CC BY
236
Том 149, кн. 4
Естественные науки
2007
УДК 543.258
КУЛОНОМЕТРИЧЕСКОЕ ОПРЕДЕЛЕНИЕ ЛЕВОМИЦЕТИНА В ЛЕКАРСТВЕННЫХ ФОРМАХ
Г.К. Зиятдинова, А.И. Самигуллин, Г.К. Будников, С.Г. Абдуллина
Найдены условия кулонометрического определения левомицетина. Установлено, что лишь восстановленная форма левомицетина взаимодействует с электрогенериро-ванными хлором и бромом. Реакция протекает стехиометрично в соотношении 1 : 2 только с бромом. Разработан способ кулонометрического определения левомицетина в фармпрепаратах.
Левомицетин (В(-)-трео-1-п-нитрофенил-2-дихлорацетатаминопропан-диол-1,3) является антибиотиком широкого спектра действия.
Впервые как лекарственный препарат был получен из культуральной жидкости Str. venezuelae. В настоящее время производят путем химического синтеза.
Левомицетин эффективен в отношении большинства грамположительных и грамотрицательных микроорганизмов: к нему чувствительны эшерихии, сальмонеллы, пастереллы, стафилококки, стрептококки, диплококки, протеи и др. Действует на штаммы бактерий, устойчивые к пенициллинам, стрептомицину, сульфаниламидам. Активен против грамотрицательных анаэробов. Неэффективен в отношении кислотоустойчивых бактерий, клостридий и синегнойной палочки [1].
Устойчивость микроорганизмов к левомицетину развивается медленно, ступенеобразно. Перекрестная устойчивость к другим антибиотикам, как правило, не развивается, однако патогенные штаммы грамотрицательных бактерий, устойчивые к ампициллину, карбенициллину, тетрациклинам, стрептомицину, ка-намицину, гентамицину, чаще всего резистентны и к левомицетину.
В обычно применяемых дозах левомицетин действует бактериостатически, нарушая синтез белка микробной клеткой на стадии переноса аминокислот от аминоацил-тРНК на рибосомы. Действует на микроорганизмы, находящиеся
Аннотация
Введение
O
Левомицетин (хлорамфеникол)
как в стадии размножения, так и в стадии покоя, однако по отношению к размножающимся микробам более эффективен. Препарат хорошо проникает в клетки макроорганизма и действует на внутриклеточно расположенных возбудителей [2].
Для количественного определения хлорамфеникола применяют различные физико-химические методы [3], и литература по этой проблеме достаточно обширна.
Разработан способ мембранного иммуноанализа для определения хлорамфеникола в водных растворах. Определение антибиотика может быть проведено полуколичественно (визуальная двухцветная детекция) или количественно в диапазоне концентраций 0.01-100 нг/мл (хемилюминесцентная детекция). Показаны преимущества хемилюминесцентной детекции по сравнению с колориметрической, заключающиеся в более низком пределе обнаружения (0.02 и 7 нг/мл хлорамфеникола соответственно) и более широком диапазоне определяемых концентраций [4].
Полярографический метод применен для определения левомицетина в фармацевтических препаратах (мазях, капсулах, глазных каплях, инъекционных растворах, суппозиториях). Применяя в качестве растворителя абсолютный спирт или уксусную кислоту, проводили прямое определение антибиотика без его предварительного экстрагирования. Метод основан на электрохимическом восстановлении спиртового раствора хлорамфеникола на фоне лимонной кислоты и гидроксида натрия с добавлением 1%-ного раствора желатины и соляной кислоты до рН 4.4 с последующим полярографированием исследуемого раствора (после продувания азота) от 0 до -0.86 В [5].
Предложен простой и быстрый способ определения хлорамфеникола в различных пищевых матрицах с помощью жидкостной хроматографии с масс-спектрометрическим детектированием. Б(5)-хлорамфеникол был использован в качестве внутреннего стандарта. Для извлечения хлорамфеникола из образцов мяса, морской еды, яиц, меда и молока использовали ацетонитрил. Для удаления воды добавляли хлороформ. После выпаривания сухой остаток растворяли в смеси метанол : вода (3 : 4) [6].
Разработана простая, точная и хорошо воспроизводимая методика определения хлорамфеникола в корме для рыб методом обращенно-фазной хроматографии. Хлорамфеникол извлекали из образца смесью вода : ацетонитрил. Часть отцентрифугированного экстракта пропускали через колонку Бпу1-СагЬ с твердой фазой. Методика позволяет количественно определять хлорамфеникол в диапазоне от 0.2 до 4.0 г/кг. Мера правильности составила 100.5% (относительное стандартное отклонение 1.2%). Пределы обнаружения и количественного определения равны 0.2 и 1.0 мг/кг соответственно [7].
Описан способ определения хлорамфеникола в креветках методом косвенного конкурентного хемилюминесценцного ферментного иммуноанализа (ю-СЬБ1А). Найдены оптимальные условия определения (время инкубации, концентрация Твин-20, рН). Пределы обнаружения составили 0.01 нг/мл, диапазон определяемых концентраций - 0.03-23.7 нг/мл, с ЛД50 - 0.47 нг/мл [8].
Разработан способ определения остатков хлорамфеникола на поверхностях оборудования фармацевтической промышленности с применением тонкослой-
ной хроматографии с фотометрическим детектированием при 280 нм. Модельные растворы, содержащие 0.5, 1, и 1.2 мг/мл хлорамфеникола, готовили, нанося точно рассчитанное количество раствора хлорамфеникола на поверхности нержавеющей стали площадью 10 см2. После испарения растворителя остатки собирали 2-мя ватными тампонами, смоченными метанолом, а затем экстрагировали метанолом. Полученный экстракт анализировали методом высокоэффективной жидкостной хроматографии (ВЭЖХ). Абсолютный предел обнаружения равен 3 нг и предел количественного определения - 10 нг [9].
Жидкостная хроматография с масс-спектрометрическим детектированием применена для определения остаточных количеств хлорамфеникола в молоке, яйцах, мышцах и печени цыпленка, а также мышечной и почечной тканях говядины. Хлорамфеникол извлекали из образцов с помощью ацетонитрила и обезжиривали гексаном. После выпаривания остатки хлорамфеникола растворяли в 10 мМ ацетате аммония и вводили в систему жидкостной хроматографии. Хло-рамфеникол определяли обращенно-фазной хроматографией с использованием колонки Inertsil ODS-2 и масс-спектрометрическим детектированием с электрораспылительной ионизацией отрицательных ионов. Градуировочные графики линейны в интервале 0.5 — 5.0 нг/г для всех изученных образцов. Пределы обнаружения метода лежат в диапазоне 0.2 — 0.6 нг/г, которые сопоставимы с имеющимися в литературе данными [10].
Предложен спектрофотометрический метод для определения левомицетина в препарате «Левовинизол» (извлечение левомицетина из состава с помощью соляной кислоты) [11].
Вольтамперометрия на углеродных волоконных микроэлектродах успешно применяется как метод определения хлорамфеникола в молоке. Градуировочные графики линейны (r = 0.9990) в диапазоне концентраций от 1.0-10 до 1.0-10-5 М. Предел обнаружения равен 4.7-10-8 М [12].
Разработана методика определения хлорамфеникола в сыворотке крови человека методом капиллярного зонного электрофореза, используя колонку с ам-перометрическим детектированием с стеклоуглеродистым микродисковым электродом, при постоянном потенциале -1.00 V (относительного насыщенного каломельного электрода). Изучено влияние кислорода на исследуемую систему. Установлено, что при площади стеклоуглеродного электрода менее 1.1 мм2 влияние кислорода может быть устранено. Найдены рабочие условия определения. Градуировочный график линеен в диапазоне 5-10 - 1-10"3 М, предел обнаружения - 9.1-10-7 М [13].
Определение хлорамфеникола возможно проводить, используя проточно-инжекционный способ. Он основан на on-line контроле фотодеградации препарата в аммиачном буферном растворе с pH 10.4 в фотореакторе. Градуировочный график линеен, вплоть до 8 мг/мл хлорамфеникола; предел обнаружения -0.05 мг/л, относительное стандартное отклонение - 0.4%. Предложенный метод использован для определения хлорамфеникола в коммерческих фармацевтических препаратах и моче человека [14].
Разработан способ электрохимического обнаружения хлорамфеникола в коре головного мозга крысы in vivo после внутривенной инъекции хлорамфеникола сукцината (170 мг/кг). Проведено классическое фармакокинетическое ис-
следование с применением ВЭЖХ для определения хлорамфеникола. Данные обоих методов (вольтамперометрии и ВЭЖХ) хорошо согласуются между собой [15].
Таким образом, чаще всего для определения левомицетина применяют хро-матографические и спектрофотометрические методы, а также другие методы, в частности, электрохимические. Поэтому определенную перспективу представляет расширение возможностей последних, поскольку они являются доступными, чувствительными и экспрессными. Так, гальваностатическая кулономет-рия с электрогенерированными титрантами является эффективным методом анализа органических биологически активных соединений различных классов.
Цель настоящей работы - изучить реакции левомицетина с электрогенери-рованными галогенами в условиях кулонометрии и разработать способ количественного определения левомицетина в лекарственных формах.
1. Экспериментальная часть
Кулонометрическое определение. Электрогенерацию галогенов осуществляли на потенциостате П-5827 М при постоянной силе тока 5.0 мА из водных 0.2 М растворов KCl и KBr в 0.1 М R2SO4 и из 0.1 М раствора KI в тартратном буферном растворе с рН 3.56. Индикацию конечной точки титрования проводили амперометрически с двумя поляризованными платиновыми электродами (ДЕ = 300 мВ). Рабочим электродом служила гладкая платиновая пластинка площадью 1 см2, вспомогательным электродом - платиновая спираль, отделенная полупроницаемой перегородкой от анодного пространства ячейки.
В кулонометрическую ячейку вносили 20.0 мл фонового раствора, опускали электроды, включали генераторную цепь и перемешивание. По достижении определенного значения индикаторного тока в ячейку вносили аликвоту исследуемого раствора (0.1-2.0 мл) и одновременно включали секундомер. Конечную точку титрования фиксировали по достижению первоначального значения индикаторного тока. При этом выключали секундомер и отключали генераторную цепь.
Массу вещества рассчитывали по формуле:
m = I • t • M /(n • F),
где I - сила тока, А; t - время достижения конечной точки титрования, с; M -молярная масса вещества, г/моль; n - число электронов, участвующих в реакции; F - постоянная Фарадея, равная 96500 Кл/моль.
Стандартные растворы левомицетина готовили по точной навеске, растворяя 0.013 г в 1 М НС1 в мерной колбе емкостью 50.0 мл.
Растворы восстановленного левомицетина готовили следующим образом. Навеску вещества или порошка растертых таблеток (0.5 г) помещали в коническую колбу емкостью 250 мл, добавляли 20 мл концентрированной HC1 и осторожно, небольшими порциями, 5 г цинковой пыли. После чего добавляли еще 10 мл концентрированной HC1, обмывая стенки колбы. После полного растворения цинковой пыли полученный раствор использовали для последующего определения левомицетина:
ОН
■сн—сн—сн2он
+ 22п + 4НС1
КН — с—СНС12
II
О
ОН
сН сН сН2ОН
+ 22пС12 + 2Н2О
К1Н —С—СНС12
II
О
Методика количественного определения левомицетина в таблетках. 10 таблеток, предварительно взвешенных, растирали в ступке. Около 0.02 г (точная навеска) порошка растертых таблеток помещали в колбу и готовили раствор восстановленного левомицетина, как описано выше. Затем аликвоту раствора (0.2 мл) вносили в кулонометрическую ячейку. Содержание левомицетина в таблетках в пересчете на окисленную форму рассчитывали по формуле:
где Ук - объем колбы, мл; Уал - объем аликвоты, мл; ттабл - средняя масса таблетки, г; а - масса навески порошка растертых таблеток, г.
Методика определения левомицетина в глазных каплях. Аликвоту препарата (5 мл) вносили в колбу, добавляли 1 мл концентрированной соляной кислоты и 10-кратный избыток цинковой пыли. Аликвоты полученного раствора восстановленного левомицетина вносили в ячейку для кулонометрического титрования.
Полученные результаты подвергались статистической обработке. При оценке результатов из п определений использовали значения среднего арифметического, стандартного отклонения и относительного стандартного отклонения 5Г, которые находили по известным формулам:
Для выбора доверительного интервала среднего значения полагали Р = 0.95.
Электрогенерированные галогены - хлор, бром и йод - были использованы для установления возможности количественного реагирования и стехиометрии реакций с левомицетином. Установлено, что левомицетин не взаимодействует с электрогенерированными галогенами в условиях гальваностатической куло-нометрии. Поэтому все дальнейшие исследования проводили с восстановленной формой левомицетина.
т = I • X • М • Ук • ттабл /(п • ^ • Уал • а),
2. Результаты и обсуждение
Табл. 1
Результаты кулонометрического определения левомицетина в модельных растворах по реакции с электрогенерированным бромом (п = 5, Р = 0.95)
Введено, мкг Найдено, мкг Sr
45 45 ± 2 0.04
90 87 ± 2 0.02
134 131 ± 3 0.02
Табл. 2
Результаты кулонометрического определения левомицетина в лекарственных формах с помощью электрогенерированного брома (п = 5, Р = 0.95)
Лекарственный препарат Содержание действующего вещества, г, *% Найдено, г, *% Sr
Левомицетин, таблетки 0.51 0.48 ± 0.02 0.03
0.52 0.50 ± 0.04 0.06
Левомицетин, глазные капли *0.251 *0.22 ± 0.01 0.05
*0.253 *0.239 ± 0.009 0.03
1 ОАО «Татхимфармпрепараты», г. Казань.
2 ОАО «Фармстандарт-Томскхимфарм», г. Томск.
3 ЗАО «Фармацевтическая фирма ЛЕККО», п. Вольгинский.
Восстановленная форма левомицетина вступает в реакцию с электрогене-рированными хлором и бромом. Электрогенерированный иод не взаимодействует с исследуемым соединением, вероятно, вследствие его меньшей реакционной способности. Необходимо отметить, что реакция с электрогенерированным хлором протекает нестехиометрично, вероятно, вследствие высокой реакционной способностью последнего, который может реагировать по нескольким направлениям.
Результаты кулонометрического титрования позволили установить, что восстановленный левомицетин взаимодействует с электрогенерированным бромом в соотношении 1 : 2. На основе литературных и полученных экспериментальных данных предложена схема взаимодействия восстановленного левомицети-на с электрогенерированным бромом с образованием дибромпроизводного:
ОН Бг ОН
Н2К^уСН-СН-СН2ОН +2ВГ2_Н2К>^Н-СН-СН2ОН +2НБг ЫН—С—СНС12 Бг ИН—С-СНС12
и 2 О
ОО
Результаты кулонометрического определения левомицетина в модельных растворах представлены в табл. 1. Правильность полученных результатов оценена по методу «введено-найдено».
Полученные данные позволили предложить способ количественного определения левомицетина в лекарственных формах (табл. 2). Установлено, что вспомогательные компоненты таблеточной массы и капельной основы не взаи-
модействуют с электрогенерированным бромом и не мешают определению действующего вещества.
Таким образом, разработана простая, чувствительная и экспрессная методика количественного определения левомицетина в лекарственных формах методом гальваностатической кулонометрии. Полученные результаты позволяют рекомендовать способ к внедрению в практику фармацевтических предприятий и центров контроля качества лекарственных средств.
Summary
G.K. Ziyatdinova, A.I. Samigullin, H.C. Budnikov, S.G. Abdullina. Coulometric determination of levomycetin in pharmaceuticals.
The working conditions of levomycetin coulometric determination have been found. The reduced form of levomycetin reacts with electrogenerated chlorine and bromine. Reaction proceeds stoichiometrically in 1 : 2 ratio with bromine only. Method for coulometric determination of levomycetin in pharmaceutical dosage forms has been proposed.
Литература
1. Машковский Д.М. Лекарственные средства. - Харьков: Торсинг, 1998. - Т. 1. - 624 с.
2. Регистр лекарственных средств России «Энциклопедия лекарств» / Под ред. Г.Л. Вышковского. - М.: РЛС, 2002. - Вып. 9. - 1504 с.
3. Максютина Н.П., Каган Ф.Е., Кириченко Л.А., Митченко Ф.А. Методы анализа лекарств. - Киев: Здоровье, 1984. - 221 с.
4. Самсонова Ж.В., Рубцова MM., Чикишева Л.В., Егоров A.M. Мембранный имму-ноанализ хлорамфеникола // Вестн. Моск. ун-та. Сер. 2. Химия. - 2002. - Т. 43, № 6. - С. 396-398.
5. Мискиджьян С.П., Кравченюк Л.П. Полярография лекарственных препаратов. -Киев: Вища шк., 1976. - С. 217.
6. Ronning H. T., Einarsen K., Asp T.N. Determination of chloramphenicol residues in meat, seafood, egg, honey, milk, plasma and urine with liquid chromatography-tandem mass spectrometry, and the validation of the method based on 2002/657/EC // J. Chromatogr. A. -2006. - V. 1118, No 2. - P. 226-233.
7. Hayes J.M. Determination of florfenicol in fish feed by liquid chromatography // J. AOAC Int. - 2005. - V. 88, No 6. - P. 1777-1783.
8. ChuanlaiX., Cifang P., Kai H., Zhengyu J., Wukang W. Chemiluminescence enzyme immunoassay (CLEIA) for the determination of chloramphenicol residues in aquatic tissues // Luminescence. - 2006. - V. 21, No 2. - P. 126-128.
9. VovkI., Simonovska B. Development and validation of a thin-layer chromatographic method for determination of chloramphenicol residues on pharmaceutical equipment surfaces // J. AOAC Int. - 2005. - V. 88, No 5. - P. 1555-1561.
10. Penney L., Smith A., Coates B., Wijewickreme A. Determination of chloramphenicol residues in milk, eggs, and tissues by liquid chromatography/mass spectrometry // J. AOAC Int. - 2005. - V. 88, No 2. - P. 645-653.
11. Korchagin V.B., Satarova D.E., Kochetkova E.V., Mikailova S.M., Druzhinina E.N. Determination of levomycetin in the aerosol preparation "Levovinysol" // Antibiotiki. -1975. - V. 20, No 8. - P. 695-697.
12. Agui L., Guzman A., Yanez-Sedeno P., Pingarron J.M. Voltammetric determination of chloramphenicol in milk at electrochemically activated carbon fibre microelectrodes // Anal. Chim. Acta. - 2002. - V. 461, No 1. - P. 65-73.
13. Wenrui J., Xiaoying Y., Daiqing Y., Qian D. Measurement of chloramphenicol by capillary zone electrophoresis following end-column amperometric detection at a carbon fiber micro-disk array electrode // J. Chromatogr. B: Biomed. Sci. Appl. - 2000. - V. 741, No 2. - P. 155-62.
14. Bautista J.A.G., Mateo J.V.G., Calatayud J.M. Flow injection biamperometric determination of chloramphenicol and related nitro compounds by on-line chemical photodegradation // Anal. Chim. Acta. - 2000. - V. 404, No 1. - P. 141-150.
15. Meulemans A., Henzel D., Brun-PacaudM., Mohler J., Vicart P., Huy P.T. On-line pharmacokinetics of chloramphenicol in rat cortex by in vivo electrochemical detection // Chemotherapy. - 1984. - V. 30, No 6. - P. 353-357.
Поступила в редакцию 27.06.07
Зиятдинова Гузель Камилевна - кандидат химических наук, ассистент кафедры аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета.
E-mail: Ziyatdinovag@mail.ru
Будников Герман Константинович - доктор химических наук, профессор, заведующий кафедрой аналитической химии Химического института им. А.М. Бутлерова Казанского государственного университета.
E-mail: Herman.Budnikov@ksu.ru
Абдуллина Светлана Геннадиевна - кандидат химических наук, старший преподаватель кафедры фармацевтической химии Казанского государственного медицинского университета.
E-mail: s.abdullina@mail.ru
Самигуллин Айдар Ильдусович - студент кафедры аналитической химии Химического института им. А. М. Бутлерова Казанского государственного университета.
