритетности [9].
Штаммы E. coli О6 и О25 по антигенной структуре представляют гетерогенные серологические группы, представленные десятью и более серологическими вариантами. В зависимости от набора генов, кодирующих факторы патогенности, штаммы E. coli О6 и О25 могут относиться к DEC и ExPEC [10, 11]. Как возбудители ОКИ E. coli О6 и О25 принадлежат к патогрупе ETEC [12].
Основным фактором вирулентности ETEC является продукция энтеротоксинов - термостабильного (ST) и термолабильного (LT), вызывающих нарушение электролитного баланса в клетках кишечного эпителия, приводящее к острой профузной водянистой диарее [4, 13, 14].
В отношении E. coli серогрупп: О4, О6, О О75, О114, О162 имеются сведения о равной частоте их обнаружения в пробах испражнений у больных и здоровых детей, что вызывает сомнение в этиологической значимости этих микроорганизмов как возбудителей ОКИ [14]. Доказано, что штаммы E. coli с антигенной структурой О6:К13:Н16 и О6:К13:Н31 вызывают диареи у детей. Тем не менее, суждение об этиологическом значении E. coli О6, как возбудителе ОКИ на основании принадлежности к О6 серогруппе затруднено, так как они относятся к наиболее распространённым представителям нормобиоты кишечника человека [14]. Актуальна проблема переоценки роли некоторых серологических вариантов E. coli в этиологии ОКИ, отражающая недостаточную эффективность применения современного спектра методов этиологической диагностики в бактериологических диагностических лабораториях.
Цель исследования - оценка патогенного потенциала штаммов E. coli О6 и О25, как возбудителей ОКИ, чувствительности к АМП с позиций современных критериев интерпретации резистентности.
MICROBIOLOGY
Материал и методы. Изучен 221 штамм E. coli серо-групп О6 (194 штамма) и О25 (27 штаммов), выделенные из проб испражнений детей и взрослых, обследованных по эпидемическим показаниям (контактные в очагах ОКИ, декретированные лица). Выделение E. coli О6 и О25 проводили культуральным методом, видовая идентификация штаммов включала определение ферментативных свойств (пробирочные тесты) и серогруппы (в реакции агглютинации с диагностическими эшерихиозными ОК -поливалентными и типовыми сыворотками (ЗАО «ЭКО-лаб», Россия). В ФБУН НИИ эпидемиологии и микробиологии имени Пастера штаммы реидентифицированы: видовая идентификация - методом матрично-ассоцииро-ванной лазерной десорбции/ионизации - времяпролёт-ной масс-спектрометрии (MALDI-ToF MS) с использованием системы Microflex LT и программного обеспечения MALDI Biotyper v.30 (Bruker Daltonics, Германия). Рекомендуемые значения «Score» >2,2 использованы в качестве критерия надёжной видовой идентификации. Молекулярные методы включали ПЦР с гибридизаци-онно-флуоресцентной (ПЦР-РВ) и с электрофоретиче-ской детекцией продуктов амплификации (ПЦР-ЭФ). Детекцию генов, кодирующих факторы вирулентности DEC, проводили методом ПЦР-РВ с набором реагентов «АмплиСенс® Эшерихиозы-FL» (ФБУН Центральный НИИ эпидемиологии, Россия). Молекулярное сероти-пирование (детекция генов rfb и fliC, кодирующих О и Н антигены E. coli О6 и О25), филогенетическое типиро-вание (детекция генов, определяющих принадлежность штаммов к филогенетической группе), амплификацию генов ExPEC, кодирующих продукцию адгезинов (fimH, sfa, afa, pap), токсинов (hly, cnf), инвазинов (ibeA), сиде-рофоров (iutA, fyuA, chuA), генов ß-лактамаз, скрининг пандемического клона E. coli О25:Н4В2 ST131 проводили методом ПЦР-ЭФ, используя опубликованные праймеры [16-21]. Синтез ПЦР-праймеров выполнен ЗАО «Евро-ген», Россия. Экстракцию ДНК для всех молекулярных методов проводили набором «InstaGeneTMMatrix» (BioRad, США). Чувствительность к ß-лактамам, фторхино-лонам, аминогликозидам, нитрофурантоину, сульфаниламиду, триметоприм/сульфаметоксазолу определяли диско-диффузионным методом (ДДМ), используя диски и агар Мюллера-Хинтон (Oxoid, Великобритания). Интерпретацию результатов проводили в соответствии КР 2018 г. [22]. Для характеристики штаммов использовали общепринятые показатели «чувствительные», «умеренно резистентные», «резистентные», «нечувствительные»; к последней - отнесены «умеренно резистентные» и «резистентные» штаммы. Для выявления продукции БЛРС (ß-лактамазы расширенного спектра) использован метод «двойных дисков» с цефтазидимом, цефотаксимом и амоксиклавом [23]. В соответствии с международными критериями, к фенотипу множественной резистентности (MDR) отнесены штаммы, устойчивые к трём категориям АМП, включая всех продуцентов БЛРС и карбапенемаз, фенотипом экстремальной резистентности (XDR) - характеризовали штаммы E. coli - устойчивые ко всем препаратам, за исключением одной или двух категорий АМП [24, 25]. Статистическую обработку результатов проводили с использованием оценки различий средних величин (критерий Фишера). Статистически значимыми считали различия при доверительном интервале 95% (р<0,05).
Результаты. Реидентификация штаммов E. coli О6 и О25. Культуральные, ферментативные и антигенные свойства подтвердили принадлежность всех штаммов к
виду E. coli и серогруппам: О6 и О25. Все штаммы типично росли на дифференциально-диагностических средах в виде лактозоположительных колоний, характеризовались подвижностью (диффузное помутнение 0,3% питательного агара). Методом MALDI-ToF штаммы идентифицированы как E. coli. Штаммы E. coli О25 агглютинировались ОК поливалентными ОКА и ОКД сыворотками, ОК- моновалентной сывороткой и иммуноглобулином, содержащим антитела к ОК антигенам E. coli О25:К11 и моновалентной О сывороткой, содержащей антитела к антигену О25. Штаммы E. coli О, давали выраженную агглютинацию с моновалентной ОК сывороткой и иммуноглобулином, моновалентной О сывороткой к антигену О6. Определение О антигенов E. coli серогрупп О6 и О25 не представляла сложностей.
Молекулярное серотипирование штаммов E. coli О6 и O25. Все E. coli О6 содержали ген rfb6, кодирующий синтез О6 антигена и ген fliC 1, кодирующий синтез антигена Н1, что подтверждало их принадлежность к серо-группе О6, серовару О6:Н1. У всех штаммов E. coli О25 выявлены гены rfb25 и fliC4 наличие которых подтверждало принадлежность их к серогруппе О25 и серовару
°2УН4.
Детекция генов вирулентности патогрупп DEC -возбудителей ОКИ. Ни один из изученных штаммов E. coli О6:Н1 и О25:Н4 не имел детерминант вирулентности известных патогрупп (EPEC, ETEC, EHEC, EIEC, EAggEC) DEC. Отсутствие генов, кодирующих вирулентность DEC, свидетельствует о том, что штаммы не являются возбудителями ОКИ.
Детекция генов, кодирующих факторы вирулентности ExPEC. Тестирование штаммов E. coli О6:Н1 и О25:Н4 на наличие 10 генов, кодирующих факторы вирулентности ExPEC, выявило девять генов, кодирующих адгезию (гены: pap, fimH, sfa, afa), продукцию токсинов (гены: hlyA, cnf), сидерофоров (гены: fyuA, chu, iutA), характерных для штаммов E. coli — возбудителей вне-кишечных заболеваний, в частности, ИМП. Ген (ibeA), кодирующий фактор инвазии SEPEC и NMEC не выявлен ни у одного из изученных штаммов. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов представлена в табл. 1.
Филогенетический анализ показал принадлежность штаммов E. coli О6:Н1 и О25:Н4 к филогенетической группе В2 (содержат гены chuA, jyaA, TspE4.C2), к которой относятся практически все ExPEC [26].
Анализ генов, ответственных за синтез адгезинов показал, что практически все штаммы E. coli О6:Н1 и 025:Н4 содержат ген fimH, кодирующий маннозочувствитель-ные фимбрии тип 1 (96,4 и 100%, соответственно). Более половины штаммов содержат ген pap, кодирующий пиелонефрит-ассоциированные пили (68,6 и 66,7%, соответственно), ген sfa, кодирующий S-фимбрии содержат только E. coli О6:Н1 (87,6%). Ген afa, кодирующий афимбриальные адгезины найден только у штаммов E. coli 025:Н4 (22,2%), которые в комбинации с фимбри-альными адгезинами усиливают колонизационный потенциал возбудителя. Ген cnf, кодирующий продукцию цитонекротического фактора, достоверно чаще встречается у штаммов E. coli О6:Н1 (74,7%), по сравнению со штаммами E. coli 025:Н4 (44,4%), ген hly, кодирующий продукцию а-гемолизина, встречался у 62,4% и 44,4% штаммов, изучаемых сероваров. Гены, ассоциированные с персистенцией возбудителя в организме человека (сидерофоры), кодирующие синтез компонентов усвое-
МИКРОБИОЛОГИЯ
Таблица 1
Гены вирулентности E. coli О6:Н1 и O :Н4
Факторы вирулентности Гены n=194 95% ДИ n=27 95% ДИ
абс. % абс. %
Адгезия fimH 187 96,4 92,7-98,5 27 100 87,2-100
sfa 170 87,6 82,2-91,9 0 0,0 0-12,8
afa 0 0,0 0-1,9 6 22,2 8,6-42,3
pap 133 68,6 61,5-75,0 18 66,7 46,0-83,5
Токсины hly 121 62,4 55,2-69,2 12 44,4 25,5-64,7
cnf 145 74,7 68,0-80,7 12 44,4 25,5-64,7
Система усвоения Fe iutA 190 97,9 94,8-99,4 27 100 87,2-100
fyuA 186 95,9 92,0-98,2 27 100 87,2-100
chu 194 100 98,1-100 27 100 87,2-100
Таблица 2
Штаммы E. coli О6:Н1 и E. coli O :Н4 нечувствительные к АМП
АМП 06:Hj , n=194 О5Н «=27
абс. % 95% ДИ абс. % 95% ДИ
Ампициллин 70 36,1 29,3-43,3 27 100 87,2-100
Амоксиклав 26 13,4 8,9-19,0 18 66,7 46,0-83,5
Цефтазидим 26 13,4 8,9-19,0 15 55,6 35,3-74,5
Цефотаксим 30 15,5 10,7-21,3 24 88,9 70,8-97,7
Цефепим 26 13,4 8,9-19,0 21 77,8 57,7-91,4
Меропенем 0 0 0-1,9 0 0 0-12,8
Налидиксовая кислота 12 6,2 3,2-10,6 21 77,8 57,7-91,4
Ципрофлоксацин 5 2,6 0,8-5,9 21 77,8 57,7-91,4
Гентамицин 9 4,6 2,1-8,6 9 33,3 16,5-53,9
Амикацин 4 2,0 0,6-5,2 6 22,2 8,6-42,3
Нитрофурантоин 0 0 0-1,9 0 0 0-12,8
Ко-тримоксазол 14 7,2 4-11,8 12 44,4 25,5-64,7
ния железа, такие как: iutA, fyuA (аэробактин, иерсине-бактин), chu (гемин) содержат практически все штаммы E. coli О6:Ц (95,9-100%) и O25:H4 (100%).
Популяции E. coli О6:Н1 и E. coli O25:H4 гетерогенны по набору генов вирулентности. Штаммы E. coli О6:Н1 содержат от четырёх до восьми генов: 7,2% (14 штаммов) содержат четыре гена, 24 (12,4%) - пять генов, 30 (15,5%) - шесть генов, 48 (24,7%) - семь генов и 78 (40,2%), соответственно. Суммарно более 80% штаммов содержат от шести до восьми генов вирулентности. В популяции E. coli 025:Н4 44,4% (12 штаммов) содержат четыре гена, 12 штаммов (44,4%) - шесть генов, 3 штамма (11,2%) - семь генов вирулентности.
Чувствительность штаммов E. coli О6:Н1 и E. coli O25:H4 к АМП. 60,3% штаммов E. coli О6:Н чувствительны ко всем тестируемым АМП, в отличие от E. coli O25:H4 среди которых сохранялась чувствительность только к карбапенемам (мерепенему) и нитрофуранам. Статистически значимо чаще резистентность к тестируемым АМП встречалась у штаммов E. coli O25:H4 (табл. 2). Среди изученных E. coli О6:Нр наибольшая доля чувствительных штаммов отмечена к амикацину и ципроф-локсацину (2,0 и 2,6% нечувствительных штаммов, соответственно), среди E. coli O25:H4 - к аминогликозидам (амикацину - 77,8%, гентамицину - 66,7%).
Устойчивость к ß-лактамам встречалась практически у всех изученных нечувствительных штаммов. Наибо-
лее выражена она к аминопенициллинам - 90,9% E. coli 06:Hj и 100% E. coli O :H4. Резистентность к амоксикла-ву отмечена у 13,4% E. coli О6:Н1 и 66,7% E. coli 025:Н4. Цефалоспорины (ЦРС) III-IV поколения (цефтазидим, цефотаксим, цефепим) характеризовались активностью в отношении более 80% штаммов E. coli О6:Н1. Среди штаммов E. coli O2.:H4 резистентность к ЦРС варьировала от 55,6% к цефтазидиму, 77,8% к цефепиму, 88,9% к цефотаксиму. Положительный тест с клавулановой
кислотой выявлен у 57,1% E. coli О'Н, и 100% E. coli
6 1
O25:H4, что свидетельствовует о продукции этими штаммами БЛРС. У всех БЛРС продуцирующих штаммов, детектированы bla гены группы CTX-M. У штаммов E. coli 06:Hj гены blaCTX-M принадлежат к трём кластерам. Наиболее распространены гены кластера blaCTX-M1 (79,5%), реже выявляются blaCTX-M9 (13,6%) и blaCTX-M8 (6,9%). У штаммов E. coli 025:Н4 гены blaCTX M принадлежат к одному кластеру blaCTX_M1.
К MDR фенотипу, в соответствии с международными критериями относились 57,1% (44 из 77) резистентных штаммов E. coli 06:Hj и 100% штаммов E. coli 02^:Н4 (27 штаммов). Фенотип XDR имеет каждый пятый MDR штамм E. coli О6:Н1 и E. coli 025:Н4 [24].
Выявление эпиоемически значимого ST131. В ПЦР-ЭФ в мультиплексном формате у всех штаммов E. coli 025:Н4 выявлены гены (pabBspe, trpA), специфически принадлежащие к клону 025ST131 [21].
MICROBIOLOGY
Обсуждение. E. coli относится к широко распространённым в природе микроорганизмам. Вид объединяет обширную группу бактерий близких по биологическим свойствам, тем не менее, насчитывается большое число штаммов (разновидностей), отличающихся по ферментативным, антигенным свойствам, чувствительности к бактериофагам и АМП, патогенности для человека. Инфекционные заболевания, вызванные E. coli, характеризуются полиморфизмом клинических проявлений, что обусловлено наличием генетических детерминант, кодирующих факторы вирулентности. E. coli, идентичные по ферментативным свойствам или серогруппе, могут различаться по набору генов вирулентности. В отличие от штаммов Salmonella spp. и Shigella spp., выделение E. coli с типичными биологическими свойствами из проб испражнений, не является бесспорным доказательством их этиологической роли, так как поиск патогенных E. coli проводится на фоне облигатных E. coli — представителей нормобиоты кишечника человека популя-ционной плотности 107-108 КОЕ/гр фекалий [27, 28]. В 70-х годах прогрессом в установлении этиологического значения E. coli при ОКИ были исследования отечественных и зарубежных микробиологов на основе антигенных свойств штамма (О-, К-, Н антигены). В России и во многих странах организовано промышленное производство диагностических агглютинирующих О- и ОК-сывороток к антигенам патогенных E. coli. В обязательном порядке определение О- группы изолятов E. coli, выделенных из проб испражнений, внедрено в бактериологические лаборатории. В РФ выпускают наборы ОК сывороток и адсорбированных О сывороток (групповых и факторных) к 42 серогруппам патогенных E. coli. Гены вирулентности DEC обнаружены в штаммах, принадлежащих к более 100 серогруппам [29]. Штаммы некоторых серогрупп с одинаковой частотой выделяют от здоровых и больных диареями детей и взрослых [14]. С развитием молекулярных методов и внедрением их в диагностический процесс (детекция генов вирулентности патогрупп DEC) показано, что штаммы определённых се-рогрупп (О , О55, О ) могут содержать гены вирулентности разных «патогрупп», например, ЕРЕС или ЕНЕС и этому есть научное объяснение [30, 31].
Особенностью эшерихиозов в Санкт-Петербурге на протяжении последних пяти лет (2014-2018 гг.) является доминирование в циркуляции штаммов E. coli О6, на долю которых приходится от 25% (2014 г.) до 50% (2018 г.) всех выделенных патогенных E. coli. Эпидемиологическая особенность E. coli O6, заключается в их широкой циркуляции среди здорового населения (детей и взрослых) без клинических симптомов ОКИ, обследованных с профилактической целью. Наши исследования показали, что штаммы E. coli О6:Н1 и E. coli О25:Н4 не имеют генов ЕТЕС и других патогрупп DEC, поэтому они не могут относиться к возбудителям ОКИ. У этих штаммов выявлены гены, ассоциированные с внекишечными заболеваниями: каждый штамм содержал кластер генов, кодирующих различные адгезины (fimH, sfa, afa, pap), токсины (hly, cnf) сидерофоры (iutA, fyuA, chu), характерные для UPEC, среди которых выявлены клинически значимые фенотипы резистентности (MDR и XDR).
В течение последних десяти лет появился и получил глобальное распространение как возбудитель вне-больничных и внутрибольничных ИМП штамм E. coli сиквенс-типа 131 (ST131), с высоким потенциалом вирулентности и резистентности к АМП. Штамм E. coli
О25:Н4В2 ST131 является ведущим возбудителем пато-группы ExPEC практически во всех странах мира [32, 33]. Данные многоцентрового международного проекта BARN (Baltic Antimicrobial Resistance Net - Сеть по надзору за антибиотикорезистентностью в странах Балтийского региона) проведённого в 2012-2014 гг. с участием семи многопрофильных стационаров Санкт-Петербурга по изучению БЛРС-продуцирующих штаммов Enterobacteria-ceae, подтвердили широкое распространение E. coli ST131 [34, 35]. Нашими исследованиями установлено, что случаи выделения из проб испражнений здоровых лиц штаммов E. coli O25, зарегистрированные как «носительство ETEC», принадлежат к пандемическому международному клону высокого риска E. coli О25:Н4В2 ST131, характеризующегося MDR и XDR. Полученные результаты показывают, что важным условием эффективности культурального исследования проб испражнений является адекватный выбор дополнительных молекулярных методов детекции DEC. Этиологическая значимость разных клинических форм заболеваний, обусловленных E. coli, определяется наличием генов вирулентности возбудителя.
Полученные данные представляют теоретический интерес и практическое значение для клиницистов, специалистов лабораторной службы и эпидемиологов.
Выводы.
1. Микробиота кишечника человека является «скрытым» резервуаром E. coli - возбудителей внекишечных инфекций, в том числе ИМП, ИСМП и др.
2. Микробиота кишечника является мощным резервуаром резистентных к АМП штаммов.
3. Мониторинг резистентности к АМП штаммов E.coli, выделенных при различных эпидемических ситуациях (ОКИ, ИСМП, внекишечные заболевания, дисбио-тические состояния), выделенные из пищевых продуктов животного и растительного происхождения и объектов внешней среды, должен стать неотъемлемой частью в системе санитарно-эпидемиологического надзора в РФ.
4. Учитывая важную роль E. coli в патологии человека, необходимо пересмотреть существующие принципы и этапы бактериологического исследования проб испражнений: после выделения чистой культуры E. coli идентификация, наравне с фенотипическими методами, должна включать молекулярные методы (детекция генов вирулентности) для подтверждения этиологической значимости выделенного штамма E. coli.
5. Молекулярные методы расширяют аналитические и диагностические возможности лабораторной диагностики заболеваний, обусловленных E. coli.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
ЛИТЕРАТУРА (4-6, 10-13, 16-21, 24, 29, 32-34 см . REFERENCES)
1. Международная классификация болезней МКБ-10 [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.mkb10.ru.
2. Санитарно-эпидемиологические правила СП 3.1.1.3108-13 «Профилактика острых кишечных инфекций».
3. Онищенко Г.Г., Дятлов И.А., Светоч Э.А., Воложанцев Н.В., Баннов В.А., Карцев Н.Н. и др. Молекулярно-генетическая характеристика шига-токсинпродуцирующих Escherichia coli, выделенных при вспышке пищевой инфекции в Санкт-Петербурге в 2013 году. Вестник Российской академии медицинских наук. 2015; 1: 70-81. Режим доступа: doi:10.15690/vramn.v70i1.1234.
7. Рафальский В.В. Антибиотикорезистентность возбудителей неосложнённых инфекций мочевых путей в Российской Федерации. Вестник урологии. 2018; 6(3): 50-6. Режим доступа: doi 10.21886/2308-6424-2018-6-3-50-56.
8. ВОЗ. Доклад «устойчивость к противомикробным препарато-ам: глобальный доклад по итогам эпиднадзора» [Электронный ресурс] Режим доступа: http://www.euro.who.int/2014new-report-antibiotic-resistance-global-health-threat.
9. ВОЗ. Список бактерий, для борьбы с которыми требуется создание новых антибиотиков [Электронный ресурс]. Режим доступа: http://www.who.int/ru/news-room/detail/27-02-2017-who-publish-es-list-of-bacteria-for-witch-new-antibiotics-are-urgently-needed.
14. Хазенсон Л.Б., Лосева А.Г. Колиэнтерит у детей раннего возраста. Л.: Медицина; 1976.
15. Методические рекомендации. Лабораторная диагностика коли-энтерита детей раннего возраста. МЗ РСФСР; 1985.
22. Клинические рекомендации «Определение чувствительности микроорганизмов к антимикробным препаратам». Режим доступа: http://www.antibiotic.ru/minzdrav/files/docs/clrec-dsma2018.pdf.
23. Эйдельштейн М.В. Выявление бета-лактамаз расширенного спектра у грамотрицательных бактерий с помощью фенотипи-ческих методов. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2001; 3 (2): 183-9.
25. Сухорукова М.В., Эйдедьштейн М.В., Склеенова Е.Ю., Иванчик Н.В., Тимохова А.В., Дехнич А.В., Козлов Р.С. Антибиотикорезистентность нозокомиальных штаммов Enterobacteriaceae в стационарах России: результаты многоцентрового эпидемиологического исследования МАРАФОН в 2011-2012 гг. Клиническая микробиология и антимикробная химиотерапия. 2014; 16 (4): 254-65.
26. Казанцев А.В., Осина Н.А., Глинская Т.О., Кошелева О.Н., Максимов Ю.В., Девдариани З.Л. и др. Факторы вирулентности и филогенетическая характеристика уропатогенных штаммов Escherichia coli, выделенных на территории г. Саратова. Проблемы особо опасных инфекций. 2019; 4: 56-60.
27. Отраслевой стандарт «Протокол ведения больных. Дисбактери-оз кишечника». ОСТ 1500.11.0004-2003. Приказ МЗ РФ № 231 от 09.06.2003.
28. Иванова Е.И., Попкова С.М., Джиоев Ю.П., Долгих В.В., Рако-ва Е.Б., Бухарова Е.В. Детекция некоторых генов, кодирующих факторы патогенности у типичных изолятов Escherichia coli. Бюллетень ВСНЦ СО РАМН. 2014; 5(99): 89-94.
30. МУК 4.2.2963-11 Методические указания по лабораторной диагностике заболеваний, вызываемых Escherichia coli, продуцирующих шига-токсиы (STEC-культуры), и обнаружению возбудителей STEC- инфекций в пищевых продуктах. M.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2011.
31. Макарова М.А., Дмитриев А.В., Матвеева З.Н., Кафтырева Л.А. Молекулярно-генетическая характеристика штаммов Escherich-ia coli серогруппы О26, вызывающих диарейные заболевания у детей. Медицинский академический журнал. 2018; 18 (3): 85-90.
35. Егорова С.А., Кафтырева Л.А., Липская Л.В., Коноваленко И.Б., Пясецкая М.Ф., Курчикова Т.С и др. Штаммы энтеробпкте-рий, продуцирующие бета-лактамазы расширенного спектра и металло-В-лактамазу NDM-1, выделенные в стационарах в странах Балтийского региона. Инфекция и иммунитет. 2013; 3(1): 29-36.
REFERENCES
1. The International Statistical Classification of Diseases and Related Heaith Problems. 10th revision (ICD-10). Available at: http://www. mkb10.ru. (in Russian)
2. Sanitary and epidemiological rules SP 3.1.1.3108-13 "Prevention of acute intestinal infections". (in Russian)
3. Onishchenko G.G., Dyatlov I.A., Svetoch E.A., Volozhantsev N.V., Bannov V.A., Kartsev N.N. et.al. Molecular-genetic characterization of shiga-toxin producing Escherichia coli isolated durind a food-born outbreak in St. Petersburg in 2013. Vestnik Rossiis-koy Akademii Meditsinskikh Nauk. 2015; 1: 70-81. Available at: doi:10.15690/vramn.v70i1.1234. (in Russian)
4. Nataro J.P., Kaper J.B. Diarrheagenic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 1998; 11: 142-201.
МИКРОБИОЛОГИЯ
5. Sarowska J., Futoma-Koloch B., Jama-Kmiecik A., Frej-Madrzak M., Ksiazczyk M., Bugla-Ploskonska G. et al. Virulence factors, prevalence and potential transmission of extraintestinal pathogenic Escherichia coli isolated from different sources: recent reports. Gut Pathog. 2019; 11:10. Available at: doi.org/10.1186/s13099-019-0290-0.
6. Russo T., Johnson J. Medical and economic impact of extraintestinal infections due to Escherichia coli: an over- looked epidemic. Microbes andlnfect. 2003; 5: 449-56.
7. Rafalsky V.V. Antibiotic resistance of pathogens causing uncomplicated urinary tract infections in Russian Federation. Vestnik urolo-gii. 2018; 6(3): 50-6. Available at: doi 10.21886/2308-6424-20186-3-50-56. (in Russian)
8. WHO report «Antimicrobial resistance: global report on surveillance». April 2014; Available at: http://www.euro.who.int/2014new-report-antibiotic-resistance-global-health-threat.
9. WHO published list of bacteria for which new antibiotics are urgently needed. News Release 27.02.2017. Available at: http://www. who.int/ru/news-room/detail/27-02-2017-who-publishes-list-of-bacteria-for-witch-new-antibiotics-are-urgently-needed.
10. Tamura K., Sakazaki R., Murase M., Kosako Y. Serotyping and categorization of Escherichia coli strains isolated between 1958 and 1992 from diarrhoeal diseases in Asia. Med. Microbiol. 1996; 45: 353-8.
11. Poolman J.T., Wacker M. Extraintestinal pathogenic Escherichia coli, a common human pathogen: challenges for vaccine development and progress in the fieid. Infect. Dis. 2015; Available at: DOI: 10.1093/infdis/jiv429.
12. Wolf M.K. Occurrence, distribution, and associations of O and H serogroups, colonization factor antigens, and toxins of enterotoxi-genic Escherichia coli. Clin. Microbiol. Rev. 1997; 10 (4): 569-84.
13. Kaper, J.B., Nataro J.P., Mobley H.L. Pathogenic E.coli. Nat. Rev. Microbiol. 2004; 2: 123-40.
14. Hazenson L.B., Loseva A.G. Colienteritis in young children. Leningrad: Meditsina; 1976. (in Russian)
15. Guidelines «Laboratory diagnosis of colienteritis in young chil-dren» Minzdrav RSFSR;1995. (in Russian)
16. Li D., LiuB., Chen M., Guo D., Guo X., Liu F., et al. A multiplex PCR method to detect 14 Escherichia coli serogroups associated with urinary tract infections. Microbiol. Methods. 2010; 82(1): 717. Available at: doi: 10.1016/j.mimet. 2010.04.008.
17. Banjo M., Iguchi A., Seto K., Kikuchi T., Harada T., Scheutz F. et al. Escherichia coli H-genotyping PCR: a compete and practical platform for molecular H typing. Clin. Microbiol. 2018; 56(6): e00190-18. Available at: doi: 10.1128/JCM.00190-18.
18. Clermont O., Bonacorsi S., Bingen E. Rapid and simple determination of the Escherichia coli phylogenetic group. Appl. Environ. Microbiol. 2000; 66(10): 4555-8. Available at: doi:10.1128/ aem.66.10.4555-4558.2000.
19. Johnson J.R., Stell A.L. Extended virulence genotypes of Esche-richia coli strains from patients with urosepsis in relation to phylog-eny and host compromise. Infect. Dis. 2000; 181: 261-72.
20. Dallenne C., Da Costa A., Decre D., Favier C., Arlet G. Development of a set of muliplex PCR assays for the detection of genes encoding important b-lactamases in Enterobacteriaceae. Antimi-crob. Chemother. 2010; 65: 490-5. Available at: doi:10.1093/jac/ dkp498
21. Clermont O., Dhanji H., Upton M., Gidreel T., Fox A., Boyd D. et al. Rapid detection of the O25b-ST131 clone of Escherichia coli encompassing the CTX-M-15-producing strains. Antimicrob. Agents Chemother. 2009; 64: 274-7. Available at: doi:10.1093/jac/ dkp194.
22. Guidelines «Antimicrobial susceptibility testing of microorganism». Available at:http://www.antibiotic.ru/minzdrav/files/docs/ clrec-dsma2018.pdf. (in Russian)
23. Edelstein M.V. Detection of extended-spectrum beta-lactamases in gram-negative bacteria using phenotypic methods. Klinicheskaya mikrobiologiya I antimikrobnaya khimioterapiya. 2001; 3 (2): 1839. (in Russian)
24. Magiorakos AP., Srinivasan A., Carey R.B., Carmeli Y., Falagas M.E., Giske C.G., et al. Multidrug-resistant, extensively drug-resis-
MICROBIOLOGY
tant and pandrug-resistant bacteria: an international expert proposal for interim standard definition for acquired resistance. Clin.Micro-biol. Infect. 2012; 18 (3): 268-81.
25. Sukhorukova M.V., Edelstein M.V., Skleenova E.Yu., Ivanchik N.V., Timokhova A.V., Dekhnich A.V., Kozlov R.S. Antimicrobial resistance of nosocomial Enterobacteriaceae isolated in Russia: results of National multicenter surveillance study «MARATHON» 2011-2012. Klinicheskaya mikrobiologiya I antimikrobnaya khi-mioterapiya. 2014; 16 (4): 254-65. (in Russian)
26. Kazantsev A.V., Osina N.A., Glinskaya T.O., Kosheleva O.N., Maksimov Yu.V., Devdariani Z.L. et al. Virulence factors and phy-logenetic characteristics of uropathogenic Escherichia coli strains isolated in Saratov. Problemy osobo opasnykh infektsiy. 2019; 4: 56-60. (in Russian)
27. Industry Standard «Treatment Protocol. Intestinal dysbiosis» OST 1500.11.0004-2003. Order of the Ministry of Health of Russian Federation № 231 of 09.06.2003.
28. Ivanova E.I., Popkova S.M., Dzhioev Yu.P., Dolgikh V.V., Rakova E.B., Bukharova E.V. Detection of same genes encording pathogenicity factors in the typical isolated of Escherichia coli. Byulleten' VSNC SO RAMN. 2014; 5(99): 89-94.(in Russian)
29. Bergey's Manual of systematic bacteriology. XXVIII. 2005. Available at: eBook Packages Biomedical andLife Sciences. DOI https:// doi.org/10.1007/0-387-28022-7 Online ISBN 978-0-387-28022-6.
30. Guidelines MUK 4.2.2963-11 «Guidelines for laboratory diagnosis of diseases caused by Escherichia coli, producing Shiga-toxin (STEC-culture), and the detection of causative agents of STEC-
infections in food products. Moscow: Federalnyi Tsentr gigieny I epidemiologii Rospotrebnadzora; 2011. (in Russian)
31. Makarova M.A., Dmitriev A.V., Matveeva Z.N., Kaftyreva L.A. Molecular-genetic characteristics of strain Escherichia coli sero-group O26 causing diarrheal diseases in children. Meditsinskiy aka-demicheskiy zhurnal. 2018; 18 (3): 85-90. (in Russian)
32. Park J.Y., Yun K.W., Choi E.H., Lee H.J. Prevalence and characteristics of sequence type 131 Escherichia coli isolated from children with bacteremia in 2000-2015. Microb. Drug Resist. 2018; 24(10): 1552-8. Available at: http://doi.org/10.1089/mdr.2017.0224.
33. Sepp E., Andreson R., Balode A., Bilozor A., Brauer A., Egorova S. et al. Phenotypic and molecular epidemiology of ESBL-, AmpC-, and carbapenemase-producing Escherichia coli Northern Europe. Front. Microbiol. 2019. Available at: https://doi.org/10.3389/ fmicb.2019.02465.
34. Lillo J., Pai K., Balode A., Makarova M., Huik K., Köljalg S. et al. Differences in extended-spectrum beta-lactamase producing Escherichia coli virulence factor genes in the Baltic Sea region. 2014. BioMedResearch International. Article ID 427254, 7 pages. Available at: http://dx.doi.org/10.1155/2014/427254.
35. Egorova S.A., Kaftyreva L.A., Lipskaya L.V., Konovalenko I.B., Pyasetskaya M.F. Kurchikova T.S. et al. Enterobacteriaceae, producing ESBL and metallo-ß-lactamase NDM-1, isolated in hospitals of Baltic region countries. ZhurnalInfektsiya i immunitet. 2013; 3(1): 29-36. (in Russian)
Поступила 10.04.20 Принята к печати 13.04.20
