CC BY
19
УДК 616.37; 616-094
Ключевые слова: биоптат поджелудочной железы человека, панкреатит, криптоспоридиоз
Key words: human pancreas bioptate, pancreatitis, cryptosporidiosis
Чумасов Е. И., Майстренко Н. А., Петрова Е. С., Довганюк В. С., Бойко И. Ю.
КРИПТОСПОРИДИАЛЬНАЯ ИНВАЗИЯ В ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЕ ЧЕЛОВЕКА
CRYPTOSPORIDIAL INVASION IN THE HUMAN PANCREAS
'ФГБОУ ВПО «Санкт-Петербургская государственная академия ветеринарной медицины» Адрес: 196084, Россия, Санкт-Петербург, Черниговская ул., 5
'Saint-Petersburg State Academy of Veterinary Medicine Address:196084, Russia, Saint-Petersburg, Chernigovskaya str., 5 2ФГБУ «НИИ экспериментальной медицины» СЗО РАМН Адрес: 197376, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Павлова, 12 2FSBI "Research Institute of Experimental Medicine", North-West Branch of the Russian Academy of Medical Sciences
Address: 197376, Russia, Saint-Petersburg, AkademikPavlov str., 12 3Военно-медицинская академия им. С. М. Кирова. Адрес: 194044, Россия, Санкт-Петербург, ул. Академика Лебедева, 6
3S. M. Kirov Military Medical Academy. Address: '94044, Russia, Saint-Petersburg, Akademik Lebedev str., 6 4ГБУЗ «Ленинградская областная клиническая больница». Адрес: 194291, Россия, Санкт-Петербург, пр. Луначарского, 68 4LeningradRegion Clinical Hospital. Address: 194291, Russia, Saint-Petersburg, Lunacharsky pr., 68
Чумасов Евгений Иванович, д. б. н., проф. каф. гистологии и общей биологии1, вед. научн. сотрудник отдела общей и частной морфологии2
Chumasov Evgenii I., Doctor of Biology Science, Professor of the Dept. of Histology and General Biology', Leading Researcher of the Dept. of General and Special Morphology2 Майстренко Николай Анатольевич, д. м. н., проф., член-корр. РАМН, зав. кафедрой факультетской хирургии3 Maistrenko Nikolai A., Doctor of Medicine, Professor, Corresponding Member of the Russian Academy of Medical Sciences, Head of the Dept. of Surgery3 Петрова Елена Сергеевна, к. б. н., ст. научн. сотрудник отдела общей и частной морфологии2 Petrova Elena S., Ph.D. in Biology Science, Senior Researcher of the Dept. of General and Special Morphology2 Довганюк Виталий Сафронович, д. м. н., проф. кафедры факультетской хирургии3 Dovganuk Vitali S., Doctor of Medicine, Professor of the Dept. of Surgery3 Бойко Ирина Юрьевна, ст. ординатор хирургического отделения4 / Boiko Irina Yu., Chief Resident of the Surgical Dept.4
Аннотация. Объектом исследования служила поджелудочная железа (ПЖ) человека (три случая). Материал был получен в результате биопсии, взятой у больных для подтверждения диагноза «хронический панкреатит». Исследование проводили на парафиновых срезах, используя окраску толуидиновым синим, а также иммуногисто-химические методы выявления синаптофизина, хромогранина А, тиразингидроксилазы и белка ПГП 9,5. В двух случаях был подтвержден этот диагноз. В третьем случае (мужчина, 29 лет) обнаружена аденокарцинома ПЖ. Настоящее исследование является одним из первых, в котором в биопсии головки ПЖ с подозрением на опухоль были выявлены и описаны морфологическими методами криптоспоридии. Большое количество Cryptosporidium parvum обнаружено в развивающейся аденокарциноме и в окружающей соединительной ткани. Установлены структурные особенности паразитов, показаны взаимоотношения и взаимосвязи их с соединительной тканью, эпителием выводных протоков, нервами и сосудами. Выявлена селективная инвазия паразитов в эпителиальные гломерулы и гибель эндокриноцитов опухоли без участия воспалительных элементов. Из нервных аппаратов в биопсии обнаружены только ПГП 9,5+ терминали болевых рецепторов.
Summary. The object of this study was the human pancreas. Material was obtained by biopsy, taken from patients to confirm a diagnosis of chronic pancreatitis. The study was performed on paraffin sections using toluidine blue staining as well as immunohistochemistry methods of detection of synaptophysin, chromogranin A, tyrosine hydroxylase and protein PGP 9.5. In two cases the diagnosis was confirmed. In the third case (male, 29 years old) was found adenocarcinoma pancreas. For the first time Cryptosporidium was identified and was described by morphological methods to biopsy pancreatic head with suspected tumor. A large number of Cryptosporidium parvum were detected in adenocarcinoma and surrounding connective tissue. Structural features of parasites at different stages of the development cycle were established. Relationships parasites with connective tissue elements, epithelium of excretory ducts , nerves and blood vessels were shown. Selective invasion of parasites in the epithelial glomeruli was detected. Endocrine tumor cell death without the participation of inflammatory elements was described. From nervus apparates into biopsies tissues remain mainly PGP 9.5+ terminals of the receptors pains.
Введение
В соответствии с определением ВОЗ криптоспоридиоз (КСПР) отнесен к числу типичных зоонозов, возбудители которых трансмиссируются между позвоночными животными и человеком [1, 4]. Криптоспо-ридии млекопитающих являются внутриклеточными паразитами преимущественно кишечного тракта, хотя они были обнаружены и в других органах животных и человека [7]. По данным эпидемиологических наблюдений, для человека характерны два вида паразитов: Cryptosporidium hominis и С. parvum [3]. Наиболее часто встречающимся и наиболее патогенным является вид C. parvum. Известно, что КСПР заболевают не только дети, но и взрослые здоровые, а также ВИЧ-инфицированные люди с приобретенным или врожденным иммунодефицитом [2, 9 ,11] и др. Болезнь передается через зараженную пищу, животных, через питьевую воду и даже через трансплантируемые органы доноров [8, 9]. Чаще паразиты инфицируют дистальные отделы тонкой кишки. Однако у ВИЧ-инфицированных может быть поражен весь желудочно-кишечный тракт: от ротовой полости до слизистой оболочки прямой кишки. Кроме ЖКТ отмечены случаи поражения дыхательных, желчевыводя-щих и мочеполовых путей. Соответственно с этим, кроме диареи, появляются и другие сопутствующие клинические проявления, такие как холецистит, кашель, затрудненное дыхание и др. Кроме того, многими отмечаются большие трудности в диагностике и отсутствие эффективных медикаментозных средств для лечения КСПР. Из анализа литературы следует, что КСПРЗ человека по сравнению с животными - мало изученная инвазионная болезнь, которая требует тщательного и всестороннего внимания специалистов медико-биологического профиля.
Задача настоящего исследования - провести морфологический анализ трех случаев биопсийного материала, предоставленного кафедрой факультетской хирургии ВМА, на предмет подтверждения и диагностики хронического панкреатита, с обращением особого внимания эксклюзивному случаю наличия опухоли в одном из них.
Материалы и методы
Материал фиксировали в цинк-этанол-формальдегиде и заливали в парафин. Срезы толщиной 5-10 мкм окрашивали гематоксилином-эозином, толуидиновым синим, применяли иммуногистохимические реакции. Для выявления синаптофизина (СФ) - интегрального гликопротеина синаптических мембран - использовали поликлональные кроличьи антитела (Dako, Дания). Для маркирования эндокриноцитов использовали хромогранин А; для выявления нейрофила-ментов (НФ) - моноклональные мышиные антитела к белку нейрофиламентов 2F-11 (Dako, Дания). Для идентификации нервных элементов использовали антитела к протеин-ген продукту 9,5 (PGP 9.5) (1 : 200, Spring Bioscience, США) и к тирозингидрок-силазе (ТН). В качестве вторичных реагентов применяли реактивы из набора Super Sensitive Polymer-HRP Detection Kit HRP/ Dab (Bio Genex, США) и реактивы из набора EnVision+System Labbeled Polymer-HRP Anti-Mouse (K4001) (Dako, Дания).
Результаты исследования
В двух случаях был подтвержден воспалительный хронический панкреатит и представлены патогистологические данные о состоянии экзокринного и эндокринного отделов, нарушении иннервации органа и других изменениях.
В третьем случае при гистологическом исследовании материала в головке органа обнаружена небольших размеров (6 х 11,5 мм) эпителиальная опухоль, предположительно аденокарцинома. Она состоит из многочисленных овальной и сферической формы эпителиальных гломерул диаметром от 50100 мкм, среди которых тут и там встречаются профили выводных протоков, выстланных кубическим эпителием. Эпителиоциты, составляющие гломерулы, плотно прилежат друг к другу, имеют размеры 9-13 мкм, мелкозернистую цитоплазму со светлым ядром. Снаружи гломерулы и очаги пролиферирую-щих выводных протоков окружены соединительнотканными прослойками. В тех местах, где опухолевые клетки непосредственно граничат с ацинусами экзокринных долек,
соединительная ткань слабо выражена или отсутствует.
Эндокринная природа эпителия гломерул отчетливо выявляется с помощью иммуноги-стохимических реакций на хромогранин А, СФ и ПГП 9,5 (рис. 1, б). Опухолевые клетки, так же как клетки островков Лангерганса, избирательно окрашиваются этими методами. Только в отличие от островковых эндо-криноцитов, редко встречающихся в данном материале, опухолевые - окрашиваются не в интенсивно черный, а в светло-коричневый цвет, что, вероятно, связано с нарушением и изменением их функций, межтканевых взаимоотношений и дифференцировкой основных типов клеток островкового аппарата.
Именно этот случай из трех оказался эксклюзивным не только в связи с обнаружением в нем опухолевого роста, но и наличии инфильтрации тканей поджелудочной железы (ПЖ) пациента протистами. С помощью окраски материала толуидиновым синим и анализа срезов с использованием иммерсионной микроскопии нам удалось морфо-
логически идентифицировать эти микроскопические организмы на основании их морфологического сходства с известным, по данным литературы, видом - C. parvum, поражающим, как правило, эпителий тонкой и толстой кишок человека [10].
Топографически наибольшая плотность паразитов выявлена в гипертрофированной оболочке головки органа, откуда они потоками, по соединительнотканным септам, следуют в паренхиму органа. Движение их избирательно направлено к развивающейся эпителиальной опухоли (рис. 1, а). При иммерсионном увеличении микроскопа среди пучков коллагеновых волокон соединительнотканных трабекул выявлены разные по форме и размерам кокцидиоморфные элементы (спорозоиты, мерозоиты, трофозо-иты, меронты и ооцисты, макро- и микро-гамонты). Одни из них - мерозоиты и споро-зоиты, находящиеся в состоянии миграции, имеют червеобразную форму, темное палочковидное ядро и очень истонченные ци-топлазматические отростки, собирающиеся
Рис. 1. Общий вид срезов через биоптат головки поджелудочной железы: а - сегмент дольки органа в области септы; б - фрагмент эндокринной опухоли. ОП - опухолевая ткань, К - мигрирующие тяжи кроптоспоридий, ФТ - фиброзная ткань, ЭГ - эпителиальные глобулы. Толуидиновый синий (а), иммуногистохимическая реакция на хромогранин А (б). Ув. *100 (а); ><400 (б).
Рис. 2. Различные стадии взаимоотношений паразитов с тканями опухоли: а - «пакет» с мерозоитами (ПМ) внутри глобулы; б, в - тяжи мигрирующих мерозоитов (стрелки); ТФ - трофозоиты. Толуидиновый синий. Ув. ><400.
в пучки (рис. 2, б, в). Тела других, находящихся внутри меронтов (рис. 2, а), имеют вид лимонных долек. Размеры мигрирующих форменных элементов варьируют от 3 до 8 мкм. Третьи, лимфоцитоподобной формы клетки - трофозоиты макро- и микрога-монты (размеры 1,5-2 мкм), определяются по маленькому сферическому светлому ядру с одним ядрышком в центре и сильно базо-фильной (в отличие от лимфоцитов) цитоплазме (рис. 2, б).
В некоторых крупных глобулах на месте погибших эпителиоцитов видны тонкостенные «пакеты» - меронты с множеством мерозоитов и трофозоитов (по старой номенклатуре - шизонты), а также стадии разрыва меронтов и выхода из них клеток с образованием тяжей (рис. 2, а, б, в). Перечисленные морфологические наблюдения говорят о том, что сложные циклы развития паразита, включая бесполое и половое размножение, происходят в опухоли основного хозяина. Меронты с мерозоитами и мигрирующие клетки встречаются не только в глобулах, но также вблизи и внутри нервных стволи-
ков и пучков, на месте погибших микрососудов. Изредка ими поражаются ацинусы долек экзокринной железы, расположенных вблизи опухоли. В просветах выводных протоков паразиты не обнаружены. Особое внимание обращают на себя факты выраженной инвазии паразитами глобул. Многие из них проникают в эпителиоциты, вызывают отек, пикноз ядра, вакуолизацию цитоплазмы и гибель клеток (рис. 3).
Исследование иннервации тканей биоптата с помощью иммуногистохимических реакций на Syn, PGP 9.5 и TH показало, что дегенерации подверглись главным образом парасимпатические аппараты интрамуральной нервной системы, в то время как ТН+ и ПГП 9,5+ пучки нервных волокон вокруг сосудов и некоторых выводных протоков, частично оставались интактными (рис. 4, а, б). Любопытен факт обнаружения в гломерулах с помощью реакции на ТН специфических клеток (по 1-2 на гломерулу) с короткими отростками и резко выраженной положительной окраской на ТН. Они располагаются преимущественно по периферии гломерул и по своей природе,
Рис. 3. Инвазия глобул паразитами и дегенерация эндокриноцитов. Иммуногистохимическая реакция на ПГП 9,5; окраска толуилиновым синим. Ув. ><400 (а, б); ув. *Ш00 (в, г).
возможно, относятся к серотонинергическим элементам эндокринной системы (рис. 4, в).
Следует отметить еще две характерные особенности. Первая - заключается в том, что ни в опухоли, ни в окружающей соединительной ткани не обнаружены воспалительные инфильтраты. Вторая - в том, что в исследуемом материале в большом количестве избирательно выявляются с помощью толуидинового синего тучные клетки (ТК). Последние встречаются не только в окружа-
ющей соединительной ткани оболочки органа и трабекулах, но и внутри развивающейся опухоли. По нашему мнению, ТК способствуют интенсивной стимуляции роста соединительной ткани опухоли, вызывая фиброз вокруг гломерул, и тем самым способствуют изоляции их друг от друга (рис. 1, а).
Обсуждение результатов исследования
Во многих работах, посвященных крипто-споридиозу животных и человека [2, 5, 8, 9,
Рис. 4. Измененные нервные аппараты (а, б) и специализированные ТН-иммунопозитивные клетки в гломерулах (в); стрелки - скопления инвазивных трофозитов: а - зернистый распад синаптофин-иммунопозитивных терми-налей нервного сплетения сосуда; б - ПГП 9,5 - положительные волокна в нервном пучке; в - специализированные тирозингидроксилаза-положительные в эпителиальных глобулах. ГЛ - глобулы. Иммуногистохимическая реакция на синаптофизин (а), на ПГП 9,5 (б), на тирозингидроксилазу (в). Ув. ><400.
11], сообщается о значительных трудностях диагностики этой болезни: по копрологиче-ским пробам, полимеразной цепной реакции, in vivo, анализа биопсийного материала с помощью морфологических методов. У человека, как и у животных, болезнь связана, главным образом, с кишечным трактом, с энтероцитами слизистой оболочки тонкого и толстого кишечника [1, 6 и др.]. Криптоспо-ридии находятся чаще всего на поверхности микроворсинок энтероцитов, заключенными в паразитоморфные вакуоли. Обнаружение и локализация криптоспоридий в других органах, и в частности в ПЖ, еще недостаточно изучены. Поэтому мы бы хотели остановится на двух близких по данной тематике случаях биопсий. Один из них - «Случай спорадического интестинального КСПР, диагностированного по эндоскопической биопсии» [12], другой - «Криптоспоридиоз билиарного тракта, мимикрирующий панкреатическую опухоль у пациента с иммунодифицитом [6]. В первом случае в биопсийном материале,
взятом под эндоскопическим контролем из участка с признаками воспаления подвздошной кишки, авторы обнаружили гистологически и описали электронномикроскопиче-ски наличие в эпителии слизистой оболочки ооцист с меронтами и макрогамет. Во втором случае исследовался материал головки ПЖ, удаленной по поводу подозрения на неопла-зию. На основании гистологии авторами был поставлен диагноз - гнойный холангит, связанный с криптоспоридиальной инвазией. К сожалению, на единственной иллюстрации, при малом увеличении микроскопа, с трудом удается определить среди эпители-оцитов кокцидиоморфных паразитов. В отличие от вышеперечисленных работ в нашей работе криптоспоридии были обнаружены и описаны непосредственно в паренхиме головки органа у человека.
Спорным является вопрос о проникновении криптоспоридий в поджелудочную железу человека. В монографии Бэйер (1986) [1] имеются две ссылки на работы, касающие-
ся обнаружения этого вида паразитов в выводном протоке железы у макаки-резус и человека. В нашей работе паразиты не были обнаружены в выводных протоках. Миграция споровиков в головку поджелудочной железы отчетливо прослеживалась по соединительнотканным септам органа, в направлении развивающейся аденокарцино-мы, которую они интенсивно инвазировали. На основании этого мы считаем, что споровики данного вида проникают в паренхиму ПЖ не через систему выводных протоков, а по подлежащей соединительной ткани.
Заключение
Анализ специальной литературы позволяет заключить, что настоящее исследование является одним из первых, в котором крип-тоспоридии были выявлены и описаны морфологическими методами в биопсии головки ПЖ человека с подозрением на опухоль. С помощью окраски толуидиновым синим и иммуногистохимических методов в окружающей соединительной ткани и в развивающейся аденокарциноме обнаружено большое количество С. ратупт. Установлены структурные особенности паразитов, показаны взаимоотношения и взаимосвязи их с соединительной тканью, эпителием выводных протоков, нервами и сосудами. Выявлена селективная инвазия паразитов в эпителиальные гломерулы и гибель эндокриноцитов опухоли без участия воспалительных элементов. Из нервных аппаратов в биоптате данного случая обнаружены главным образом ПГП 9,5+ терминали, которые, по нашему мнению, относятся к болевым рецепторам.
Список литературы
1. Бейер, Т. В. Клеточная биология споровиков -возбудителей протозойных болезней животных и человека. - Л. : Наука, 1986. - 184 с.
2. Acikgoz, Y. Cryptosporidiosis: a rare and severe infection in a pediatric renal transplant recipient / Y. Acikgoz, O. Ozkaya, K. Bek., G. Genc, S. G. Sensoy, M. Hokelek // Pediatr Transplant., 2012. - Vol. 16.(4). -P. 115-119.
3. Ayinmode, A. B. Cryptosporidium zoonosis in Nigeria / A. B. Ayinmode, B. O. Fagbemi // Afr. J. Biomed // Res., 2009. - Vol. 12 (3). - P. 157-160.
4. Casemore, D. P. Cryptosporidia! infection, with special referens to nosocomial transmission of Cryptosporidium parvum: a review / D. P. Casemore, C. A. Garder, C. OMahony // Folia Parasitol., 1994. -Vol. 41.(1). - P. 17-21.
5. Chen, X. M. Cryptospjridium parvum is cytopathic for cultered human billiare epithelia via an apoptotic mechanism / X. M. Chen, S. A. Levine, P. Tietz, E. Krueger, M. A. McNiven, D. M. Jefferson, M. Mahle, N. F. LaRusso // Hepatology, 1998. - Vol. 28.(4). -P. 906-913.
6. De Sousa, L. R. Cryptosporidiosis of the biliary tract mimicking pancreatic cancer in an AIDS patient / L. R. De Sousa, V. A. M. Rodrigues, H. Morceli, R. Kemp, R. P. Mendes // Rev. Soc. Bras. Med. Trop., 2004. -Vol. 37.(2). - P. 182-185.
7. Fayer, R. Cryptosporidium spp. and cryptosporidiosis / R. Fayer, B. L. P. Ungar // Microbiol. Rev., 1986. - Vol. 50 (1). - P. 458-483.
8. Hong, D. K. Severe cryptosporidiosis in a seven-year-old renal transplant recipient: case report and review of the literature / D. K. Hong, C. J. Wong, K. Gutierrez // Pediatr Transplant., 2007. - Vol. 11 (1). - P. 94-100.
9. Krause, I. Cryptosporidiosis in children following solid organ transplantation / I. Krause, J. Amir, R. Cleper, A. Dagan , J. Behor, Z. Samara , M. Davidovits // Pediatr. Infect. Dis. J., 2012. - Vol. 31 (11). - P. 1135-1138.
10. Li, N. Subtyping Cryptosporidium ubiquitum, a Zoonotic Pathogen Emerging in Humans / N. Li, L. Xiao, K. Alderisio, K. Elwin, E. Cebelinski, R. Chalmers, M. Santin, R. Fayer, M. Kvac, U. Ryan, B. Sak, M. Stanko, Y. Guo, L. Wang , L. Zhang, J. Cai, D. Roellig, Y. Feng // Emerg. Infect. Dis., 2014. - Vol. 20(2). - P. 217-224.
11. Nime, F. A. Acute enterocolitis in a human being infected with the protozoon Cryptospjridium / F. A. Nime, J. D. Burek, D. L. Page, M. A. Holcher, J. H. Yardley // Gastroenterology, 1976. - Vol. 70 (1). - P. 592-598.
12. Ogata, S. A case of sporadic intestinal cryptosporidiosis diagnosed by endoscopic biopsy / S. Ogata, T. Suganuma , C. Okada, K. Inoue, A. Kinoshita, K. Sato // Acta. Med. Okayama, 2009. - Vol. 63 (5). -P. 287-291.
TO 2 TO
с
u
Проконсультируйся по УЗИ- и (или) рентгенодиагностике на специальных ветках ФОРУМА: www.ivb.forum24.ru
