CC BY
81
УДК 630.866.1.001.5 + 630.892.6.001.5
ВЛИЯНИЕ РЕГУЛЯТОРОВ РОСТА НА ПРОЦЕССЫ СИНТЕЗА ВТОРИЧНЫХ ВЕЩЕСТВ В КУЛЬТУРЕ IN VITRO EPHEDRA MONOSPERMA C.
© Ж.А. Плынская , Н.А. Величко
Сибирский государственный технологический университет, пр. Мира, 82, Красноярск (Россия) Е-mail: jannetta-83@mail.ru
Введена в культуру in vitro Ephedra monosperma C. - продуцент алкалоида эфедрина. Отобраны четыре каллусные линии, характеризующиеся стабильными качественными и количественными свойствами. Исследовано влияние гормонального состава среды на процесс роста и накопление алкалоидов в каллусной культуре эфедры односемянной.
Обнаружено, что на средах, содержащих БАП, ткань характеризовалась более рыхлой структурой, желтым цветом, происходило накопление алкалоидов. В присутствии 2,4-Д без цитокининов происходило угнетение роста, ткань старела и погибала. На средах, содержащих НУК и БАП, происходило повышение темпов роста культуры, ткань характеризовалась более плотной структурой и одновременным накоплением биомассы алкалоидов.
Ключевые слова: культивирование, культура клеток, каллус, регуляторы роста, биологически активные вещества.
Введение
Одним из прикладных направлений развития биотехнологии растений является использование культур клеток и тканей для получения ценных вторичных веществ. Актуально изучение влияния ауксинов и цитокининов на их метаболизм и накопление. Оптимальные концентрации для каждого типа гормонов, вид растений и способ культивирования подбирают обычно эмпирически. Специфичность реакции разных видов растений по отношению к регуляторам роста разного химического строения, по-видимому, определяется различной способностью поглощать и метаболизировать эти соединения.
Культура клеток Ephedra monosperma C. интересна как продуцент эфедрина, который только у этого вида эфедринсодержащих растений является экзометаболитом и составляет основную долю синтезируемых алкалоидов. Культивирование эфедры односемянной в условиях in vitro делают ее привлекательным объектом для разработки технологии культивирования с многократным использованием иммобилизованной биомассы [2].
Нативные растения и семена для культивирования эфедры были взяты из природной популяции в окрестностях Красноярска. Каллусная ткань была получена в результате каллусогенеза из молодых побегов на среде, содержащей НУК и БАП при пониженной концентрации сахарозы. Полученный каллус отличался светло-зеленым цветом и более плотной структурой. Семена оказались непригодными для каллусообразова-ния, поскольку они не прорастали ни на одной из использованных сред [3].
Для дальнейшей работы с полученной культурой Ephedra monosperma C. необходимо было подобрать соотношение концентрации фитогормонов, оптимальных для роста и синтеза, с целью дальнейшей разработки технологии получения алкалоидов [4].
Экспериментальная часть
Нативные растения и семена для культивирования эфедры были взяты из природной популяции в окрестностях Красноярска.
* Автор, с которым следует вести переписку.
126
Ж.А. Плынская, Н.А. Величко
Каллусная ткань Ephedra monosperma C. поддерживалась на среде с минеральной основой по Мурасиге -Скугу [5, 6]. При пересадке на среду с иным содержанием фитогормонов ткань проходила адаптацию в течение пассажа I. Применяли среды следущего гормонального состава.
Е3: БАП - 0,2 мг/л, НУК - 0,4 мг/л;
Е6 :БАП - 0,3 мг/л, НУК - 1 мг/л;
Е7: БАП - 0,25 мг/л, НУК - 0,15 мг/л, 2,4 - Д 0,05 мг/л;
Е8: БАП - 1 мг/л, 2,4 - Д 0,4 мг/л.
Экспланты культивировали в закрытых фольгой пробирках при фотопериоде 16 ч - день, 8 ч - ночь, при температуре 28-30 °С и интенсивности освещения 3500 люкс.
Изъятие ткани для анализа проводили на 40-е сутки культивирования. Для определения интенсивности роста измеряли воздушно-сухую массу после высушивания биомассы в течение 3 сут. при температуре 50 °С.
Обсуждение результатов
Использование разных стерилизующих растворов было обусловлено неоднородностью исходного материала. При введении в культуру участков молодых побегов наиболее приемлемой оказалась двухступенчатая стерилизация: 1) KMnO4 0,1% в течение 20 мин; 2) диацид 0,1% в течение 1 мин. При этом достигался наиболее высокий процент живых, незараженных эксплантов. Для семян лучшим стерилизующим раствором был 60% гипохлорит натрия.
Каллусная ткань была получена в результате каллусогенеза из молодых побегов на среде, содержащей НУК и БАП при пониженной концентрации сахарозы. Полученный каллус отличался светло-зеленым цветом и более плотной структурой. Семена оказались непригодными для каллусообразования, поскольку они не прорастали ни на одной из использованных сред. Проростки, полученные из семян, оказались наиболее благоприятным материалом для введения в культуру. Здесь также использовали двухступенчатую стерилизацию.
При введении в культуру проростков получили спектр каллусов, различающихся окраской, вязкостью, структурированностью и скоростью роста. Каллусообразованию способствовало преобладающее содержание в среде гормонов как ауксиновой, так и цитокининовой природы (табл.).
Первичный каллус, полученный из эксплантов, отличался нестабильностью окраски, консистенции и структурированности. В целом можно отметить, что преобладание в среде гормоном ауксиновой природы приводило к образованию сильно оводненного каллуса, большей частью бесцветного или белого, или желтоватого. В нескольких случаях было зафиксировано образование каллуса бурой и буро-зеленой окраски.
Тот уровень ауксинов и цитокининов среды, который вызывал активный рост каллусной ткани эфедры, применяли в более ранних исследованиях для тканей хвойных пород - ели сибирской, сосны обыкновенной, лиственницы сибирской. Следует отметить, что каллусообразование и тканевый генезис эфедры в целом схожи с таковыми хвойных пород. В результате пассажа I наибольший прирост наблюдали на средах Е3 и Е6 - 7,5 и 3,9 г асм/л соответственно. Длительность одного субкультивирования составляла 30 сут.
В пассаже II наилучшими показателями прироста и стабильности обладали каллусы на тех же средах Е3 и Е6, а экспонирование на среде Е7 позволило выделить еще два быстрорастущих клона. Во всех остальных вариантах гормонального состава наблюдали постепенное угнетение и остановку роста. В пассаже III наблюдали угнетение роста на среде Е3, а на среде Е8 в то же самое время было отмечено развитие каллусной ткани со складчатой поверхностью, красноватого цвета, отличавшейся мелкозернистой однородной структурой, быстрым ростом и высокими показателями прироста биомассы.
Характеристика каллусной ткани на средах с различным составом регуляторов роста
Питательная среда Визуальная характеристика ткани Прирост биомассы за период субкультивирования, мг/л среды Содержание алкалоидов на стационарной фазе, % к а.с.м. ткани
Название среды Содержание гормонов, мг/ л среды
Е8 6-БАП - 1,0 Рыхлая, водянистая,
2,4-Д - 0,4 желто-зеленого цвета 7,9 0,67
Е6 6-БАП - 0,3 Плотная, однородная,
а-НУК - 1,0 светло-зеленого цвета 12,51 0,91
Е3 6-БАП - 0,2 Плотная, однородная,
а-НУК - 0,4 светло-зеленого цвета 11,62 1,21
Е7 6-БАП - 0,25 Зелено-коричневая, неод-
2.4-Д - 0,05 нородная, заметен 5,28 0,51
а-НУК - 0,15 морфогенез
В результате проведенных манипуляций к пассажу VII были выделены четыре клона, проявляющие стабильные качественные и количественные характеристики (цвет, структура, скорость роста, прирост биомассы) на средах определенного гормонального состава: Е3, Е6, Е7 и Е8 (см. «Экспериментальную часть»).
Попытки взаимозамены среды отражались на характере роста и структуре ткани, что в конечном итоге приводило к побурению и гибели ткани.
Из результатов приведенных в таблице 1 и рисунке 1 следует, что оптимальной из каллусных линий является линия выращиваемая на среде Е3. Для нее характерен высокий прирост биомассы и одновременно она накапливает большое количество алкалоидов.
14
12
р 10
о 6
& 4
12 3 4
код среды
ZD содержание алкалоидов —прирост биомассы
Прирост биомассы и накопление алкалоидов в каллусной ткани Ephedra monosperma С.
Выводы
Изучение особенностей каллусогенеза эфедры односемянной Ephedra monosperma С. показало, что процесс каллусообразования зависит от стимуляторов роста и исходного растительного материала. Наилучшим материалом для введения в культуру in vitro являются молодые побеги и проростки, полученные из семян.
Для инициации процессов каллусообразования следует использовать среды, содержащие БАП и НУК. Для успешного роста каллуса важно соотношение концентрации ауксина и цитокинина. При преобладании ауксинов в среде каллус становится вязким по консистенции. Увеличение цитокининов в среде способствует частичной дифференциации ткани.
Наилучшие показатели роста наблюдаются на средах Е3 и Е6. Проведенные исследования показали, что Ephedra monosperma С. является перспективным объектом для биотехнологии.
8
2
0
Список литературы
1. Журинов М.Ж. Химия эфедриновых алкалоидов. Алма-Ата, 1990. 140 с.
2. Кучеренко Л.А. Подходы к разработке технологии массовой регенерации растений in vitro // Биология культивируемых клеток и биотехнология растений. М., 1991. - С. 232-235.
3. Орехов А.П. Химия алкалоидов. М., 1975. 672 с.
4. Грандберг И.И. Органическая химия. М., 1987. 480 с.
5. Гринкевич Н.И. Лекарственные растения: справочное пособие. М., 1991. 420 с.
6. Murashige T., Skoog F. A revised medium for rapid growth and bioassays with tobacco tissue cultures // Physiol. plant. 1968. V. 15. №13. Р. 473-497.
Поступило в редакцию 24 июля 2008 г. После переработки 11 сентября 2008 г.
