CC BY
94
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 1 ’2 0 0 9
ДИНАМИКА СКОРОСТИ РОСТА, ИММУНОФЕНОТИПА И ГЕНЕТИЧЕСКАЯ СТАБИЛЬНОСТЬ МЕЗЕНХИМАЛЬНЫХ СТВОЛОВЫХ КЛЕТОК КОСТНОГО МОЗГА ЧЕЛОВЕКА НА РАННИХ _И ПОЗДНИХ ПАССАЖАХ ПРИ КУЛЬТИВИРОВАНИИ EX VIVO_
Е.Ю. Осипова1,3, В.А. Никитина2, Т.А. Астрелина1,3, А.Ю. Устюгов3, Е.В. Дмитриева1, Б.Б. Пурбуева13, Е.В. Скоробогатова1, Т.В. Шаманская1,3, З.М. Дышлевая1,
М.В. Яковлева3, О.А. Майорова1,3, Л.Д. Катосова2, С.А. Румянцев1,3, Н.П. Бочков2
Федеральный научно-клинический центр детской гематологии, онкологии и иммунологии Минздравсоцразвития РФ, Москва; 2ГУ Медико-генетический научный центр РАМН;
3Банк стволовых клеток Департамента здравоохранения Москвы
Проведено изучение динамики роста, изменения иммунофенотипических характеристик, генетической стабильности мезенхимальных стволовых клеток (МСК) человека на ранних (3—4-й) и поздних (10—12-й) пассажах при культивировании in vitro. Представлены результаты культивирования стромальных фибробластов костного мозга (n=25), забранного в целях аллогенной трансплантации пациентам с гематологическими заболеваниями. Было показано, что в популяции культивируемых in vitro МСК сохраняется линейная гомогенность клеток, наблюдаемая на 3—4-м пассаже, а также и при увеличении срока культивирования до 10—12-го пассажа. Результаты анализа анеуплоидии культивируемых клеток свидетельствуют
о клональной гетерогенности популяции МСК и селективном преимуществе определенных клонов в процессе культивирования. Используемый в нашей работе протокол культивирования МСК позволяет получить достаточное для клинического применения число хорошо охарактеризованных клеток уже на 3—4-м пассаже. При использовании в терапевтических целях МСК более поздних сроков экспансии следует осуществлять строгий контроль поверхностного фенотипа и генетической стабильности клеточных трансплантатов, что позволит в будущем избежать нежелательных отдаленных последствий клинического использования культур МСК. Полученные данные обсуждены и сопоставлены с данными литературы.
Ключевые слова: мезенхимальные стволовые клетки, пассирование, иммунофенотип, пролиферативная активность, генетическая стабильность, экспансия ex vivo
HUMAN BONE MARROW MESENCHIMAL STEM CELLS GROWTH RATE DYNAMICS, IMMUNOPHENOTYPE AND GENETIC STABILITY ON EARLY AND LATE PASSAGES AT EX VIVO CULTURING
E.Yu. Osipova13, V.A. Nikitina2, T.A. Astrelina1,3, A.Yu. Ustyugov3, E.V. Dmitrieva1, B.B. Purbueva1,3, E.V. Skorobogatova1,
T.V. Schamanckaya1,3, Z.M. Dischlevaya1, M.V. Yakovleva3, O.A. Maiorova1,3, L.D. Katosova2, S.A. Roumiantsev1,3, N.P. Bochkov2
1Federal Research Center of Pediatric Hematology, Oncology and Immunology;
Medical Genetic Scientific Centre RAMS; 3The Stem cell bank Moscow Department of Public health, Moscow
Human mesenchimal stem cells (MSC) growth dynamics, immunophenotype change, genetic stability on early (3—4) and late (10—12)
passages at in vitro culturing was studied. Results of bone marrow stromal fibroblasts culturing (n=25) from allogeneic transplant recip-
ients with hematological disorders are presented. It has been shown, that in MSC population cultivated in vitro linear homogeneity of cells
is observed on 3—4 passage, and remains on 10—12 passage. Clonal heterogeneities of MSC population and selective advantage of cer-
tain clones during culturing was revealed as aneuploidy analysis results of cultivated cells. The MSC culturing protocol used in our work
allows receiving well characterized MSC number sufficient for clinical application as early as 3—4 passage. While using in the thera-
peutic purposes MSC later terms of expansion it is necessary to have close control of cells immunophenotype and genetic stability, which
will allow avoiding in the future the undesirable long-term consequences of MSC cultures clinical use. The obtained data are discussed
and compared with literature data.
Key words: mesenchimal stem cells, passage, immunophenotype, proliferating activity, genetic stability, expansion ex vivo
Существование в костном мозге стволовых клеток стромы, образующих в культуре колонии фибробластоподобных клеток, было впервые доказано А.Я. Фриденштейном и соавт. [1—3]. Эти клетки получили название колониеобразующих предшественников фибробластов (КОЕ-ф). Стволовая природа этих клеток (способность к самообновлению и дифференцировке в различные мезен-
химальные элементы) была подтверждена в многочисленных исследованиях [1—10]. Учитывая способность этих клеток трансформироваться в мезенхимальные элементы различных линий дифферен-цировки (остеоидные, хондрогенные, адипогенные и другие клетки-предшественницы), позднее они получили название мезенхимальных стволовых клеток (МСК) [11, 12]. В последние годы МСК все
шире применяются в клинике для клеточной терапии [8, 13—15]. Однако отсутствие стандартизованных методик выделения, культивирования и определения поверхностного фенотипа МСК требует выработки определенных критериев оценки клеток, выращенных in vitro для клинических целей. Необходимо быть уверенными в безопасности применения МСК у человека, прежде всего — в онко-генной безопасности. На риск канцерогенеза из «взрослых» стволовых клеток человека после их трансплантации указывает тот факт, что они экспрессируют общие маркеры с эмбриональными клеточными линиями [16, 17]. МСК человека, выделенные из подкожной жировой клетчатки, после длительного культивирования in vitro (>20 делений) приобрели способность формировать опухоли при введении SCID-мышам [18].
В культурах МСК костного мозга человека после 5-го пассажа выявляли колонии активно делящихся клеток с множественными хромосомными аномалиями, характерными для злокачественных клеток. По сравнению с МСК от 3—4-го пассажа эти клетки экспрессировали CD133+, легко клонировались и характеризовались высоким уровнем теломеразной активности. После трансплантации NOD/SCID-мышам эти клетки вызывали канцерогенез, преимущественно в легких, печени и брюшине через 4—6 нед [14, 18]. Другие авторы при длительном культивировании МСК (>20 пассажей) признаков злокачественной трансформации не выявили [15].
В связи с противоречивыми результатами исследований способности МСК к канцерогенезу после длительного культивирования in vitro проблема генетической безопасности при применении МСК для терапии человека является актуальной и требует дальнейшего изучения.
Задачей настоящего исследования явилось определение динамики роста, изменения иммуно-фенотипических характеристик, генетической стабильности МСК человека на ранних (3—4-й) и поздних (10— 12-й) пассажах при культивировании in vitro.
Материалы и методы
Материалом для исследования служил костный мозг здоровых доноров (n=25), забранный в целях аллогенной трансплантации пациентам с гематологическими заболеваниями, находившимся на лечении в Федеральном научно-клиническом центре детской гематологии, онкологии и иммунологии.
Культивирование стромальных фибробластов костного мозга проводили по методу, предложенному А.Я. Фриденштейном и соавт. [19]. Мононук-леарные клетки, выделенные из 20—40 мл костного мозга, высаживались в культуральные вентилируемые флаконы с площадью дна 75 см2 в концентрации 30—40х106/флакон в среде ДМЕМ с низким со-
держанием глюкозы с добавлением 20% эмбриональной телячьей сыворотки. Через 1—3 сут неприлипшие клетки удалялись со сменой среды, через 14 дней клетки снимали с пластика с помощью раствора трипсин-этилендиаминтетраацетат (ЭДТА) и пассировали каждые 7 дней в концентрации 0,5х106/флакон до окончания культивирования. Культивирование проводили при температуре 37°С в условиях абсолютной влажности и 5% СО2 в воздухе. Начиная с 3-го пассажа культуры МСК имели мономорфный вид и состояли из клеток веретенообразной формы (рис. 1).
Динамику роста клеточной популяции определяли по кратности прироста клеток: отношение количества клеток, полученного с данного пассажа, к числу клеток, посаженному на предыдущем пассаже.
Определение поверхностных маркеров клеток проводили с использованием следующей панели антител: CD3, CD13, CD14, CD19, CD25, CD29, CD31, CD34, CD38, CD44, CD45, CD73, CD90, CD105, CD106, CD166 и HLA-DR. Определяли как относительное число клеток в культуре МСК (в процентах), экспрессирующих тот или иной антиген, так и относительную интенсивность флюоресценции изучаемых антигенов (в rMFI).
Приготовление цитогенетических препаратов. Колхицин в стандартной конечной концентрации (0,5 мкг/мл) вводили в культуральные флаконы за 1,5 ч до начала фиксации. После окончания колхи-цинизации клетки снимали со стенки флакона с помощью раствора трипсин-ЭДТА. Гипотонизацию проводили 0,55% раствором КС1 (8 мин при 37°С), перед центрифугированием добавляли 3—5 капель фиксатора для остановки гипотонизации. Фиксация проводилась смесью метилового спирта и ледяной уксусной кислоты (в соотношении 3:1) стандартным способом с использованием 3 смен фиксатора. Клеточные суспензии раскапывали на охлажденные влажные стекла.
Кариотипирование. Цитогенетические дифференциально окрашенные препараты для кариоти-пирования готовили методом G-окраски. Для каж-
Рис. 1. Морфология МСК в культуре
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 1 ’2 0 0 9
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 1 ’2 0 0 9
Рис. 2. Примеры интерфазных ядер из культур МСК. Одновременная гибридизация с 2 или 3 центромерными зондами: а — хромосомы Х и Y(голубой и оранжевый сигналы); б — хромосомы 6 и 8 (оранжевый и зеленый сигналы); в — хромосомы X, Y, 11 (голубой, оранжевый и зеленые сигналы)
дой культуры МСК анализировали не менее 15 метафаз. Анализ препаратов проводили согласно L.G. Shaffer и N. Tommerup [20].
Анализ частоты анеуплоидии. Для выполнения интерфазного FISH-анализа (FISH — метод флюоресцентной гибридизации in situ) использовали центромерспецифичные ДНК-зонды на хромосомы X, Y, 6, 8, 11 («Vysis, Inc.»). Денатурацию, гибридизацию и отмыв проводили по стандартному протоколу. Для контрастной окраски ядер использовали 4’-6-диамино-2-фенилидол (DAPI). FISH-препараты анализировали под микроскопом AxioImager с комплектом интерференционных фильтров с помощью программного обеспечения FISH-анализа (Fish View System, Applied Spectral Imaging, GmbH). В каждой культуре анализировали не менее 1000 интерфазных ядер. Применение меТаблица 1. Динамика прироста МСК
тода многоцветного интерфазного FISH-анализа позволило исключить из анализа ядра с нерезультативной гибридизацией (рис. 2).
Статистическая обработка полученных данных проводилась в программах Biostat и Microsoft Excel, STATISTICA 6.0. Различия считали статистически значимыми при р<0,05. Результаты исследования и их обсуждение
Мы обнаружили, что при длительном культивировании in vitro МСК костного мозга человека наблюдается постепенное снижение пролиферативной активности клеток. Данные представлены в табл. 1. Так, МСК 3— 4-го пассажа обладают значительно более высокой пролиферативной активностью по сравнению с культурами 10—12-го пассажа. Кратность прироста клеток составила 5,88 и 2,03 раза соответственно.
Таким образом, при экспансии МСК in vitro скорость увеличения клеточной популяции максимальна на 3—4-м пассаже, несколько снижается к 5—6-му пассажу и достоверно уменьшается на поздних (10— 12-й) пассажах.
По данным литературы, имеются значительные разногласия между исследователями относительно экспрессии поверхностных маркеров на МСК. По-видимому, это связано с использованием различных сред для культивирования МСК, ферментативных растворов для снятия клеток с пластика, с различными временными интервалами между обработкой клеток и анализом на проточном цитофлюориметре, с различиями в возрасте (число пассажей) культур МСК. Тем не менее в последнее время выработана «минимальная» панель для оценки иммунофенотипа МСК, выращенных in vitro (3—4-й пассаж) для клинического применения [13, 21].
Полученные нами результаты согласуются с этими сведениями. После культивирования в течение 3—4-го пассажа на МСК костного мозга наблюдалась высокая экспрессия (>60%) следующих маркеров: CD90,
CD105, CD166, CD44, CD73, промежуточная (30—60%): CD13 и CD29. Стромальные клетки
при длительном культивировании in vitro
П Пассаж
Показатель 3—4-й (n=32) 5—6-й (n=32) 7-9-й (n=32) 10—12-й (n=25)
Кратность 5,88 4,81 2,63 2,03
прироста, медиана
Достоверность
различий, p 0,012
костного мозга не несли маркеры CD45, CD34, CD133, CD3, CD19, CD25, CD38, CD45, CD106, CD31 (доля положительных клеток <5%). Данные представлены в табл. 2.
При увеличении срока культивирования МСК до 10—12-го пассажа достоверно снижается лишь число клеток, экспрессирующих CD90 и CD166. В отличие от данных M. Kassem и соавт. [18], нами не отмечено увеличения количества CD133+ клеток при пассировании МСК до 10—12-го пассажа. С увеличением числа пассажей мезенхимальных клеток из культур исчезают примеси гемопоэтиче-ских (CD45+) и эндотелиальных ^D31+) клеток, наблюдается тенденция к снижению количества моноцитов (CD14+).
Результаты, полученные при оценке интенсивности экспрессии характерных для МСК антигенов при длительном культивировании in vitro, представлены в табл. 3. При увеличении срока культивирования МСК до 10—12-го пассажа, несмотря на снижение числа CD90+- и СD31+-клеток, интенсивность экспрессии этих антигенов повышается. В наших экспериментах не выявлено достоверных изменений интенсивности экспрессии других исследованных антигенов на поверхности МСК при экспансии in vitro.
Таблица 2.
По светооптическим характеристикам МСК как на ранних, так и на поздних пассажах представляют собой гомогенную популяцию крупных по размеру клеток, отличающихся от гемопоэтиче-ских. Наблюдаемые изменения экспрессии поверхностных антигенов на МСК в процессе пассирования, по-видимому, связаны с клональной гетерогенностью в популяции культивируемых клеток.
Кариотипирование МСК проведено в 9 культурах. Во всех случаях хромосомный набор культур МСК соответствовал нормальному — 46XY или 46ХХ и не менялся в процессе культивирования.
При анализе частоты анеуплоидии в культурах МСК было проанализировано около 25 тыс. ядер. В табл. 4 представлены результаты исследования частоты анеуплоидии по хромосоме X в культурах мужчин — доноров костного мозга на ранних и поздних пассажах.
В среднем число нормальных клеток с одной хромосомой X составило 99,40+0,12% на ранних и 99,54+0,14% на поздних пассажах. Частота ядер с двумя хромосомами X варьировала от 0,1 до 1,07% в разных культурах, а в среднем составила 0,52+0,10% — ранние и 0,46+0,14% — поздние пассажи. Нулисомия по хромосоме X зафиксирована как крайне редкое явление (0,08+0,04%), что может быть
Изменение поверхностного фенотипа МСК костного мозга при длительном культивировании in vitro
Показатель
Антитело
Процент клеток, несущих данный маркер, медиана, МСК Достоверность 3—4-го пассажа (и=12) 10—12-го пассажа (п=10) различий, p
Маркер Т-лимфоцитов Маркер миелоидных клеток Маркер моноцитов Маркер В-лимфоцитов Рецептор ИЛ-2 Рі-Интегрин РЕСАМ
Маркер стволовых клеток Маркер активации лимфоцитов НСАМ-1
Общий лейкоцитарный АГ
8Н3
^у-1
Эндоглин, 8Н2 ¥САМ-1
Маркер стволовых клеток 8В 10^КАМ HLA-DR
CD3
CD13
CD14
CD19
CD25
CD29
CD31
CD34
CD38
CD44
CD45
CD73
CD90
CD105
CD106
CD133
CD166
Анти-HLA-DR
0,48
24,54
0,58
0,29
0,23
53,82
2,22
0,46
0,55
81,94
2,75
97.5 67,29
69.6 0,3 0,74
67.24
1.24
0,26
13,19
0,155
0,3
0,29
35,59
1,1
0,64
0,33
82,14
1,3
98,5
45,27
57,71
0,7
1,09
36,96
0,36
0,22 0,48 і 0,07 0,90 0,63 0,59 і 0,06 0,67 0,16 0,34 і 0,049 0,34 і 0,05 0,44 0,27 0,14 і 0,05 і 0,07
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 1 ’2 0 0 9
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 1 ’2 0 0 9
Таблица 3. Изменение интенсивности экспрессии характерных
для МСК антигенов при длительном культивировании in vitro
Показатель
Антитело
Интенсивность экспрессии (в rMFI), медиана, МСК Достоверность
3—4-го пассажа (и=12 10—12-го пассажа (и=10) различий, p
Маркер миелоидных клеток CD13
Р1-Интегрин CD29
PECAM CD31
HCAM-1 CD44
SH3 CD73
Thy-1 CD90
Эндоглин, SH2 CD105
Маркер стволовых клеток CD133
SB 10/ALKAM CD166
422
400
13
5309
2577
496
1507
13
354
647
727
34
4725
1538
703
2060
20
374
1,0
0,89
0,045
0,34
0,74
0,047
0,54
0,64
0,26
■
I
связано с выявлением разовых событий потери единственной Х-хромосомы вследствие нерасхождения или отставания в процессе клеточного деления или может рассматриваться как гибридизационный артефакт. По данным литературы, нулисомия по хромосоме X не совместима с выживанием клетки. Такие
клетки могут быть выявлены благодаря чувствительности метода FISH на интерфазных ядрах, и скорее всего для них уже запущен механизм апоптоза.
На ранних и поздних пассажах были зафиксированы ядра, нулисомные по хромосоме Y. Данные представлены в табл. 5.
Таблица 4. Частота анеуплоидии по хромосоме Х в МСК из костного мозга (донор ХY)
№
Номер культуры по протоколу
Число клеток
Нулисомия, %
Моносомия, %
Дисомия, %
3—4-й пассаж 1 2
3
4
5
6
7
8 9
Среднее 10—12-й пассаж 1 2
3
4
5
6
Среднее * 5-й пассаж.
2*
4
5
6 8 10 12 13 15
2
4
5 8 12 13
1002
1009
1278
1007
1083
1005 1033 1018 1046 9481
1006 730 542 1004 1030 1016 5328
0
0
0
0
0
0
0,29
0,1
0,29
0,08±0,04
0
0
0
0
0
0
0
99,20
99,31
99,84
99.90 98,98 99,70 98,94 99,51 99,24
99,40±0,12
99.90
99.59 99,82
99.60 98,93 99,41
99,54±0,14
0,80
0,69
0,16
0,10
1,02
0,30
0,77
0,39
0,48
0,52±0,10
0,10
0,41
0,18
0,40
1,07
0,59
0,46±0,14
■
Спонтанная частота потери хромосомы Y в культурах МСК варьировала от 0 до 0,87% на разных пассажах. Частота гиперплоидии (дисомия) составила 0,19+0,10% как на ранних, так и на поздних пассажах. Не выявлено статистически достоверных различий в частотах разных типов анеуплоидий по хромосоме У
Частота анеуплоидии по половым хромосомам не менялась в процессе культивирования и соответствует данным, полученным на культурах лимфоцитов человека [22].
Продолжается работа по оценке уровня анеуп-лоидии по хромосомам 6, 8 и 11 в культурах МСК. Исследование анеуплоидии по аутосомам (хромосомы 6, 8, 11) показало, что частота моносомии при длительном культивировании МСК костного мозга превышает частоту трисомии. Это соответствует результатам, полученным ранее при исследовании анеуплоидии в культурах МСК из жировой ткани [23].
В одной культуре МСК (№2) обнаружен клеточный клон с трисомией по хромосоме 8. Частота анеуплоидии по этой хромосоме была оценена на 4, 6 и 12-м пассажах. Клон выявляется уже на 4-м пассаже и составляет примерно 24% от общего числа проанализированных клеток, на 6-м пассаже зафи-
Таблица 5.
ксировано уже 34% ядер с трисомией по хромосоме 8. Однако к 12-му пассажу наблюдали только 16% трисомных клеток в этой культуре. Условия культивирования и пересевов клеточных культур были сходными, поэтому появление аномальных клонов клеток можно объяснить их селективным преимуществом в размножении. Изменение размера клона свидетельствует о разной скорости его деления в процессе культивирования. Можно предположить, что процессы пролиферации и старения в анеуплоидных клетках протекают быстрее, чем в нормальных.
Для применения МСК в клеточной терапии важно трансплантировать хорошо охарактеризованную гомогенную популяцию клеток [8, 13, 14, 21]. На основании полученных нами результатов можно сделать вывод о том, что в популяции культивируемых in vitro МСК линейная гомогенность клеток, наблюдаемая на 3—4-м пассаже, сохраняется и при увеличении срока культивирования до 10—12-го пассажа. Однако наблюдаемые при этом изменения поверхностного фенотипа, скорости роста и результаты анализа анеуплоидии культивируемых клеток свидетельствуют о клональной гетерогенности популяции МСК и селективном преимуществе определенных клонов в процессе культиви-
Частота анеуплоидии по хромосоме Y в МСК из костного мозга (донор ХY)
№ Номер культуры по протоколу Число клеток Нулисомия, % Моносомия, % Дисомия, %
3—4-й пассаж
1 2* 1002 0,50 99,40 0,10
2 4 1009 0,20 99,80 0
3 5 1278 0,39 99,61 0
4 6 1007 0,50 99,40 0,10
5 8 1083 0,55 99,26 0,18
6 10 1005 0,20 99,80 0
7 12 1033 0,87 98,26 0,87
8 13 1018 0 99,71 0,29
Среднее 8435 0,40+0,09 99,41+0,18 0,19+0,10
10—12-й пассаж
1 2 1006 0,40 99,50 0,10
2 4 730 0 100 0
3 5 542 0 99,82 0,18
4 8 1004 0,40 99,60 0
5 12 1030 0,19 99,13 0,68
6 13 1016 0 99,80 0,20
Среднее 5328 0,17+0,08 99,64+0,13 0,19+0,10
* 5-й пассаж.
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 1 ’2 0 0 9
ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ 1 ’2 0 0 9
рования. Используемый в нашей работе протокол культивирования МСК позволяет получить достаточное для клинического применения число хорошо охарактеризованных клеток уже на 3—4-м пассаже. При необходимости использования в терапевтических целях МСК более поздних сроков экс-
пансии следует осуществлять строгий контроль поверхностного фенотипа и генетической стабильности клеточных трансплантатов, что позволит в будущем избежать нежелательных отдаленных последствий клинического использования культур МСК.
Литература
1. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К., Лалыкина К.С. О фибробластоподоб-ных клетках в культурах кроветворных тканей морских свинок. Цитология 1970;12:1147—55.
2. Фриденштейн А.Я., Лурия Е.А. Клеточные основы кроветворного микроокружения. Тер арх 1980;9:67—71.
3. Владимирская Е.Б., Кошель И.В. Стромальные фибробласты нормального костного мозга у детей. Гематол трансфузиол 1990;1:3—5.
4. Фриденштейн А.Я., Чайлахян Р.К. Стромальные клетки костного мозга и кроветворное микроокружение. Арх патол 1982;10:3—11.
5. Owen M., Fridenstain A. Stromal stem cells: marrow-derived osteogenic progenitors. Ciba Found Symp 1988;136:42—60.
6. Owen M. Marrow stromal stem cells.
J Cell Sci 1995;10:63—76.
7. Minguell J.J. Mesenchymal stem cells. Exp Biol Med 2001;226(6):507—20.
8. Minguell J.J., Conget P. Mesenchymal progenitor cell: Biology and clinical utilization. Br J Med Biol Res 2000;33: 881—7.
9. Prockop D.J. Marrow stromal cells as stem cells for nonhematopoietic tissues. Science 1997;276:71—4.
10. Castro-Malaspina H., Gay R.,
Resnick G. et al. Characterization of human bone marrow fibroblast colony-forming cells (CFU-F) and their progeny. Blood 1980;56:289-301.
11. Caplan A.I. The mesengenik process. Clin Plast Surg 1994;21:429-35.
12. Pittenger M., Mackay A., Beck S. et al. Multilineage potential of adult human mesenchymal stem cells. Science 1999;284:143-7.
13. Le Blanc K., Ringden O. Immunomodulation by mesenchymal stem cells and clinical experience. J Intern Med 2007;262:509-25.
14. Miura M., Miura Y., Hesed M. et al. Accumulated chromosomal instability in murine bone marrow mesenchymal stem cells to malignant transformation. Stem Cells 2005;65:1961-4.
15. Stenderup K., Justesen J., Clausen C. et al. Aging is associated with decreased maximal life span and accelerated senescence of bone marrow stromal cells. Bone 2003;33:919-26.
16. Tai M.-H., Chang C.-C., Olson L.K. et al. Oct4 expression in adult human stem cells: evidence in support of the stem cell theory of carcinogenesis. Carcinogenesis 2004;10:1093.
17. Rubio D., Garcia-Castro L.,
Martin M.C. et al. Spontaneous human
adult stem cell transformation. Cancer Res 2005;65:3035—9.
18. Kassem M., Burn J.S. Carcia-Castro J. et al. Adult stem cells and cancer. Cancer Res 2005;65:9601 —7.
19. Фриденштейн А.Я.,
Дериглазова Ю.Ф., Кулагина Н.Н. Клонирование клеток-предшественни-ков для фибробластов в монослойных культурах клеток. Бюлл экспер биол 1973;76:90—4.
20. Shaffer L.G., Tommerup N. International System for Human Cytogenetic Nomenclature. Published in collaboration with Сytogenetics and Genome Research under the title ISCN. Karger 2005:130.
21. Delorme B., Ringe J., Gallay N. et al. Specific plasma membrane protein phenotype of culture-amplified and native human bone marrow mesenchymal stem cells. Blood 2008;111:2631—5.
22. Назаренко С.А., Тимошевский В.А. Анализ частоты спонтанной анеуплои-дии в соматических клетках человека
с помощью технологии интерфазной цитогенетики. Генетика 2004;40(2):195—204.
23. Бочков Н.П., Никитина В.А. Цитогенетика стволовых клеток человека. Молекуляр мед 2008;3:40—7.
ВНИМАНИЕ: ПОДПИСКА!
Журнал «ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ» рассылается читателям бесплатно.
Aнкета для подписки представлена на сайте: www.netoncology.ru
Чтобы получать журнал «ОНКОГЕМАТОЛОГИЯ» ,
нужно либо заполнить анкету на сайте,
либо передать ее в издательство
по факсу: 8 (499) 929 96 19,
e-mail: abv@abvpress.ru
или по почте: 109443, Москва, а/я 35.
Можно также оформить платную подписку через каталоги:
«Почта России», подписной индекс — 12313,
«Пресса России», подписной индекс — 42167.
і
ГЕМАТОЛОГИЯ
Острый МвІІПІДІЬІІ llllQJ
Г Ліні ГРІ III Ы №10 HI Г tD| HI ЕІІГВ
ірагмиг раїдоїту оип-т-шо
» «Й1І MIlflCMiN
IMIIRII ТІви0і«ІТСЯ1«ІЙІЧІС119С lltlf IRf I ■■ ■RIMICJUHI ТКРИСРЯИПТР яря РЯЛІГРРВРR твакянЯТ4ІІП ГІВЧПЇІІЯЧРСКЯІ
ст*Щ«рнк MiTtp
OllURIlUHP P«TfP
C INIMDriNIEIilia lllMHUAIlMH
