CC BY
64
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
rum signals with outer membrane lipids: insights into prokaryotic membrane vesicle formation // Mol. Microbiol. - 2008. - Vol. 69, № 2. - P. 491-502.
24. Mashburn-Warren L.M., Whiteley M. Special delivery: vesicle trafficking in prokaryotes // Mol. Microbiol. -2006. - Vol. 61, № 4. - P. 839-846.
25. Meyle E., Stroh P., Gunther F. et al. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation // Int. J. Artif. Organs. - 2010. - Vol. 33, № 9. - P. 608-620.
26. Pap E., PallingerE., PasztoiM., Falus A. Highlights of a new type of intercellular communication: microvesicle-based information transfer // Inflamm. Res. - 2009. - Vol. 58, № 1. - P. 1-8.
27. Pilsczek F.H., Salina D., Poon K.K. et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus // J. Immunol. - 2010. - Vol. 185, № 12. - P. 7413-7425.
28. Sadallah S., Eken C., Schifferli J. A. Ectosomes as modulators of inflammation and immunity // Clin. Exp. Immunol. - 2010. -Vol. 63. - P. 26-32.
28. Stroh P., Gunther F., Meyle E. et al. Host defence against Staphylococcus aureus biofilms by polymorphonuclear neutrophils: oxygen radical production but not phagocytosis depends on op-sonisation with immunoglobulin G // Immunobiology. - 2011. - Vol. 216, № 3. - P. 351-357.
Поступила 10.05.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.373.03:616.94-036.11].079.6
А.А. Маркина1, В.Л. Львов2, П.Г. Апарин1
КОРРЕКЦИЯ СЕПТИЧЕСКОГО И ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО ШОКА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ
цвиттерионным экзополисахаридом shigella sonnei, фаза 1
1Лаборатория полисахаридных вакцин, Лаборатория препаративной биохимии ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России (115478, Россия, г Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2) Институт иммунологии. Тел: 8(499)616-49-25; e-mail: institute@immune.umos.ru
Из энтеробактерии Shigella sonnei, фаза 1, выделен новый природный вариант цвиттерионного полисахарида -экзополисахарид (ЭПС), в состав которого входит липидный компонент, представляющий собой диацилглицерофосфат, а повторяющееся звено идентично с таковым О-специфичного полисахарида S. sonnei. Препарат ЭПС отличался высокой степенью безопасности: не вызывал пирогенной реакции у крыс и гибели мышей при введении в сверхвысокой дозе (1 г/кг). При профилактической иммунизации ЭПС отмечены замедление развития экспериментального перитонита и продление времени выживаемости мышей (CBA*C57B1/6)F1 при развитии септического процесса. При предварительном введении препарат также эффективно обеспечивал выживаемость мышей и подавлял продукцию фактора некроза опухоли а при нагрузке бактериальным эндотоксином E.coli 0:55 в дозе 150 мг/кг.
Ключевые слова: экзополисахарид, Shigella sonnei, септический шок, эндотоксический шок A. A. Markina, V L. Lvov
APARIN CORRECTION OF SEPTIC AND ENDOTOXIC SHOCK WHEN IMMUNIZATION ZWITTERIONIC EXOPOLYSACCHARIDES SHIGELLA SONNEI, PHASE 1
From enterobacterien Shigella sonnei, phase 1, a new natural variant of zwitterionic polysaccharide - exopolysaccharide (EPS), which includes the lipid component, representing the diacilglycerophosphate, and repeated the link are identical with those of The o-specific polysaccharide S.sonnei. The drug EPMs possessed a high degree of security: not called for pyrogenic reactions in rats and death of mice when administered in high doses (1 g/kg). When preventive immunization EPMs noted slowing down the development of the experimental peritonitis and the extension of the time of the survival rate of mice (CBA*C57B1/6)F1 in the development of septic process. In the preliminary introduction the drug also effectively ensured the survival rate of mice, and mastered the production of TNF-а with a load of bacterial endotoxine E.coli O:55 in the dose of 150 mg/kg.
Key words: exopolysaccharide, Shigella sonnei, septic shock, endotoxic shock
Септические и эндотоксические шоковые состояния, вызванные массивным попаданием в организм пациента грамо-трицательных бактерий или их эндотоксина (липополисахарида - ЛПС), относят к клиническим патологиям, в лечении которых не удается достичь существенного успеха. В мире
Маркина Анна Александровна - мл. науч. сотр., тел. 8(909)931-61-25, e-mail: markinanna@mail.ru
ежегодно диагностируют 1,5 млн случаев септических состояний, которые занимают первое место по смертности пациентов в отделениях реанимации и интенсивной терапии не кардиологического профиля и 11-е место среди всех причин смертности населения [1, 2]. Ежегодно от сепсиса умирают около 500 тыс. человек [3].
Поиск биологически активных веществ - потенциальных модуляторов течения (профилактики) как эндотоксического, так и септического шока, является одной из актуальных задач современной фармакологии. Биополимеры углеводной
- 39 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2013
природы (БУП) энтеробактерий принимают прямое участие в патогенетических механизмах септических состояний. Еще в 1950-е годы была установлена и впоследствии детально описана ключевая роль ЛПС в патогенезе септического и эндотоксического шока [4]. ЛПС также является модулятором течения шоковых состояний посредством индукции феноменов ранней или поздней эндотоксической толерантности [5]. Однако высокая токсичность липид-А-домена в составе молекулы ЛПС - мажорного антигена клеточной стенки грам-отрицательных бактерий, который вовлечен во все этапы патогенетических взаимодействий хозяин - бактерия при шоке, является главным препятствием для использования ЛПС в фармацевтических препаратах.
Ранние исследования противошоковой активности полисахаридов были связаны с изучением возможности модулировать септическое состояние с использованием полисахаридов семейства р-1,3-глюканов, которые обладали противомикробной активностью широкого спектра действия, повышали количество, бактерицидную и фагоцитарную активность макрофагов и нейтрофилов, но вместе с тем индуцировали продукцию моноцитами провоспалительных цитокинов (фактор некроза опухоли a (TNFa), интерлейкин (IL)-1, IL-2) [6]. Побочные реакции (формирование гранулемы, анафилаксии и гипотензии) и плохая растворимость ограничивают использование данных препаратов для лечения человека.
Особый интерес представляют результаты исследований последних лет, посвященных изучению иммуногенных свойств цвиттерионных полисахаридов. Капсульный полисахарид А (КПС А) Bacteroides fragilis был определен как тимусзависимый полисахаридный антиген [7]. Уникальные характеристики КПС А, по мнению авторов, обусловлены мощным двойным зарядом полимера, мономерное звено которого (тетрасахарид) имеет как положительно заряженные аминогруппы, так и отрицательно заряженные карбоксильные группы [8]. КПС А активирует пролиферацию Т-клеток в присутствии антигенпрезентирующих клеток in vitro [9], а при профилактической иммунизации защищает животных in vivo по Т-лимфоцитзависимому механизму от образования абсцессов, вызываемых B.fragilis - главным этиологическим агентом абдоминальных абсцессов [10]. Стоит отметить, что КПС А B.fragilis не предотвращает формирование абсцессов, обусловленных гетерологичными бактериальными штаммами [10], что с учетом полимикробного характера сепсиса не позволяет говорить об истинном противошоковом действии данного препарата.
Настоящее исследование посвящено оценке профиля безопасности и изучению противошоковых свойств на моделях септического и эндотоксического шока нового природного варианта цвиттерионного полисахарида, полученного из энтеробактерии Shigella sonnei, фаза 1, экзополисахарида (ЭПС), в состав которого входит липидный компонент, представляющий собой диацилглицерофосфат.
Материалы и методы. Характеристика ЭПС S. sonnei, фаза 1. ЭПС был получен из надклеточной жидкости в результате культивирования клеток S. sonnei, фаза 1, и очищен при помощи жидкостной хроматографии. Очистку ЭПС от примесей белков и нуклеиновых кислот осуществляли с помощью высокоактивных ферментных препаратов: рибо-нуклеазы А, дезоксирибонуклеазы и протеиназы К (Sigma-Aldrich, США). Количество примесей нуклеиновых кислот и белков определяли с использованием методов Спирина и Бредфорд соответственно. Уровень примесей белков и нуклеиновых кислот не превышал 1 и 2% соответственно.
Изучение жирно-кислотного состава липидной части ЭПС проводили с помощью газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии. По результатам анализов выявили, что липидная часть представлена диацилглицерофосфатом, где ацил - пальмитоил или стеароил.
Результаты сравнительного анализа С13-ЯМР-спектров (ядерный магнитный резонанс) ЭПС показали, что строение
повторяющегося звена полисахарида полностью идентично с таковым О-специфического полисахарида, выделенного из коммерческого образца ЛПС S. sonnei, фаза 1 (Sigma-Aldrich, США).
Оценка профиля безопасности ЭПС S. sonnei._Пироген-ный тест ставили на кроликах массой 2-3 кг, по 3 особи в группе, согласно требованиям ГФ XII, ОФС 42-0061-07, с. 125.
Эндотоксичность О-гликолипида in vitro оценивали с помощью LAL-теста, проведенного, согласно инструкции производителя (Sigma-Aldrich, США), и представляли как единица эндотоксичности/микрограмм (ЕЭ/мкг).
Острую токсичность оценивали при внутрибрюшинном (в/б) введении препарата мышам в дозе от 0,5 мг до 20 мг на мышь.
Моделирование экспериментального перитонита (CLP-модель прокола и перевязки слепой кишки). Моделирование экспериментального перитонита проводили на мышах линии (CBA*C57B1/6)F1 с использованием CLP-модели. Мышей оперировали под общей анестезией, вскрывали брюшину и извлекали слепую кишку и аппендикс. Слепую кишку перевязывали в прилегающей к аппендиксу области и прокалывали ее насквозь 1 раз иглой диаметром 22G [11]. Содержимое слепой кишки выдавливали через образовавшиеся отверстия для обсеменения бактериями кишечника перитонеальной полости, затем возвращали органы обратно в брюшину и зашивали брюшную полость [12]. Контрольную группу составляли интактные прооперированные животные. За 7 дней до CLP-операции мышей иммунизировали в/б ЭПС S. sonnei в дозе 400 мкг.
Коррекция эндотоксического шока. Коррекцию эндотоксического шока на мышах (CBA*C57B1/6)F1 проводили введением в/б существенного количества - 3 мг/мышь (или 150 мг/кг) чистого эндотоксина E. coli O:55 (Sigma-Aldrich, США), что составляет ЛД100, через 72 ч после иммунизации мышей ЭПС S. sonnei в/б в дозе 100, 200 и 400 мкг/мышь, что эквивалентно 2, 4 и 8 мг/кг соответственно.
Содержание TNFa в сыворотке крови мышей определяли с помощью тест-системы Quantikine Mouse TNFa/TNFSF1A (R&D Systems, США) методом твердофазного иммуноферментного анализа, согласно стандартной методике производителя. Кровь брали через 90 мин [13] после индукции эндотоксического шока.
Р е з у л ь т а т ы и о б с у ж д е н и е . Оценка профиля безопасности ЭПС S. sonne. ЭПС S. sonnei исследовали в тесте пирогенности на кроликах, при внутривенном введении в дозе 0,05 мкг/кг он не вызывал подъема температуры ни у одного из 3 подопытных кроликов более чем на 0,6°С по сравнению с исходной температурой, а сумма подъемов температуры у 3 подопытных кроликов не превышала 1,3°С, что соответствует критериям апирогенности [14]. По критерию пирогенности препарат соответствует требованиям ВОЗ для полисахаридных вакцин [15].
По результатам LAL-теста эндотоксичность ЭПС S. son-nei составила 7,3 ЕЭ/мкг, тогда как эндотоксичность нативного ЛПС S. sonnei, полученного по методу Westphal [16], -21 470 ЕЭ/мкг.
Иммунизация мышей (CBA*C57/Bl6)F1 в/б ЭПС S. son-nei с целью оценки острой токсичности в сверхвысокой дозе 20 мг/мышь (1 г на 1 кг массы) продемонстрировала выживаемость всех животных в группе и отсутствие побочных реакций.
Резкое снижение пирогенности и эндотоксичности препарата по сравнению с таковым гомологичного по О-антигену ЛПС несомненно обусловлено существенным структурным отличием липидной компоненты ЭПС (наличие двух жирных кислот) от липид-А-домена ЛПС (от 2 до 6 жирных кислот). Таким образом, ЭПС S. sonnei представляет собой препарат с высоким профилем безопасности и относится к группе слаботоксичных препаратов (ЛД 50 > 1 г на 1 кг массы).
- 40 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Рис. 1. Выживаемость (в %) мышей (CBAxC57Bl/6)F1, иммунизированных ЭПС S. sonnei, при индукции экспериментального перитонита.
По оси абсцисс - время (в ч).
Рис. 2. Уровень (в пг/мл) TNFa в крови мышей (CBAxC57Bl/6)F1 через 90 мин после введения эндотоксина E. coli O:55 на прямой модели эндотоксического шока при иммунизации ЭПС S. sonnei.
По оси абсцисс - доза (мкг/мышь) препарата.
Коррекция течения экспериментального перитонита у мышей (CBA*C57B1/6)F1, иммунизированных ЭПС S. sonnei. Септический шок является наиболее серьезным и трудноизлечимым осложнением у больных хирургического профиля вследствие операции или травмы, в основе которого лежит реакция организма в виде генерализованного воспаления на инфекцию различной природы, в частности при заражении грамотрицательными микроорганизмами.
Моделирование послеоперационного сепсиса в эксперименте возможно при обеспечении посредством хирургического вмешательства постоянного притока кишечных бактерий в перитонеальную полость: CLP-модель - метод перевязки и прокола слепой кишки; CASP-модель - открытое стентирование с помощью катетера брыжейки восходящей ободочной кишки. На модели экспериментального перитонита (CLP-модель) показано развитие полимикробного воспалительного процесса, обусловленного обсеменением перитонеальной полости различными видами кишечных бактерий - этиологических агентов перитонита: E. coli, B. fragilis, Pseudomonas aeruginosa, Klebsiella pneumoniae [12].
В результате серии экспериментов на модели экспериментального перитонита выявили, что препарат ЭПС S. sonnei обладал защитными противошоковыми свойствами, замедляя гибель экспериментальных животных. При этом гибель первой мыши в группе иммунизированных животных была на 48 ч позже, чем в контрольной группе, где первая мышь пала через 12 ч после операции (рис. 1). Последняя особь из группы иммунизированных мышей пала через 132 ч после операции, тогда как в контрольной группе - через 108 ч. Среднее время выживаемости мышей, иммунизированных ЭПС S. sonnei, было увеличено почти в 4 раза по сравнению с аналогичным показателем в контроле (123 ч против 32 ч соответственно).
Следует отметить полную выживаемость иммунизированных мышей в течение первых 60 ч после индукции перитонита в период максимальной выраженности дисфункции иммунной системы, который обычно определяется как 1-3-и сутки после операции.
Противошоковые противоинфекционные эффекты БУП обычно обусловливают их способностью к активации бактерицидных клеток-эффекторов, и прежде всего нейтрофилов. Р-1,3-Глюканы индуцируют пролиферацию нейтрофилов и макрофагов, повышают бактериальный клиренс и цитотоксическую активность иммунных клеток [6]. Не исключено, что защита от экспериментального перитонита после иммунизации ЭПС S. sonnei может быть связана с накоплением
нейтрофилов в перитонеальной полости. Вероятность такого механизма действия усиливает наличие липидного компонента в препарате ЭПС S. sonnei. При профилактической иммунизации мышей ЛПС E. coli 0127:B8, содержащим мощный липид-А-домен, на CASP-модели показано, что защитное действие связано с накоплением активированных нейтрофилов в месте инфицирования [17].
Однако другая структурная особенность молекулы ЭПС
S. sonnei - наличие цвиттерионого полисахарида - по аналогии с КПС А B. fragilis позволяет также предположить, что защита от полимикробной бактериальной инфекции при экспериментальном перитоните может быть ассоциирована с активацией Т-лимфоцитов.
Повышение выживаемости мышей (CBA*C57B1/6)F1, иммунизированных ЭПС S. sonnei при индукции эндотоксического шока. Эндотоксический шок развивается при попадании в организм бактериального эндотоксина, деструктивная роль которого заключается в массированной выработке провоспалительных цитокинов. Ведущая роль в патогенезе эндотоксического шока принадлежит TNFa, пик концентрации которого в сыворотке совпадает по времени с симптомами системного воспаления у септических больных [18], а моноклональные антитела к TNFa защищали мышей от гибели при эндотокси-новой нагрузке [19]. На прямой модели мы воспроизводили воспалительный процесс, вводя существенное количество чистого эндотоксина (150 мг/кг) и оценивали способность ЭПС S. sonnei индуцировать раннюю эндотоксическую толерантность (модулировать выживаемость и уровень TNFa в сыворотке периферической крови у интактных и толеризирован-ных мышей) при профилактическом введении.
Профилактическая иммунизация препаратом за 72 ч до индукции эндотоксического шока в дозе 100 и 200 мкг/мышь защищала от гибели 60 и 80% мышей соответственно, тогда как доза 400 мкг/мышь обеспечивала 100% уровень выживаемости. Мыши из контрольной группы пали в течение 1-х суток после введения летальной дозы эндотоксина E. coli O:55.
Предварительная иммунизация ЭПС S. sonnei обеспечивала дозозависимое снижение продукции макрофагами in vivo TNFa до уровня ниже 500 пг/мл, в то время как уровень TNFa у не иммунизированных животных составил более 600 пг/мл (рис. 2).
Учитывая, что все животные, иммунизированные в дозе 400 мкг/мышь, выжили, можно предположить, что концентрация TNFa ниже 400 пг/мл обеспечивает 100% выживаемость мышей (CBA*C57Bl/6)F1 при нагрузке бактериальным эндотоксином в дозе 150 мг/кг.
- 41 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2013
Умеренная активация клеток-эффекторов низкими дозами эндотоксина позволяет создать невосприимчивость к массированному вторичному попаданию ЛПС в организм благодаря феномену эндотоксической толерантности. Ранняя эндотоксическая толерантность неспецифична и характерна для эндотоксина как для класса молекулы, развивается в течение нескольких часов после попадания ЛПС в организм [5]. TNFa является маркером ранней эндотоксической толерантности, так как при повторном введении ЛПС толе-рогенным мышам наблюдается резкое падение уровня TNFa по сравнению с быстрым и мощным ростом концентрации последнего при первичном введении ЛПС [20]. Повышение выживаемости экспериментальных животных, показанное на прямой модели эндотоксичсекого шока при иммунизации ЭПС S. sonnei на фоне понижающей регуляции продукции TNFa на ранних стадиях шока, позволяет говорить об индукции ранней эндотоксической толерантности.
Заключение. ЭПС, полученный в результате культивирования S. sonnei, фаза 1, является новым биополимером углеводной природы, отличается высокой степенью безопасности: не вызывает пирогенной реакции у крыс и гибели мышей при введении в сверхвысокой дозе (1 г/кг).
Эндотоксический шок является чрезвычайно опасным патологическим состоянием организма, возникающим в результате попадании ЛПС в системный кровоток и развития эндотоксинемии. Увеличение уровня выживаемости животных при предварительном введении препарата, показанное на модели эндотоксического шока, коррелирует со снижением содержания TNFa, что свидетельствует о толерогенной активности ЭПС S. sonnei на экспериментальных животных. Понижающая регуляция продукции TNFa позволяет рассматривать в качестве возможной мишени действия препарата на данной модели макрофаги - клетки-продуценты цитокина. Умеренная толеризация макрофагов к последующему введению эндотоксина прослеживается in vivo и может рассматриваться как возможная основа протективного эффекта.
Модуляция развития ранних стадий экспериментального перитонита, отсрочка гибели иммунизированных животных (особенно на ранних стадиях) по сравнению с таковой контрольных создает предпосылки для оценки препарата ЭПС S. sonnei в клинике с целью профилактики ранних стадий септических состояний у пациентов.
ЛИТЕРАТУРА
1. Linde-Zwirbe W.T., Angus D.C., Carcillo J. et al. Age-specific incidence and outcome of sepsis in the US: analysis of incidence, outcome, and associated cost of care // Crit. Care Med. - 1999. -Vol. 27, N 1. - P. A33.
2. СавельевВ.С., Гельфанд Б.Р. Сепсис в начале XII века. Классификация, клинико-диагностическая концепция и лечение. Патолого-анатомическая диагностика. - М., 2006.
3. Bone R.C. Gram-negative sepsis: a dilemma of modern medicine // Clin. Microbiol. Rev. - 1993. - Vol. 6, N 1. - P. 57-68.
4. Cross A.S. Opal S., Cook P. et al. Development of an anti-core lipopolysaccharide vaccine for the prevention and treatment of sepsis // Vaccine. - 2004. - Vol. 22. - P. 812-817.
5. Madonna G. S., Peterson J.E., Ribi E.E., Vogel S.N. Early-phase endotoxin tolerance: induction by detoxified lipid A derative, monophosphoryl lipid A // Infect. and Immun. - 1986. - Vol. 52, N 1. - P. 6-11.
6. Bleicher P., Mackin W. Betafectin PGG-glucan: a novel carbohydrate immunomodulator with anti-infective properties // Biotech-nol. Healthcare. - 1995. - Vol. 2, N 2. - P. 207-222.
7. Kalka-Moll W.M., Tzianabos A.O., Wang Y. et al. Effect of molecular size on the ability of zwitterionic polysaccharides to stimulate cellular immunity // J. Immunol. - 2000. - Vol. 164. -P. 719-724.
8. Tzianabos A.O., OnderdonkA.B., Kasper D.L., Smith R.S. Structure-function relationships for polysaccharide-induced intraabdominal abscess // Infect. and Immun. - 1994. - Vol. 62. -P. 3590-3596.
9. Brubaker J.O., Li Q., Tzianabos A.O. et al. Mitogenic activity of purified capsular polysaccharide A from Bacteroides fragilis -differential stimulatory effect on mouse and rat lymphocytes in vitro // J. Immunol. - 1999. - Vol. 162. - P. 2235-2240.
10. TzianabosA.O., KasperD.L., CisnerosR.L. et al. Polysaccharide-mediated protection against abscess formation in experimental intra-abdominal sepsis // J. Clin. Invest. - 1995. - Vol. 96. -P. 2727-27-31.
11. Yan J.J., Jung J.S., Lee J.E. et al. Therapeutic effects of lysophosphatidylcholine in experimental sepsis. Nature Med. -2004. - Vol. 10, N 2. - P. 161-167.
12. Hubbard W.J., ChoudhryM., SchwachaM.G. et al. Cecal ligation and puncture // Shock. -2005. - Vol. 24. - P. 52-57.
13. Dinarello C.A. Immediate cytokine responses to endotoxin: Tumor necrosis factor a and interleukin-1 family // Endotoxin in Health and Disease. - New York, 1999. - P. 817-830.
14. Dixon D.R., Darveau R.P. Lipopolysaccharide heterogeneity: innate host responses to bacterial modification of lipid A structure // J. Dent. Res. - 2005. Vol. 84, N 7. - P. 584-595.
15. Requirements for Vi polysaccharide typhoid vaccine // WHO Tech. Rep. Ser. - 1994. - Vol. 84. - P. 14-36.
16. Westphal O., Jann K. Bacterial lipopolysaccharide extraction with phenol: water and further application of the procedure // Meth. Carbohydr. Chem. - 1965. - Vol. 5. - P. 83-91.
17. Feterowski C., Weighardt H., Emmanuilidis K. et al. Immune protection against septic peritonitis in endotoxin-primed mice is related to reduced neutrophil apoptosis // Eur. J. Immunol. -2001. - Vol. 31. - P. 1268-1277.
18. Lehmann B.V., Freudenberg M.A., Galanos G. Lethal toxicity of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice // J. Exp. Med. - 1987. - Vol. 165. - P. 657-663.
19. Salkowski C.A., Detore G., Franks A. et al. Pulmonary and hepatic gene expression following cecal ligation and puncture: monophosphoryl lipid A prophylaxis attenuates sepsis-indused cytokine and chemokine expression and neutrophil infiltration // Infect. and Immun. - 1998. - Vol. 66, N 8. - P. 3569-3578.
20. Schade F.U., Flach R., Flohe S. et al. Endotoxin tolerance // Endotoxin in Health and Disease. - New York, 1999. - P. 751767.
Поступила 02.04.12
- 42 -
