CC BY
100
УДК 61:577.1
Васильева И.Г., Олексенко Н.О., Пусь А.С., Макаренко А. Н.
ВЛИЯНИЕ АНТИГИПОКСИЧЕСКОГО СРЕДСТВА МИТОХОНДРИНА НА МЕЗЕНХИМАЛЬНЫЕ СТВОЛОВЫЕ КЛЕТКИ, ПОЛУЧЕННЫЕ ИЗ РАЗНЫХ ТКАНЕЙ
ГУ “Институт нейрохирургии НАМНУ им. акад. А.П.Рамаданова”
Киевский национальный университет имени Тараса Шевченко
Проведены исследования возможного влияния антигипоксического средства митохондрина на ме-зенхемальные стволовые клетки (МСК), полученные из жировой ткани и костного мозга. Установлено, что молекулы средства Митохондрина (0,1 мк/кг однократно) достоверно не влияют на процессы и метаболизм клеток обеих линий МСК различного происхождения.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки (МСК), костный мозг, жировая ткань, маркеры, митохондрин.
Введение
В настоящее время внимание исследователей сосредоточено на новом разделе медицины - выделении и накоплении аутологичных МСК, обладающих значительным регенеративным потенциалом. Ранее основным источником МСК в организме взрослого донора служил костный мозг, но впоследствии источником аутологичных МСК стали жировая ткань, кожа, тимус, ткань пуповина и плацента, и некоторые другие. Эти ткани более доступны для выделения МСК, а содержание последних в них не только не уступает, но в некоторых случаях и превосходит костный мозг [3]. В группу МСК человека относят клетки с положительным имунофенотипом, оцениваемым по следующим маркерам - CD2, CD29, CD44, CD49, CD54 CD73, CD90, CD105, CD166, при этом все культивируемые МСК экспрессируют значительное количество молекул HLA-I и виментина [4]. Экспрессия ряда выявляемых молекул - маркеров МСК (CD54, CD105, CD106, CD117) варьирует в широких пределах и зависит в первую очередь от стадии роста культур. Поэтому необходимо подчеркнуть, что на сегодняшний день иммунологический статус МСК не исследован и во многом остается дискуссионным, а наличие МСК в клеточной популяции исследуют по наличию 2 маркеров -CD90- или CD105. Тем не менее имеющаяся методическая база позволяет использовать культивируемые МСК в качестве тестовой системы для изучения влияния лекарственных средств и препаратов на регенеративный потенциал клеток организма. В даном исследовании с этой целью использовался инвазивный ор-ганеллопрепарат, полученный из митохондрий нерожденных млекопитающих, обладающих ан-тигипоксическим и нейропротекторным дейсвти-ем [5,6].
Объект и методы исследования
Исследования выполняли на клеточном материале, полученном из тканей организма во время хируригических операций (ампутация нижних конечностей и липосакция) в городских больницах №4, №8 и в областной клинической больнице города Киева. Донорами клеточного
материала стали 3 мужчин в возрасте от 38 до 64 лет.
Приготовление растворов митохондрина: основной раствор митохондрина получали из лиофилизованного концентрата путем разведения стерильным физиологическим раствором при 4°С, осторожно перемешивая до полного растворения осадка. В дальнейшей работе полученный раствор разводили культуральной питательной средой до концентрации 1 и 10% и вносили в тестируемые образцы.
Свежие порции митохондрина вышеуказанных концентраций вносили по мере замены питательной среды в культуральных образцах.
Выделение и культивирование МСК (мезенхимальных стволовых клеток) из костного мозга: 20-25 мл аспирата костного мозга в стерильных условиях извлекали из бедренной кости путем использования пцнкционной иглы. Аспират смешивали с 2 объемами раствора Хэнкса (РАА, Австрия) и центрифугировали при 900g на протяжении 10 мин с целью получения осадка и супернатанта[1].
Полученный осадок разделяли в градиенте плотности (1,073 г/мл) перколла (Sigma, Германия), а клеточную плотность - 1-2 х 107 кл/мл. Данный градиент центрифугировали в течение 30 мин. при 900g. Осажденные таким образом мононуклеарные клетки ресуспендировались в растворе Хэнкса и центрифугировалисьв течение 10 мин при 460g [1].
Полученный клеточный осадок повторно ре-суспендировали в среде Игла в модификации Dulbecco с низким содержанием глюкозы (рАа, Австрия), обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой (РАА, Австрия), целью получения клеточной концентрации 1 х 106 в чашке Петри диаметром 100 мм. Клеточную суспензию помещали в инкубатор (УЛИ-20, Украина) при 37°С, с содержанием СО2 в среде 5%. Через 24ч надосадок отбирался, при этом адгезированную фракцию подвергали дальнейшему культивированию. В опытные образцы добавляли 10% раствор тестируемого средства. Культивирование клеток проводили на протяжении 14 суток с обязательной заменой питательной среды через 34 суток.
Выделение и культивирования МСК из жиро-
вой ткани: аспират жировой ткани, полученный при проведении больным липосакции, промывали раствором Хэнкса (РАА, Австрия) для удаления клеток крови и снижения в ткани содержания лекарственных препаратов для анастезии.
Для получения клеточной фракции из экс-траклеточного матрикса ткань обрабатывали 0,075% раствором фермента коллагеназы (Sigma, Германия) на протяжении 30 мин (температура +37 °С). Затем коллагеназу инактивировали смесью равных объемов среды Игла с добавлением средства Dulbecco (DMEM) (РАА, Австрия), обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой (РАА, Австрия) [2].
Полученную смесь центрифугировали в течение 10 мин на центрифуге (Опн-8, Россия) при 250g. Клеточный осадок ресуспендировали в среде DMEM с низким содержанием глюкозы и обогащенной 10% фетальной телячьей сывороткой, а затем разливали в стерильные чашки Петри [2].
Плотность посадки клеток составляла не менее 1 х 106 клеток на чашку Петри диаметром 100мм. Последнее культивирование проводили в в инкубаторе (УЛИ-20, Украина) при 37°С, содержанием СО2 в среде составляло 5%. Через 24ч в убирали надосадок, а адгезированную фракцию клеток оставляли для дальнейшего культивирования, при этом в опытные образцы добавляли 10% раствор тестируемого средства митохондрина. Культивирование проводили на протяжении 14 суток с заменой питательной среды через 3-4 суток.
Иммуногистохимическое выявление СD-105+ изучаемых клеток производили следующим образом: По окончании периода культивирования культуральные клеточные образцы фиксировали 4% раствором параформальдегида (Sigma, Германия) при температуре +4 °С. При этом использовались первичные мышиные антитела к CD-105 человека (Dako, Дания) в разведении 1:20. Визуализацию связывания антител проводили с помощью стандартных реактивов системы HRP/DAB Detection System (Dako, Дания), а подсчет количества СD 105+ клеток проводился на отдельных образцах в 10 полях зрения светового микроскопа СМ-15 (ЛОМО, Россия).
Оценка жизнеспособности клеточной МСК популяции: проводилась перед началом посадки клеток для культивирования. С этой целью подсчитывалось содержание в клеточной суспензии мертвых клеток после их предварительного окрашивания 0,2% раствором трипанового синего. К посадке допускались клеточные образцы с содержанием жизнеспособных клеток в количестве не менее 70%.
Результаты и их обсуждение
Культуры МСК костного мозга и жировой ткани были использованы для изучения действия антигипоксического средства митохондрина (М2). В частности, целью исследования было
выяснить, обусловлены ли антигипоксические эффекты, вызываемые средством митохондри-ном, стимуляцией МСК или в механизме их фармакологического действия задействованы другие механизмы.
В исходном материале жировой ткани человека содержание СР105+ клеток составляло только 0,05% от их общего числа (Таблица 1), при этом даная клеточная популяция отличалась достаточно высокой жизнеспособностью и содержала 85% живих клеток. Если в начале исследования адгезивная фракция составляла 7,4 %, на 3 сутки культивирования колонии практически отсутствуют, преобладают единичные клетки [7].
На 14 сутки эксперимента культуру клеток фиксировали, а затем окрашивали для выявления МСК. Полученные результаты показали, что численность стволовых клеток за период культивирования увеличилась в 5 раз (Таблица 1) и достигла 0,25% в клеточной популяции. При этом содержание МСК в контрольных и опытных образцах практически не отличалось, т.е. мито-хондрин не влиял на активность пролиферативных процессов данного типа МСК.
Таблица 1
Содержание МСК жировой ткани в культуре
Группа Содержание СD105+ клеток в поле зрения, %
Контроль (исходный материал) 0,05 ± 0,017
Контроль 14 суток 0,25 ± 0,083
М1 10% раствор 14 суток 0,23 ± 0,077
В поле зрения микроскопа С0105+ клетки жировой ткани человека представляли собой мелкие или средние клетки округлой, иногда зерновидной формы с крупным ядром и узким пере-нуклеарным ободком цитоплазмы. Иногда эти клетки образовывали небольшие колонии, но преимущественно встречались единичные клетки (Рис. 1, 2). При использовании 10% раствора средства митохондрина в поле зрения наблюдалось равномерное распределение изолированных и жизнеспособных МСК СО-105+ (рис. 1).
Ф
.Ж
Рис. 1 Сй105+ клетки жировой ткани. Контроль 14 суток в культуре, Об 10х10.
Рис. 2 Отдельные Сй105+ клетки жировой ткани. 14 суток в культуре. Добавлен 10% раствор М1, Об 20х10.
В исходном материале ткань костного мозга человека содержит 1% Сй105+ клеток МСК (Таблица 2). Общая жизнеспособность клеток данной ткани была очень высокой - 98% клеток в суспензии отторгали витальный краситель, а адгезивная клеточная фракция составила 39%.
Таблица 2.
Содержание МСК CD-105+, извлеченных из костного мозга
в культуре
Группа Содержание СD105+ клеток в поле зрения, %
Контроль (исходный материал) 1,00 ± 0,022
Контроль 14 суток 1,67 ± 0,056
М1 10% раствор 14 суток 1, 43 ± 0,047
Рис. 3 Сй105+ клетки костного мозга 14 суток культивирования. Контроль.Об. 20х10
За период двухнедельного культивирования количество С0105+ клеток возростало в 1,7 раза (Таблица 2). Как и в жировой ткани эти клетки характеризовались мелкими и средними размерами для них типичными, крупное округлое ядро и небольшой ободок цитоплазмы (Рис. 3). мСк располагались преимущественно на поверхности стромальных клеток, которые, распластываясь, формировали клеточный монослой, клеточные колонии встречаются крайне редко (Рис. 3). В опытных сериях встречались не только единичные МСК, но и колонии различного размера, на процесс образования которых может оказывать митохондрин (Рис. 4). В то же время наши данные показывают, что под воздействием ан-тигипоксического средства митохондрина количество С0105+ клеток увеличивается, т.е. их процентное содержание статистически не отличается от значений, полученных при изучении контрольной группы (Таблица 2). Таким образом митохондрин не оказывает пролиферативного действияна обе культуры МСК, выделенных из различных тканей организма.
Рис. 4 СD105+ клетки костного мозга 14 суток в культивирования после добавления 10% раствора М1. Об. 10х10
Заключение
Полученные экспериментальные данные свидетельствуют о том, что МСК человека из жировой ткани и костного мозга не вовлечены в механизм действия антигипоксического средства митохондрина, который может быть отнесен к новому классу лекарственных препаратов -трофинотропинов. Скорее всего, вызываемые данным средством эффекты опосредованы другими циторецепторными и метаболическими реакциями. Достоверно известно, что трофинотро-пины не обладают выраженным действием на пролиферативную активность милигнизирован-ных клеток [7], что делает их потенциально важными и перспективными лекарственными средствами при лечения онкогенетических процессов.
Литература
1. Koc O.N. Hematopoietic recovery after coinfusion of autologous blood stem cells and culture-expanded marrow MSC in advanced breast cancer patients receiving high-dose chemotherapy / Koc O.N., Gerson S.L., Cooper B.W. [et al.] // J. Clin. Oncol. - 2000. -V. 18, № 2. - P. 307-316.
2. Mizuno H. Adipose-derived stem cells for tissue repair and regeneration / Mizuno H. // J. Nippon. Med. Sch. - 2009. - V. 76, № 2. - P. 56-66.
3. Мусина Р.А. Сравнительная характеристика мезенхимальных and Rehab.Medicine (ISPRM). - 2001. - Monduzzi Edit.S.T.A. -
стволовых клеток , полученных из разных тканей человека / №1. - P.743-746.
Р.А.Мусина, Е.С.Бекчанова, ГТ. Сухих // Клеточные техноло- 6. Матийцив Н.П. Влияние церебрала и Митохондрина на жизне-
гии в биологии и медицине. - 2005. - № 2. - С. 89-95. способность и динамику развития дегенеративных изменений
4. Савченкова И.П. Подкожно-жировая ткань человека, подверг- в ткани мозга мутантов Drozophila metanogaster /
нутая низкотемпературному шоку, как источник жизнеспособ- Н.П.Матийцив, Я.И. Чернин // Биофармацевтический журнал. -
ной клеточной популяции с характеристиками мультипотент- 2012. - Т. 4, № 4. - С. 54-56.
ных мезенхимальных стромальных клеток / И.П.Савченкова, 7. Погорелая Н.Х. Влияние церебрала, верапамила и их комби-
c.В.Коржикова // Цитология. - 201°. - т. 52, № 8. - С. 621-627. наций на морфологическую дифференцировкуклеток фаехро-
5. Shirobakova L.I. Autohypoxic activity of a new organollogenic мацитомы крыс / Н.Х.Погорелая, С.И.Савосько, Д.А. Василенко
pharmacological drug “Mitohondrin” / L.I. Shirobakova // Book of // Нейрофизиология. - 2011. - Т. 43, № 2. - С. 18-28.
Articles. Proc. of the 1st World Cougr of the Ins.Soc. of Physical
Реферат
ВПЛИВ АНТИГІПОКСИЧНОГО ЗАСОБУ МІТОХОНДРИНУ НА МЕЗЕНХІМАЛЬНІ СТОВБУРОВІ КЛІТИНИ, ЩО ОТРИМАНІ ІЗ РІЗНИХ ТКАНИН
Васильєва І.Г., Олексенко Н.О., Пусь А.С., Макаренко О. М.
Ключові слова: мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), кістковий мозок, жирова тканина, маркери, мітохондрії.
Проведені дослідження можливого впливу антигіпоксичного засобу Мітохондрину на мезенхімальні стовбурові клітини (МСК), що отримані із жирової тканини і кісткового мозку. Встановлено, що молекули засобу Мітохондрину (0,1 мл/мг одноразово) достовірно не впливають на процеси і метаболізм клітин обох ліній МСК різного походження.
Summary
EFFECT OF ANTI-STROKE MEDICINE “CEREBRAL” ON PROLIFERATION AND DIFFERENTIATION OF MESENCHYMAL CELLS OF BONE MARROW
Vasylieva I., Oleksenko N., Pus' A., Makarenko A.
Key words: mesenchymal stem cells (MSC), bone marrow, Cerebral.
This paper focuses on the studies of the impact produced by anti-stroke medicine “Cerebral” on mesenchymal cells taken from human bone marrow. It has been found that molecules of Cerebral definitely have an impact on processes of proliferation and differentiation of cell line of mesenchymal stem cells (MSC) in human bone marrow. It results in the increase of this cell population and directed stem cell growth. Under the cerebral influence CD105+ cells content has increased in 40 times, and they compose 87% of cell population. The density of new-formed monolayer is less, but structured as the cell processes have directed growth forming the socket-like structure.
УДК: 611.018.73/.74
Гасюк Н.В., Худякова М.Б., Герасименко С.Б.
ОСОБЛИВОСТІ УЛЬТРАСТРУКТУРНОЇ БУДОВИ ЕПІТЕЛІЮ ЯСЕНЕВОЇ БОРОЗНИ
ВДНЗ України «Українська медична стоматологічна академія», м. Полтава;
Харківський національний медичний університет, м. Харків
Приведені в статті результати дослідження розширюють та доповнюють існуючі дані стосовно будови епітеліоцитів ясеневої борозни та дають можливість вважати її першою мішенню антигенного впливу мікробних чинників та їх токсинів на етапі виникнення запального процесу в тканинах пародонта. Оскільки це є особливий вид епітелію зі специфічним цитотопографічним співвідношенням та ультраструктурною організацією.
Ключові слова: епітелій, ясенева борозна, пародонт, ультраструктура.
Робота є фрагментом проекту науково-дослідного інституту генетичних та імунологічних основ розвитку патології та фармакогенетики «Роль запальних захворювань зубо-щелепного апарату в розвитку хвороб, пов’язаних із системним запаленням», номер державної реєстрації №0112и0011538. Автор є співвиконавцем даного проекту.
Проблема реабілітації пацієнтів з дефектами успішного лікування пацієнтів з виготовленням
зубних рядів є одним із актуальних завдань незнімних та умовно-знімних конструкцій зубних
практичної стоматології, так як 65% населення протезів [1,10].
нашої країни у віці 35-45 років потребує зубного Термін служби незнімних конструкцій зале-
протезування [5,9]. жить від стану тканин пародонту опорних зубів і
Застосовувані для цієї мети традиційні мето- стану тканин, що оточують імплантат [2], так як
ди заміщення дефектів зубних рядів не завжди в саме ці ділянки слизової підлягають впливу ме-
повній мірі відповідають естетичним і функціо- ханічних, термічних та бактеріальних чинників
нальним вимогам пацієнтів [3]. [5,7,8,14].
Впровадження дентальної імплантації в прак- Провідна роль у виникненні запальних реак-
тику ортопедичної стоматології та застосування цій в тканинах пародонту належить мікробному
імплантатів в якості самостійних або додаткових чиннику [4,15]. Під впливом патогенної мікроф-
опор для зубних протезів відкриває перспективи лори зубної бляшки відбувається активація мак-
