CC BY
186
УДК 581.143 Н.А. Величко, Ж.А. Плынская
КУЛЬТИВИРОВАНИЕ ПОЛЫНИ ОБЫКНОВЕННОЙ (ARTEMISIA VULGARIS L.) В УСЛОВИЯХ IN VITRO
Введена в культуру полынь обыкновенная. Изучена динамика роста каллусной ткани. Определен химический состав интактного растения и каллусной ткани.
Ключевые слова: полынь обыкновенная, культивирование, культура клеток, каллус, регуляторы роста, биологически активные вещества.
N.A. Velichko, Zh.A. Plynskaya WORMWOOD (ARTEMISIA VULGARIS L.) CULTIVATION IN THE IN VITRO CONDITIONS
Artemisia vulgaris L has been brought under cultivation. Callus tissue growth dynamics is studied. Chemical composition of the intact plant and callus tissue is studied.
Key words: wormwood, cultivating, cell culture, callus, growth regulators, biologically active substances.
Введение
Растения и получаемые из них фитопрепараты издавна используют для лечения, профилактики заболеваний человека, а также в пищу.
Специфическая особенность растений состоит в том, что они способны синтезировать огромное количество самых разнообразных химических соединений различной природы.
Поиск альтернативных источников и разработка методов получения биологически активных веществ растительного происхождения, по эффективности сопоставимых или превосходящих использование традиционного сырья, определяет актуальность этой проблемы. Одним из таких методов является культура клеток и тканей растений in vitro. Преимуществами данного метода является возможность получения продукта независимо от внешних климатических, почвенных условий, круглогодично, сохраняя при этом естественные ареалы ценных лекарственных растений [1-3].
В природе видов полыни множество, но наиболее популярными являются следующие: веничная, горькая, каменная, лечебная, морская, обыкновенная, полевая, Сиверса, таврическая, холодная, эстрагон. Все эти виды являются целебными, хотя некоторые из них практически лишены ярко выраженной горечи и по-разному воздействуют на организм человека, а следовательно, и в применении имеются некоторые особенности. Наиболее значимыми являются обыкновенная и горькая полыни [4].
Цель исследований
Введение в культуру полыни обыкновенной и исследование химического состава интактного растения и каллусной ткани.
Полынь обыкновенная (Artemisia vulgaris L), или чернобыльник - относится к семейству сложноцветные (Compositae). В отличие от серовато-серебристой полыни горькой она имеет темно-красные стебли. Это многолетнее травянистое растение с цилиндрическим, почти отвесным, многоглавым корневищем, без ползучих побегов, от которого отходят деревянистые стебли высотой до 150 см. Стебель прямой, ветвистый. Листья перисто-раздельные или дважды перисто-раздельные, сверху темно-зеленные, обычно голые, снизу беловатые, опушенные, нижние - на черешках с парой перистых прилистников при основании, верхние -сидячие, с продолговатыми или продолговато-ромбическими долями, по краю - зубчатые. Цветки собраны в мелкие, обычно вверх торчащие корзинки, которые собраны в большую разветвленную метелку. Общее ложе корзинки голое. Листочки обертки эллиптические, по краю перепончатые, все шерстисто-волосистые. Цветки желтые или красноватые, почти голые, краевые - женские, немногочисленные, центральные - обоеполые, их в два раза больше. Плоды - мелкие, в очертании продолговатые, иногда немного сплющенные, темно-бурые семянки. Цветет в июле-августе.
Объект и методы исследований
Введение в культуру полыни обыкновенной проводили по схеме, приведенной на рисунке 1.
Для получения каллусной ткани Artemisia vulgaris применяли методику инициации каллусогенеза, согласно которой каллусообразование стимулировалось искусственными регуляторами роста гормональной природы.
В качестве эксплантов для получения каллуса использовались семена, побеги, листья, сегменты стебля Artemisia vulgaris.
Пассирование культуры Artemisia vulgaris производили в стерильном боксе. Над пламенем спиртовки открывали пробирку с культурой, пинцетом извлекали каллусную ткань и помещали ее в чашки Петри. Скальпелем делили ткань на кусочки размером 2-5 мм (средняя масса сырой ткани составляла около 44 мг). Для пересадки брали желто-зеленые рыхлые участки каллуса, удаляя некротизированные и контактировавшие с питательной средой. Затем каждый кусочек помещали в пробирку на свежую питательную среду. Выращивание каллусных культур производили в световой.
При работе с культурами клеток необходимо вести контроль роста и жизнеспособности культуры. При культивировании каллусной ткани для одного измерения обычно используют от 3 до 10 повторностей (пробирок с растущим эксплантом). В работе при проведении оценки роста культуры использовали независимую выборку по 10 пробирок для обсчета средних экспериментальных значений каждой точки на вариантах среды.
Для оценки роста каллусной культуры применяли весовой метод, взвешивая на аналитических весах извлеченный из пробирки пинцетом каллус. Измерения проводились каждые четыре дня.
W
Рпстснис пробирочное растение к-аллуснни ткань
(полынь обыкнопсннпя)
Рис. 1. Схема введения в культуру in vitro Artemisia vulgaris
На начальном этапе работы необходимым условием является стерилизация материала. Поскольку стерилизация первичных эксплантов играет решающую роль в процессе культивирования, наряду с подбором питательных сред необходимо было определить эффективную схему стерилизации растительного материала для получения максимального количества жизнеспособных эксплантов.
Результаты исследований и их обсуждение
В результате проведенных исследований было установлено, что с увеличением продолжительности стерилизации снижается число инфицированных эксплантов, но при этом происходит снижение их жизнеспособности. Наиболее эффективным стерилизующим агентом, оказывающим наименьшее повреждение тканей и позволяющим получать достаточно высокий процент неинфицированных эксплантов, был 0,1 % раствор диацида с добавлением Твина-80 (одну - две капли на 1 л) при продолжительности стерилизации 1 мин. При проведении дальнейших экспериментов использовали эту схему стерилизации.
Эффективность процессов культивирования in vitro в значительной степени определяется правильным выбором питательной среды. Согласно литературным данным, наиболее благоприятной для культивирования ювенильных растений Artemisia vulgaris L. является питательная среда, содержащая минеральные соли по Мурасиге и Скугу (MS). Для подбора наилучших условий для культивирования и инициирования кал-лусной ткани из Artemisia vulgaris L. использовали агаризованные питательные среды на основе макро- и микроэлементов по MS. Известно, что наиболее важными компонентами питательной среды, определяющи-
ми каллусогенез, являются регуляторы роста. Они играют незаменимую роль при каллусогенезе и культивировании клеток растений в системе in vitro.
Модификации подвергаются в первую очередь гормональная составляющая питательной среды, в связи с этим последующим этапом исследования было изучение влияния экзогенных регуляторов роста на каллусогенез и рост культур клеток полыни обыкновенной. В питательные среды добавляли регуляторы роста ауксиновой и цитокининовой природы с разными концентрациями.
Влияние регуляторов роста на каллусогенез Artemisia vulgaris L. приведены в таблице 1.
Таблица 1
Влияние регуляторов роста на каллусогенез Artemisia vulgaris L.
Среда Фитогормон, мг/л Общее число эксплантов Частота каллусогенеза, % Начало каллусогенеза, сут.
Е-0 Без гормонов 20 7 20-35
Е-1 2,4-Д, 0,1 20 21 20-25
Е-2 2,4-Д, 0,2 20 65 10-25
Е-3 2,4-Д, 0,6 20 80 10-35
Е-4 2,4-Д, 0,8 20 73 16-35
К-1 2,4-Д, 1 +КИН, 0,15 20 69 18-30
К-2 2,4-Д, 2 +КИН, 0,2 20 86 15-25
К-3 2,4-Д, 4 + КИН, 0,2 20 100 8-18
К-4 2,4-Д, 8 +КИН, 0,4 20 45 16-23
М-1 КИН, 0,1 20 30 27-35
М-2 КИН, 0,2 20 28 27-35
М-3 КИН, 0,4 20 17 23-35
М-4 КИН, 0,6 20 0 -
Ф-1 6-БАП, 0,1 20 35 15-35
Ф-2 6-БАП, 0,3 20 20 27-35
Ф-3 6-БАП, 0,6 20 20 25-37
Ф-4 6-БАП, 0,8 20 25 24-30
Т-1 6-БАП, 0,1 + ИУК, 1 20 75 19-27
Т-2 6-БАП, 0,5+ ИУК, 2 20 99 12-20
Т-3 6-БАП, 0,7+ ИУК, 1 20 0 -
Т-4 6-БАП, 0,9+ ИУК, 2 20 0 -
Х-1 ИУК, 1 20 49 18-29
Х-2 ИУК, 2 20 36 22-31
Х-3 ИУК, 4 20 17 30-35
Х-4 ИУК, 6 20 11 31-37
При исследовании роли фитогормонов в индукции каллусов было исследовано 23 модификации питательной среды MS, которые отличались качественным составом и количественным содержанием регуляторов роста.
В результате проведенного эксперимента было установлено, что активной инициацией каллуса сопровождались не все используемые среды. Начало каллусообразования на различных средах варьировало от 8 до 25 сут. На среде, не содержащей регуляторов роста, которая использовалась в качестве контроля, инициации каллусной ткани практически не произошло.
Интенсивный рост каллусных тканей полыни обыкновенной обеспечивался на среде MS с добавлением ИУК и 6-БАП (среда Т-2). Высокое каллусообразование наблюдалось на средах с добавлением кинетина и 2,4-Д и началось после 10 сут. введения в культуру in vitro (среда К-3). Динамика роста (рис. 2) Artemisia vulgaris L. характеризуется обычной для культур клеток растений S-образной кривой. Лаг-фаза на двух используемых средах продолжалась 4 сут., после чего следовало постепенное увеличение количества сырой массы каллуса в течение продолжительного времени 25-48 сут. Затем содержание сырой биомассы оставалось постоянным или незначительно снижалось после 48 сут.
289
Результаты эксперимента показали, что способность к каллусообразованию - гормонозависимое явление.
Определяли химический состав как интактного растения полыни обыкновенной, так и полученной кал-лусной ткани. Для расчетов на абсолютно сухую массу (а.с.м.) необходимо было определить влажность, которая составила 8,39 %.
Продолжительность культивирования, сут
♦ - рост каллуса на среде с регуляторами роста 4 мг/л 2,4-Д+ 0,2 мг/л КИН;
■ - рост каллуса на среде с регуляторами роста 2 мг/л ИУК+0,5 мг/л 6-БАП
Рис. 2.. Динамика роста каллусной ткани Artemisia vulgaris L., выращенной на средах с различным содержанием регуляторов роста
Содержание биологически активных веществ в полыни обыкновенной, в надземной и каллусной ткани приведено в таблице 2.
Таблица 2
Содержание биологически активных веществ в полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris L.)
Компонент Надземная часть Каллусная ткань
Флавоноиды, % а.с.м. 9 ,0 0, +1 0 ,3 0, 0,73 ± 0,09
Алкалоиды, % а.с.м. 0,50 ± 0,04 1,10 ± 0,04
Дубильные вещества, % а.с.м. 5,57 ± 0,04 1,42 ± 0,04
Экстрактивные вещества, % а.с.м. 6,02 ± 0,04 5,74 ± 0,04
Витамин С, % мг 5,43 ± 0,09 2,80 ± 0,06
Витамин В1, % мг 1,03 ± 0,04 6,80± 0,06
Витамин Р ( рутин), % мг 2,40 ± 0,08 4 ,0 0, +1 2 ,2 3,
Протеин, % а.с.м. 1,86 ± 0,21 1,83 ± 0,04
Установлено наибольшее содержание витаминов в надземной части полыни обыкновенной - витамина С (5,43 мг%), в каллусной ткани - витамина Bi (6,80 мг%), содержание флавоноидов (0,30 и 0,73 % соответственно).
Был изучен аминокислотный состав белка полыни обыкновенной (Artemisia vulgaris), который представлен в таблице 3.
Из данной таблицы видно, что преобладающими заменимыми аминокислотами в каллусной ткани являются глютаминовая и аспаргиновая кислоты (24,29 и 15,77 % соответственно), а в надземной части незаменимая аминокислота - аргинин (52,60 %).
Таблица 3
Аминокислотный состав белка Artemisia vulgaris
Название аминокислоты Содержание аминокислот, %
в каллусной ткани в надземной части
Аспаргиновая кислота 15,77 6,64
Треонин 1,92 0,98
Серин 5,28 3,07
Глютаминовая кислота 24,30 5,76
Пролин 0,25 0,29
Глицин 12,94 9,19
Аланин 12,84 5,37
Валин 1,09 0,46
Метионин 0,36 0,21
Изолейцин 0,33 0,10
Лейцин 1,94 0,81
Тирозин 13,45 6,09
Фенилаланин 0,92 0,38
Гистидин 6,34 7,62
Лизин 1,07 0,42
Аргинин 1,22 52,60
Следовательно, исходя из полученных результатов с фармацевтической точки зрения надземная часть полыни обыкновенной, произрастающей на территории Красноярского края, является ценным материалом для получения биологически активных веществ, которые могут найти применение, как в медицинских, косметических целях, так и в пищевой промышленности.
Каллусная ткань полыни обыкновенной может служить альтернативным сырьем для получения значимых биологически активных соединений.
Литература
1. Бутенко Р.Г. Клеточные технологии для получения экономически важных веществ растительного происхождения. - М.: Наука, 1986. - С. 3-28.
2. Бутенко Р.Г. Культура клеток растений. - М.: Наука, 1989. - 146 с.
3. Крендель Ф.П. Клеточная биотехнология, как экологический принцип охраны лекарственных растений // Экологические аспекты в формации: тез. док. Междунар. симп. - М., 1990. - С. 64.
4. Габерман, А.Ф. Кадаев Г.Н., Яценко-Хмелевский А.А. Лекарственные растения: справ. пособие. -4-е изд. - М.: Высш. шк., 1990. - 543 с.
---------♦'----------
