CC BY
85mance / J.P. McClung, E. Gaffney-Stomberg, J.J. Lee // J. Trace Elem. Med. Biol. -2014. - Vol. 28, № 4. - P. 388-392.
3. Разработка алгоритма оценки пищевого статуса юных спортсменов / Топанова А.А. [и др.]. // Профилактическая и клиническая медицина. - 2008. -№ 1. - С. 35-38.
4. Зайцева, И.П. Влияние физической нагрузки на содержание макро- и микроэлементов в волосах девушек / И.П. Зайцева // Микроэлементы в медицине. - 2015 - № 16, т. 1. - С. 36-40.
5. Volpe, S.L., Nguyen, H. Vitamins, minerals and sport performance. In: Maughan R.J. (ed) The Encyclopaedia of Sports Medicine: An IOC Medical Commission Publication. - 2013. - Vol. 19, John Wiley & Sons Ltd, Chichester, UK.
6. Биоэлементный статус населения Беларуси: экологические, физиологические и патологические аспекты / ред. Н.А. Гресь, А.В. Скального. - Минск: Харвест, 2011. - 350 с.
7. Элементоз избытка алюминия / ред.: Н.А. Гресь, Е.И. Слобожанина, Е. Гузик // LAP Lambert Academic Publishing, 2014. - 110 с.
8. Троегубова, Н.А. Метаболизм макро- и микроэлементов у юных спортсменов / Н.А. Троегубова, Н.В. Рылова, P.P. Гильмутдинов // Практическая медицина. - 2015. - № 3(88), том 1. - С. 69-72.
9. Особенности элементного состава волос профессиональных футболистов / З.Г. Орджоникидзе [и др.] // Микроэлементы в медицине. - 2003. - № 4(4). -С. 25-29.
10. Скальный, А.В. Макро и микроэлементы в физической культуре и спорте / Скальный, А.В., Орджоникидзе, З.Г., Громова, О.А.. - М.: КМК, 2000. - 71 с.
11. Bunner, S.P. Chromium-induced hypoglycemia / S.P. Bunner, R. McGinnis - Psychosomatics. - 1998. - Vol. 39, № 3, - P. 298-299.
12. Serum zinc and blood rheology in sportsmen (football players) / S. Khaled [et al.]. - Clin. Hemorheol. Microcirc. - 1997. - Vol. 17, № 1. - P. 47-58.
13. Neuroendocrine responses to running in women after zinc and vitamin E supplementation / A. Singh [et al.]. - Med. Sci. Sports Exerc. 1999. - Vol. 31, № 4. -P. 536-542.
16.05.2017
УДК 611.013
КРИОКОНСЕРВАЦИЯ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК: ПРАКТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ И ПРЕИМУЩЕСТВА
С. В. Пинчук, канд. биол. наук,
Л. В. Дубовская, канд. биол. наук, доцент,
ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси»;
Г. М. Загородный, канд. мед. наук, доцент,
Государственное учреждение «Республиканский научно-практический
центр спорта», Республика Беларусь;
И. Д. Волотовский, д-р биол. наук, профессор, академик
ГНУ «Институт биофизики и клеточной инженерии НАН Беларуси»
Аннотация
Стволовые клетки - это материал, максимально адаптированный для восстановления пораженного болезнью организма. Иммунорегуляторные и регенеративные свойства мезенхимальных стволовых клеток (МСК) делают их удобным материалом для использования в качестве терапевтических агентов
в спортивной медицине. В настоящее время можно успешно осуществить процедуру трансплантации в организм пациента биоматериала в виде стволовых клеток, который хранился в банке. Криохранение аутологичных МСК в банке имеет такие преимущества, как полная безопасность и оперативность получения клеточного продукта. Разработаны методы, позволяющие эффективно криоконсервировать МСК с сохранением высокой жизнеспособности и функциональной активности клеток.
CRYOPRESERVATION OF STEM CELLS: PRACTICAL ASPECTS
AND ADVANTAGES
Annotation
Stem cells are established to be a material that is excellently adapted to restore an injured organism. Immunoregulatory and regenerative properties of mesenchymal stem cells (MSCs) make them a convenient material for use as therapeutic agents in sports medicine. It is currently successfully possible to carry out the transplantation into the patient's body of a biomaterial in the form of stem cells, which was stored in a stem cell bank. Cryopreservation of autologous MSCs in a bank has such advantages as complete safety and immediacy of obtaining a cellular product. Methods that make it possible to effectively cryoconserve MSCs so maintaining high viability and functional activity of cells have been developed.
Введение.
Мезенхимальные стволовые клетки (МСК) являются объектом многочисленных исследований в различных областях биологии и медицины. Они представляют собой популяцию мультипотентных недифференцированных адге-рентных к пластику клеток, способных к дифференцировке в клетки хрящевой, костной, жировой и других тканей. МСК могут быть получены из костного мозга, жировой ткани, пуповины и других источников. Отличительной особенностью МСК, определяющей их преимущество по сравнению с другими стволовыми клетками, например гемопоэтическими клетками пуповинной крови, является их наличие в органах и тканях взрослого организма, что позволяет выделять стволовые клетки практически в любом возрасте и использовать в клинической практике аутологичный клеточный продукт. Важным свойством МСК является их способность дифференцироваться в различные типоспецифические клетки. Остеогенная, адипогенная и хондрогенная дифференцировка МСК является одним из идентификационных признаков данных клеток. Кроме этого МСК эффективно дифференцируются в кардиомиоциты, гепатоциты, а также клетки нервной ткани [1]. Высокая пролиферативная активность и мультили-нейный дифференцировочный потенциал МСК определяют перспективность их клинического применения в регенеративной медицине [2].
Помимо своей уникальной способности дифференцироваться в различные типы клеток, МСК обладают паракринным действием, то есть они способны секретировать цитокины, обладающие противовоспалительной активностью, и создавать анаболическое микроокружение. МСК обладают способностью мигрировать к участкам ткани, в которых развивается воспалительный процесс. Кроме того, было показано иммуномодулирующее влияние прямого контакта клетка-клетка. При определенных условиях МСК могут размножаться in vitro и оказывать влияние на клетки других типов, поэтому они идеально подходят для лечения воспалительных и системных аутоиммунных заболеваний. МСК также являются признанными ключевыми участниками в регенерации тканей, по-
врежденных в результате ранений и травм. Эксперименты in vivo и первые клинические опыты подтвердили способность МСК внедряться в различные поврежденные ткани, дифференцироваться в тканеспецифические клетки и таким образом компенсировать утраченные клеточные функции. Иммунорегуля-торные и регенеративные свойства МСК делают их удобным материалом для использования в качестве терапевтических агентов в спортивной медицине, в частности, для лечения повреждений мышечно-скелетной системы [3].
Уже сегодня стволовые клетки с высокой эффективностью используются в мире для лечения сердечно-сосудистых, нервно-дегенеративных заболеваний, патологий печени, восстановления костных и хрящевых структур, дефектов кожи и многих других заболеваний, с трудом поддающихся традиционному лечению (всего около 150 заболеваний). В Республике Беларусь зарегистрировано и разрешено к применению более 30 методов лечения с использованием различных биомедицинских клеточных продуктов. В ведущих республиканских научно-практических центрах страны широким фронтом проводятся разработки новых методов. Спектр приложения стволовых клеток будет стремительно расширяться, а эффективность их применения увеличиваться.
Вместе с тем, практическое использование МСК в спортивной медицине требует наличия определенных запасов биологического материала, позволяющего оперативно изготавливать клеточные трансплантаты, возможности транспортировки материала на значительные расстояния с целью доставки в специализированные медицинские центры, в том числе зарубежные. Решение таких задач неразрывно связано с разработкой методов консервации клеток, представляющей собой длительное хранение при ультранизких температурах в условиях, позволяющих в кратчайшие сроки восстановить их биологические функции после размораживания. Такие задачи особенно актуальны в случае чрезвычайной ситуации, болезни, травмы или несчастного случая в будущем. Обычно период времени от выделения клеток из ткани до выращивания биомассы стволовых клеток до требуемого терапевтического количества составляет около месяца. Тогда как восстановить клетки из замороженного состояния можно в течение 1-3 дней.
Индивидуальное хранение биологического материала стало возможным благодаря созданию банков стволовых клеток. В настоящее время в мире функционируют около 500 банков пуповинной крови, эмбриональных клеток и стволовых клеток взрослого организма, создание которых стало возможным после открытия технологии хранения биологического материала в жидком азоте при сверхнизких температурах в течение длительного периода времени.
Криобанки, специализирующиеся на хранении клеток взрослого организма, обычно выделяют и криоконсервируют полученные из жировой ткани ме-зенхимальные стволовые клетки для аутологичного использования врачами. Это означает, что жир (жировая ткань) человека является источником их собственных взрослых стволовых клеток, которые используются только индивидуально для этого человека. Полученные из жировой ткани клетки обладают способностью восстанавливать кости, мышцы, хрящи, стимулировать образование кровеносных сосудов и нервной ткани.
Основным направлением деятельности Республиканского научно-медицинского центра (РНМЦ) «Клеточные технологии», созданного при Институте биофизики и клеточной инженерии Национальной академии наук Беларуси, является разработка и совершенствование методов выделения, наращивания, хранения и использования аутологичных стволовых клеток, выделенных из различных тканей взрослого организма. Культура мезенхимальных стволовых кле-
ток жировой ткани человека, производимая в центре в соответствии с международным стандартом GMP, прошла все необходимые испытания, зарегистрирована в Министерстве здравоохранения Республики Беларусь как биомедицинский клеточный продукт и разрешена к клиническому применению.
Банк стволовых клеток РНМЦ «Клеточные технологии» был создан в 2014 г. Его отличительной особенностью является то, что он предлагает криохране-ние клеток не пуповинной крови, а стволовых клеток, выделенных из собственного биологического материала (жировой ткани) взрослых. Собственные методы выделения и криоконсервации стволовых клеток обеспечивают генетическую целостность и однородность культур клеток человека в количествах, необходимых для терапевтического применения. Затем индивидуум может использовать свои сконцентрированные стволовые клетки для регенеративной терапии через инфузии или инъекции.
Основными критериями успешной криоконсервации является сохранение жизнеспособности клеток и их функциональных свойств после воздействия сверхнизких температур. Если условия замораживания и криохранения МСК достаточно изучены [4], то вопросы функционального состояния МСК после размораживания остаются малоисследованными. Открытыми остаются проблемы динамики изменения функционального состояния МСК после отогрева, а также сохранения клетками пролиферативного потенциала и иммунофенотипа.
Цель исследования
Целью исследования являлось изучение жизнеспособности МСК в различные сроки после размораживания, установление основных мишеней криопов-реждений клеток, определяющих их состояние после криоконсервации, а также подбор приемов коррекции функционального состояния клеток после отогрева.
Методы и организация исследования
Участники включались в исследование после сдачи анализов крови на предмет приемлемости для банков (подтверждение отрицательного результата на наличие гепатита В и С, ВИЧ и сифилиса), а также других необходимых предварительных тестов. Выделение МСК проводили согласно методике, описанной ранее [5], из жировой ткани, полученной хирургическим путем из области пупка. Эксплантация жировой ткани представляла собой простую, практически безболезненную амбулаторную процедуру, занимающую не более часа. Для криоконсервирования МСК в суспензии клеток в ростовой среде добавляли соответствующие криопротекторы. Далее клетки охлаждали градиентно до минус 120°С и помещали в жидкий азот. Размораживание МСК осуществляли помещением извлеченных из жидкого азота клеток в водяную баню (37 °С). После оттаивания в суспензию добавляли ростовую среду. Для определения иммунофенотипа МСК клетки инкубировали с меченными флуорохромами антителами к антигенам СЭ29, СЭ44, СЭ90 и СЭ105 в разведении согласно инструкции фирмы-производителя и анализировали методом проточной цитофлуориметрии. Влияние криоконсервации на жизнеспособность МСК анализировали с использованием флуоресцеин диацетата и пропидиум иодида [6]. Внутриклеточное содержание свободных ионов кальция определяли с использованием флуоресцентного зонда Р!ио-3ДМ. Вязкость липидного бислоя плазматической мембраны клеток оценивали по степени поляризации флуоресценции зонда 1,6-дифенил-1,3,5-гексатриена (ДФГТ). Пролиферативную активность МСК оценивали по индексу пролиферации, определяемому как отношение количества клеток после культивирования к количеству клеток при посеве.
Результаты исследования и их обсуждение
Наши исследования показали, что после замораживания МСК сразу после отогрева (10-15 мин) жизнеспособными остаются 75-85 % клеток. Криоконсер-вированные МСК сохраняют высокий пролиферативный потенциал (таблица 1) и иммунофенотип (таблица 2).
Таблица 1 - Влияние криоконсервации на индекс пролиферации МСК
До криоконсервации, n=2 До криоконсервации, n=4 После криоконсервации, n=2 После криоконсервации, n=4
2,10+0,15 1,81+0,15 1,98+0,10 1,75+0,10
Таблица 2 - Влияние криоконсервации на иммунофенотип МСК
Маркеры
CD29+, % CD44+, % CD90+, % CD105+, %
До криоконсервации 99,6 96,4 99,8 99,6
После криоконсервации 99,7 95,8 100 99,2
Высокие показатели количества жизнеспособных клеток сразу после размораживания, пролиферативной активности и сохранения профиля иммунофе-нотипа свидетельствуют о том, что условия криоконсервации МСК достаточно эффективны. В то же время, изучение жизнеспособности МСК в более отдаленные сроки после размораживания позволило установить факт быстро развивающейся гибели клеток при их инкубации в питательной среде при комнатной температуре (рисунок 1). Сроки и условия инкубации МСК в данной ситуации моделируют условия нахождения (транспортировки) клеточных продуктов в период между их изготовлением и клиническим применением. Следует отметить, что до криоконсервации количество жизнеспособных МСК в таких условиях инкубации снижается не более чем на 5-10%.
N, %
100 80 60 40 20 0
□Жив ШНекр ШАпопт
10 мин
60 мин
120 мин
Рисунок 1 - Динамика изменения жизнеспособности криоконсервированных МСК после размораживания без культивирования
Быстро развивающаяся гибель МСК сразу после размораживания ставит под сомнение эффективность их клинического применения в таком режиме. В связи с этим было проведено изучение жизнеспособности криоконсервированных МСК в разные сроки культивирования клеток. Для этого сразу после размораживания клетки переводили в полную ростовую среду и культивировали в течение 1-3 суток в СО2 инкубаторе при 37°С. Оказалось, что через сутки после
культивирования в культуре криоконсервированных МСК количество жизнеспособных клеток составляет около 77 % и содержится значительное количество клеток в состоянии некроза или апоптоза (рисунок 2).
N. %
120 100 80 60 40 20 0
Рисунок 2 - Динамика изменения жизнеспособности в культуре МСК при культивировании криоконсервированных клеток
Через 2 суток количество жизнеспособных клеток увеличивается до 92 %, а через 3 суток до 94 %, при этом содержание в культуре некротических и апоптотических клеток существенно снижается. При культивировании МСК, не подвергавшихся криоконсервации, количество жизнеспособных клеток находится в диапазоне 94-98 %.
В совокупности полученные результаты показывают, что, несмотря на высокий выход жизнеспособных клеток сразу после размораживания, в результате криоповреждений, МСК определенный период уязвимы к действию стрессовых факторов. К стрессовым факторам в проведенных выше экспериментах следует отнести инкубацию клеток в питательной среде (без сыворотки), что отличается от условий культивирования в ростовой среде, а также лабораторные манипуляции при переводе культивированных МСК из монослоя в суспензионное состояние: трипсинизация, центрифугирование, ресуспендирование. В результате культивирования криоконсервированных МСК (по крайней мере, в течение 2-3 суток) наблюдается репарация криоповреждений и восстановление функциональных свойств клеток в отношении их устойчивости к неблагоприятным воздействиям.
Известно, что одной из мишеней криоповреждений различных типов клеток является плазматическая мембрана. С целью оценки роли криоповреждений плазматической мембраны в функционировании криоконсервированных МСК проведено исследование вязкости ее липидного бислоя и барьерные свойства в отношении ионов кальция. Проведенные эксперименты показали, что степень поляризации флуоресценции ДФГТ в суспензии не криоконсервированных МСК составляет 0,215+0,003 при температуре 37° С. В суспензии МСК сразу после процедуры замораживание/оттаивание степень поляризации флуоресценции составляет 0,227+0,005, т.е. увеличивается. Однако после культивирования криоконсервированных клеток в течение 3 суток наблюдается снижение вязкости липидного бислоя до уровня, соответствующего контрольным клеткам: степень поляризации флуоресценции в таких клетках составляет 0,218+0,005. Согласно данным литературы повреждение белков и липидов мембран лежит в основе увеличения вязкости липидного бислоя клеток [7]. Схожая картина наблюдается при определении концентрации ионов кальция. В МСК до криокон-
- ШЖив □ Некр ПАпопт
Г1"!
- Г1-!
- —
сутки 2 суток 3 суток
сервации концентрация данных ионов составляет 122 ±11 нМ. Через сутки после культивирования криоконсервированных клеток концентрация ионов возрастала до 159 ±15 нМ, а через 3 суток снижалась до 128+14. Увеличение содержания ионов кальция внутри клетки свидетельствует о нарушении барьерных свойств мембран и/или мембранных транспортных систем. Приведенные данные показывают, что при культивировании криоконсервированных МСК проис-ходит репарация повреждений плазматической мембраны, при этом динамика данного процесса близка к динамике восстановления жизнеспособности клеток. Этот факт позволяет предполагать, что криоповреждения плазматической мембраны МСК лежат в основе снижения устойчивости клеток к стрессовым воздействиям, а эффективная репарация повреждений плазматической мембраны обеспечивает восстановление функционального состояния клеток в целом.
Таким образом, показано, что использование криопротекторов позволяет эффективно криоконсервировать МСК с сохранением высокой жизнеспособности клеток. С целью восстановления функциональных свойств клеток в отношении их устойчивости к неблагоприятным воздействиям целесообразно проводить рекультивирование криоконсервированных МСК, по крайней мере, в течение 2-3 суток после отогрева.
Заключение
Криохранение собственных стволовых клеток важно для любого человека, так как необходимость их использования в будущем может возникнуть у каждого (в случае чрезвычайной ситуации, болезни, травмы или несчастного случая в будущем).
Криохранение аутологичных МСК, выделенных из жировой ткани, имеет ряд важных преимуществ. Во-первых, к достоинствам методов применения собственных стволовых клеток, прежде всего, нужно отнести полную безопасность такого клеточного продукта, поскольку используется материал, забранный у самого пациента, следовательно, отпадет проблема иммунологической несовместимости тканей донора и реципиента. Более того, жировая ткань является доступным источником стволовых клеток, а современные методики ее эксплантации являются простыми и малотравматичными. Кроме этого, криохранение МСК имеет такое преимущество, как оперативность получения клеточного продукта. Восстановить клетки из замороженного состояния можно в течение 1-3 дней. Наконец, существует возможность закладки клеточного материала на хранение практически в любом возрасте, однако терапевтический потенциал стволовых клеток, выделенных в молодом возрасте, значительно выше.
Индивидуальное хранение клеточного биологического материала в настоящее время возможно благодаря созданию банков стволовых клеток. Современная биомедицинская наука накопила наработки, благодаря которым можно успешно осуществить процедуру трансплантации в организм пациента биоматериала в виде стволовых клеток, который хранился в банке. В частности, для криохранения в РНМЦ «Клеточные технологии» используется современное, высокотехнологическое и надежное оборудование, которое прошло аттестацию на соответствие международным стандартам СМР. Специалисты центра разработали технологические приемы криозамораживания каждого типа клеток, подобрали наиболее эффективные криопротекторы, используют наиболее щадящую процедуру постепенного контролируемого замораживания. Криохранение осуществляется в специальных криохранилищах, обеспечивающих температуру жидкого азота. В этих условиях клетки полностью защищены от внешних воздействий и сохраняют максимальную жизнеспособность и биологическую активность на протяжении практически неограниченного периода времени.
Список использованных источников
1. Kern S. Comparative analysis of mesenchymal stem cells from bone marrow, umbilical cord blood, or adipose tissue / S. Kern [et al.] // Stem cells. - 2006. - Vol.24, № 5. - P.1294-1301.
2. Han Dave L.Y. Mesenchymal Stem Cell Therapy in the Sports Knee / L.Y. Han Dave [et al.] // Sports Health. - 2012. - Vol.4, № 3. - P. 252-257.
3. Загородный Г.М. Мезенхимальные стволовые клетки и их применение при лечении травм опорно-двигательного аппарата / Г.М. Загородный [и др.] // Новости медико-биологических наук - 2016. - Т. 13, № 2. - С.151-158.
4. Naaldijk Y., Staude M., Fedorova V., Stolzing A. Effect of different freezing rates during cryopreservation of rat mesenchymal stem cells using combinations of hydroxyethyl starch and dimethylsulfoxide / Y. Naaldijk, M. Staude, V. Fedorova, A. Stolzing // BMC Biotechnology. - 2012. - 12:49.
5. Баранов E.B. Клинические возможности применения аутологичных мезенхимальных стволовых клеток жировой ткани при лечении пациентов с трофическими язвами нижних конечностей / Е.В. Баранов [и др.] // Клеточная трансплантология и тканевая инженерия. - 2013. - T.VIII, № 2.- С. 79-84.
6. Пинчук С.В. Регуляторные свойства кверцетина в культурах мезенхимальных стволовых клеток / Пинчук С.В. [и др.] // Доклады НАН Беларуси. -2015. - Т. 59, № 1 - С. 90-95.
7. Beccerica E. Changes of lymphocyte membrane fluidity in rheumatoid arthritis: a fluorescence polarization study / E. Beccerica, G. Piergiacomi, G. Curatola, G. Ferretti // Annals of the Rheumatic Diseases. - 1988. - Vol. 47, № 3. -P.472-477.
15.05.2017
УДК 37.037.2
СИСТЕМА МНОГОЛЕТНЕЙ ПОДГОТОВКИ ГРЕБЦОВ НА БАЙДАРКАХ В СТРУКТУРЕ ОЛИМПИЙСКОГО ЦИКЛА
В. В. Шантарович,
Министерство спорта и туризма Республики Беларусь
Аннотация
Представлены теоретические и практические аспекты системы подготовки гребцов на байдарках в процессе многолетней подготовки спортсменов. Дается оценка специфических особенностей системной организации показателей морфофункционального статуса спортсменов-гребцов в различные периоды подготовки; показаны критерии успешной целенаправленной деятельности в спорте высших достижений.
THE LONG-TERM TRAINING OF ROWERS IN THE STRUCTURE
OF THE OLYMPIC CYCLE
Annotation
The article represents the theoretical and practical aspects of the rowers' training system of kayakers from many years of training athletes. The assessment of specific features of morphofunctional status indexes' system organization of sportsmen-rowers in different periods of training is given; criteria of successful and goal-directed activities of high performance sport are shown.
