CC BY
146
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2012 УДК 579.861.2:579.23].083.3
И.В.Чеботарь, Е.Д.Кончакова, М.Л. Бугрова
ВЕЗИКУЛЯРНЫЕ СТРУКТУРЫ В СИСТЕМЕ «НЕЙТРОФИЛ - БИОПЛЕНКА STAPHYLOCOCCUS AuREuS"
Кафедра микробиологии и иммунологии ГБОУ ВПО Нижегородская государственная медицинская академия Минздравсоцразвития РФ (603005, Россия, г Нижний Новгород, пл. Минина и Пожарского, д.10/1)
В работе продемонстрировано, что в результате нейтрофилзависимой деструкции биопленок, полученных на основе Staphylococcus aureus, в реакционной системе образуются наноразмерные липидные образования. Трансмиссивная электронная микроскопия показала, что обнаруженные наноструктуры по морфологии были идентичны везикулам. Динамическое светорассеяние позволило оценить диаметр везикул, который составил примерно от 15 до 121 нм. Везикулы имеют способность разрушать биопленки, образованные разными штаммами Staphylococcus epidermidis, но не биопленки S. aureus. Везикулы не обладают антибактериальной активностью по отношению к планктонным формам разных штаммов S. epidermidis и S. aureus.
Ключевые слова: нейтрофилы, везикулы, биопленка, стафилококки Chebotar I.V., Konchakova E.D., Bugrova M.L.
VESICULAR STRUCTURE IN THE SYSTEM OF «NEUTROPHIL - BIOFILM STAPHYLOCOCCUS AUREUS»
The work demonstrated that as a result of neutrophil-dependent degradation of biofilms, obtained on the basis of Staphylococcus aureus, in the reaction system formed nanoscale lipid education. Transmission electron microscopy showed that the nanostructure on the morphology were identical vesicles. Dynamic flare possible to estimate the diameter of vesicles, which amounted to approximately 15 to 121 nm. The vesicles have the potential to destroy biofilm formed by different strains of Staphylococcus epidermidis, but not biofilm S. aureus. The vesicles not have antibacterial activity in relation to the planktonic forms of different strains of S. epidermidis and S. aureus.
Key words: neutrophils, vesicles, biofilm, staphylococci
Нейтрофилы обеспечивают защиту человека от пио-генных бактерий, используя разнообразные механизмы, к которым принадлежат поглощение, генерация биоцидных радикалов, активация антимикробных энзимов и пептидов, формирование нейтрофильных «ловушек» - трапов [3, 5]. Патогенные бактерии оснащены арсеналом факторов, что позволяет защищаться от фагоцитоза путем ускользания и агрессии. Золотистые стафилококки маскируются под фибриновой микрокапсулой, а также повреждают нейтрофилы своими ферментами (протеазы, ДНКазы, липазы/фосфолипазы, лейкоцидин) [1, 2]. Формирование биопленок является также одним из факторов, повышающих устойчивость стафилококков к атакам специфических и неспецифических эффекторов иммунитета [14]. Именно в биопленках можно наблюдать полный спектр факторов вирулентности бактерий, включая активацию антифагоцитарных реакций [14]. Следует, однако, сказать, что нейтрофилы не являются полностью беззащитными перед биопленочными стафилококками. Показано, что человеческие лейкоциты могут атаковать биопленки, образованные Staphylococcus aureus, и пенетрировать сквозь них [22]. Проиллюстрирована способность нейтрофилов к прямому фагоцитозу биопленочных бактерий, эффективность которого зависела от степени зрелости биопленки [17]. Показано, что адгезия нейтрофилов на биопленке почти не зависела от IgG- или С3-опсонизации; опсонизация лишь увеличивала интенсивность продукции кислородных радикалов [29].
Чеботарь Игорь Викторович - канд. мед. наук, доц. каф., тел. 8(831)465-42-71, e-mail: nizarn@yandex.ru
Нейтрофилы способны разрушать биопленки S. aureus, опсо-низированные нормальной сывороткой человека, используя фагоцитоз, сопровождавшийся высвобождением эластазы и лактоферрина [25]. В той же работе авторы наблюдали феномен высвобождения ДНК при гибели нейтрофилов. Этот феномен мог стать основой для образования нейтрофильных экстрацеллюлярных "ловушек" - трапов (NET), которые достаточно хорошо описаны в литературе [3, 12]. Формирование трапов должно сопровождаться высвобождением еще одного субстрата, который не формирует истинные растворы в водных средах. Речь идет о мембранных липидах, которые образуются в виде везикул одновременно с трапами. Этот процесс наблюдали некоторые авторы, но они расценили его лишь как вспомогательный механизм NET-формирования [27]. Эволюция нейтрофильных липидов в условиях контакта нейтрофилов с биопленками не изучалась.
Цель настоящей работы - исследовать структурнофункциональные особенности липидных дериватов, образующихся в результате взаимодействия нейтрофилов с биопленкой S. aureus.
Материалы и методы. Для получения биопленок использовали S. aureus, штамм 5983/2. Бактериальные клетки культивировали в бульоне Tryptic Soy Broth (TSB) (Becton, Dickinson и Company), содержащем 1% глюкозы. Через 24 ч инкубации (37oC) взвесь стафилококков разводили тем же бульоном до показателя мутности 0,5 на приборе DensiLaMeter II (ERBA Lachema); 1 мл содержал примерно 108 колоние-образующих единиц (КОЕ) стафилококков. По 4 мл полученной взвеси вносили в стерильные чашки Петри (диаметр 35 мм), инкубировали как стационарную культуру в течение 48 ч при 37оС.
- 35 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2013
Нейтрофилы получали из венозной гепаринизированной крови здоровых доноров, используя рутинную методику градиентного центрифугирования на фиколл-верографине с последующим изотоническим лизисом остаточных эритроцитов [6]. После 3-кратного отмывания изотоническим раствором хлорида натрия (рН 7,2) нейтрофилы ресуспенди-ровали в растворе Хенкса, содержащем 0,5% бычьего сывороточного альбумина, в концентрации 2 • 106 /мл. Чистота и жизнеспособность (по тесту с трипановым синим) полученных нейтрофилов составляла не менее 96%.
Непосредственно перед экспериментом 48-часовые биопленки на дне чашек Петри дважды отмывали от среды раствором Хенкса, 2 мл взвеси нейтрофилов аккуратно наслаивали на биопленку и инкубировали 45 мин при 37оС. После инкубации супернатант центрифугировали 30 мин при 7500 g при 4оС и фильтровали через стерильные фильтр-насадки на шприц (диаметр пор 0,2 мкм, PES-мембрана, Coming). В качестве контроля использовали чашки Петри с 48-часовой биопленкой, куда вместо нейтрофилов добавляли 2 мл раствора Хенкса, и чистые чашки Петри без биопленки, куда добавляли 2 мл суспензии нейтрофилов. Взаимодействие нейтрофилов с биопленкой контролировали при помощи лазерной сканирующей (конфокальной) микроскопии (LSM 510 Meta, Zeiss); нейтрофилы и стафилококки были окрашены флюорохромными красителями [17].
Супернатант исследовали методом трансмиссивной электронной микроскопии. Образцы фиксировали путем смешивания с эквивалентным объемом 5% раствора глюта-рового альдегида в 0,1 M Na-какодилатном буфере (pH 7,4). Из фиксированного образца забирали 30 мкл и наносили на пленку из пиолоформа на электронно-микроскопической сетке, затем окрашивали фосфорно-молибденовой кислотой (предварительно нейтрализованной раствором NaOH до рН 7,2-7,4) [8]. Высушенные образцы подвергали исследованию на электронном микроскопе Morgagni 268D (FEI).
Размеры везикул измеряли при помощи анализа динамического лазерного светорассеяния на аппарате Beckman Coulter Submicron Particle Size Analyzer (Model N5 Analazer, Beckman Coulter). Для измерения размеров везикул использовали 1 мл супернатанта, который смешивали с аналогичным количеством забуференного физиологического раствора (pH 7,2), помещали в измерительную кювету и анализировали по методике, рекомендованной фирмой-изготовителем (Beckman Coulter).
Для подтверждения фосфолипидной природы везикулярных структур супернатант, содержащий везикулы, обрабатывали фосфолипазой С, тип I (Sigma, P7633), по стандартной методике [20]. Результаты оценивали при помощи трансмиссивной электронной микроскопии, как описано выше.
Антибактериальную и антибиопленочную активность везикул изучали на планктонных культурах и биопленках клинических изолятов S. aureus (штаммы 5983/2, 5663/2, 18 A) и Staphylococcus epidermidis (штаммы 178 М, 328/5). Для изучения антибактериальной активности везикул использовали суточную культуру бактерий, выращенную на бульоне BBL Mueller Hinton Broth (Becton, Dickinson и Company), которую трижды отмывали раствором Хенкса с помощью центрифугирования и стандартизовали по оптической мутности на приборе DensiLaMeter II. Исходную концентрацию подбирали таким образом, чтобы посев 0,01 мл бактериальной суспензии на питательный агар через 24 ч давал рост примерно 100 КОЕ. К 0,5 мл стандартизованной бактериальной взвеси добавляли эквивалентный объем везикул в растворе Хенкса (здесь и в дальнейшем везикулы стандартизовали по динамическому светорассеянию), инкубировали 60 мин при 37оС. В контрольных пробах вместо везикул использовали супернатант, освобожденный от везикул ультрацентрифугированием (100 000 g, 40 мин). Из проинкубированной взвеси после тщательного пипетирования отбирали 0,02 мл и рас-севали сплошным газоном на чашки Петри (диаметр 90 мм)
с питательным агаром, инкубировали 24 ч при 37оС, подсчитывали количество КОЕ.
Для изучения антибиопленочной активности везикул использовали 2-суточные биопленки (вышеперечисленных штаммов) на среде BBL Mueller Hinton Broth (Becton, Dickinson и Company), содержащей 1% глюкозы. Биопленки
S. aureus и S. epidermidis воспроизводили на чашках Петри, как было описано выше. На поверхность биопленок, дважды отмытых раствором Хенкса, аккуратно наслаивали по 1,5 мл взвеси везикул. В контрольных пробах вместо везикул использовали супернатант, освобожденный от везикул ультрацентрифугированием (100 000 g, 40 мин). Инкубировали 60 мин при 37оС, биопленку дважды отмывали раствором Хенкса, высушивали фиксировали 95% этанолом, снова высушивали и окрашивали 1% раствором кристаллвиолета, затем ополаскивали дистиллированной водой. После высушивания смывали краситель этанолом - в каждую чашку дважды поочередно вносили аликвоты по 2 мл, которые затем смешивали. Оценивали степень окрашивания полученного этанола спектрофотометрически (длина волны 590 нм); показатели светопоглощения в опытных пробах выражали в процентах относительно аналогичных показателей соответствующих контрольных проб.
Все опыты выполняли в трех повторениях, серии экспериментов повторяли четырежды; полученные данные обсчитывали, используя как стандартные статистические методы, так и модули, входящие в пакеты программного обеспечения используемых в работе приборов (Beckman Coulter Submicron Particle Size Analyzer (Model N5), электронный микроскоп Morgagni 268D, биохемилюминометр Luminoskan Ascent).
Результаты и обсуждение. В результате исследований, проведенных при помощи конфокальной микроскопии, установлено, что нейтрофилы взаимодействовали с биопленкой, вызывая ее деструкцию. После 45 мин инкубации биопленка была разрушена практически полностью, нейтрофилы, фиксированные на остатках биопленки, проявляли признаки повреждения. В контрольных пробах (без нейтрофилов) биопленка не была поврежденной. Эта часть наших экспериментов преследовала только одну цель - получение контрольных результатов, подтверждающих факт взаимодействия нейтрофилов и биопленки. Подобные результаты были проанализированы нами ранее [7].
Рис. 1. Везикулярные структуры из системы "нейтрофилы-биопленка S. aureus". Трансмиссивная электронная микроскопия, окраска фосфорно-молибденовой кислотой. Ув. 140 000. Метка - 0,2 мкм. Стрелками показан диаметр ( в нм) везикул.
- 36 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
Рис. 2. Размер везикул, измеренный методом динамического лазерного светорассеяния.
а - супернатант из системы "нейтрофилы-биопленка S. aureus"; б и в - контрольные пробы (соответственно супернатант с биопленки S. aureus без нейтрофилов и супернатант из взвеси нейтрофилов без биопленки). По горизонтали - диаметр (в нм) везикул, по вертикали - относительное количество (в %) везикул в объеме всех везикулярных структур образца.
Супернатант, отобранный на 45-й минуте, содержал организованные структуры, которые хорошо контрастировались фосфорно-молибденовой кислотой. Эти структуры имели правильную округлую форму (рис. 1) и морфологически были похожи на везикулы. Обнаруженные везикулярные структуры (в дальнейшем - везикулы) имели размер от 20 до 50 нм (33,4 + 8,8 нм) и четкую границу с окружающей средой. На электронограммах присутствовали единичные везикулы, которые контактировали между собой. В супернатанте, полученном из контрольных проб (биопленка S. aureus 5983/2 без нейтрофилов и нейтрофилы на чашке Петри без стафилококков), везикулы отсутствовали.
При анализе размера везикул методом динамического светорассеяния получили аналогичные результаты (рис. 2): размер частиц в опытных образцах супернатанта колебался от 15,7 до 121,4 нм, составив в среднем 41,7 + 14,6 нм. В контрольных пробах (биопленка S. aureus 5983/2 без нейтрофилов и нейтрофилы на чашке Петри без стафилококков) методом динамического светорассеяния не выявили присутствия наноразмерных частиц (см. рис. 2).
На электронограммах препаратов из супернатанта системы «нейтрофилы - биопленка S. aureus", обработанного фосфолипазой C, везикулярные структуры не обнаружены. Это доказало, что главной организующей структурой везикул является фосфолипидный слой.
Результаты исследования антибактериальной активности везикул представлены в табл. 1; они демонстрируют отсутствие отличий между жизнеспособностью бактерий, проинкубированных с везикулами, и жизнеспособностью бактерий в контрольных пробах. И в том, и в другом случае количество КОЕ составляло около 100, статистически значимых различий между опытными и контрольными средними значениями не наблюдали.
Результаты оценки воздействия везикул на биопленки, сформированные различными штаммами золотистых и эпидермальных стафилококков, представлены в табл. 2. Инкубация с везикулами (60 мин) не вызывала статистически достоверных изменений окраски биопленок, сформированных золотистым стафилококком. Напротив, биопленки, образованные S. epidermidis, подвергались деструкции. Это наблюдали визуально и подтверждали спектрофотометрически (см. табл. 2). Средние значения процента светопоглощения этанола, элюирующего краситель (кристаллвиолет) с биопленок S. epidermidis, были значительно ниже в опытных образцах, для штамма 178 М составив 84,3 + 3,5% (снижение относительно контроля примерно на 16%), для штамма 328/5 -42,7 + 1,9 % (снижение относительно контроля примерно на 57%).
Обнаружение везикул стало главной находкой проделанных нами экспериментов. Присутствие везикулярных структур характерно для многих биологических объектов; в зависимости от их частных характеристик (структура, происхождение, функции) их называют мембранными микрочастицами, микровезикулами, экзосомами, эктосомами, синаптическими везикулами и т.д. [9, 13, 28;]. В тканях многоклеточных организмов обнаружены везикулы, в состав которых входили разнообразные биоактивные эффекторы [9]. В литературе хорошо описаны многочисленные функции везикулярных структур: участие в межклеточной кооперации, включая реакции гемостаза, воспаления, ангиогенеза, иммунные процессы, онкопатологию [9, 26, 28]. Фагоциты млекопитающих являются показательным примером клеток, продуцирующих везикулярные частицы. Макрофаги в ответ на микробную стимуляцию способны экскретировать экзосомы [10]. Нейтрофилы человека также генерируют мембранные наноразмерные продукты экзоцитоза («secretory vesicles") и эктосомы [11, 19]. Эктосомы нейтрофиль-ного происхождения имели диаметр 70-300 нм и содержали функционально активные энзимы (металлопротеиназа, ми-
Таблица 1
Жизнеспособность планктонных бактерий, проинкубированных с везикулами из системы "нейтрофилы - биопленка S. aureus"
Микроорганизм (планктонная форма) Количество КОЕ p
Бактерии, обработанные везикулами (опыт) Бактерии, не обработанные везикулами (контроль)
S. aureus 5983/2 105,5 + 7,5 96,8 + 5,0 > 0,05
S. aureus 5663 105,5 + 5,4 100,5 + 4,7 > 0,05
S. aureus 18 A 111,0 + 9,9 107,0 + 5,9 > 0,05
S. epidermidis 178 M 94,3 + 3,9 103,8 + 8,4 > 0,05
S. epidermidis 328/5 99,5 + 7,4 109,6 + 5,9 > 0,05
Примечание. Здесь и в табл. 2: p - достоверность различий показателей в опыте и контроле.
- 37 -
ИММУНОЛОГИЯ № 1, 2013
Таблица 2
Воздействие везикул на биопленки, сформированные различными штаммами золотистых и эпидермальных стафилококков (показатели окраски бактериальных биопленок, проинкубированных с везикулами из системы "нейтрофилы - биопленка S. aureus")
Микроорганизм, образующий биопленку Степень окраски этанола, элюирующего кристаллвиолет с биопленок, обработанных везикулами (светопоглощение в % от контрольных проб (биопленки, не обработанные везикулами), % Р
S. aureus 5983/2 96,04 ± 3,2 > 0,05
S. aureus 5663 99,2 ± 2,3 > 0,05
S. aureus 18 A 100,3 ± 1,1 > 0,05
S. epidermidis 178 M 84,3 ± 3,5 < 0,05
S. epidermidis 328/5 42,7 ± 1,9 < 0,05
елопероксидаза, эластаза, протеиназа 3) и рецепторы плазматической мембраны (селектины и интегрины, рецепторы к факторам комплемента, HLA-1, FcRIII, CD66b) [16, 19]. В наших экспериментах везикулы появлялись только в системе «нейтрофил-стафилококковая биопленка». По размеру они соответствовали везикулам, изученным в вышеназванных работах. В супернатанте стафилококковой биопленки без нейтрофилов и адгезированных на пластиковой поверхности нейтрофилов без биопленки везикулы отсутствовали. Это говорит о том, что везикулы появлялись там, где шло активное противоборство нейтрофилов и бактерий.
Известно, что бактерии тоже способны продуцировать везикулярные структуры. Это явление описано на модели грамнегативных бактерий, которые продуцировали везикулы диаметром от 20 до 300 нм; в состав этих везикул входили протеины, липополисахариды и даже нуклеиновые кислоты [15]. В биопленках грамнегативных бактерий везикулам приписывают транспортную роль [23, 24]. Об образовании везикул грампозитивными бактериями имеются лишь единичные сообщения. Везикулы, образованные золотистым стафилококком, имели диаметр от 20 до 130 нм и содержали от 90 до 143 белковых компонентов, наличие которых было подтверждено с помощью протеомных методов [18, 21].
Полагаем, что описанные нами везикулы являются комплексным продуктом, состоящим из липидных дериватов нейтрофилов и стафилококков. Литературные данные, процитированные выше, подтверждают реальность этого предположения.
Антибиопленочный эффект везикул может обсуждаться с позиции присутствия их в составе функционально активных энзимов нейтрофилов [16, 19]. Они могут оказывать повреждающее действие на обязательные атрибуты биопленки - стафилококки и матрикс, который образуется у стафилококков белковыми, полисахаридными и дезок-сирибонукеотидными полимерами [4]. Так выглядит наиболее вероятное объяснение феномена деструкции биопленки S. epidermidis под влиянием везикул. Отсутствие воздействия везикул на биопленки S. aureus может быть связано с особенностями их матрикса [4], а также с фосфолипазной активностью золотистых стафилококков [1, 2], которая могла приводить к прямому разрушению везикулярных структур.
Везикулы в системе «нейтрофилы - биопленка S. aureus", являясь, безусловно, интересной находкой, остаются структурами с не изученной ролью в эволюции биопленочного инфекционного процесса; считаем детальную расшифровку
биологической активности везикул перспективным направлением для будущих исследований.
ЛИТЕРАТУРА
1. АкатовА.К., Зуева В.С. Стафилококки. - М., 1983.
2. Дерябин Д.Г. Стафилококки: экология и патогенность. - Екатеринбург, 2000.
3. Долгушин И.И., Андреева Ю.С., Савочкина А.Ю. Нейтро-фильные внеклеточные ловушки и методы оценки функционального статуса нейтрофилов. - М., 2009.
4. Маянский А.Н., Чеботарь И.В. Стафилококковые биопленки: структура, регуляция, отторжение // Журн. микробиол. -2011.- № 1. - С. 101-108.
5. Пинегин Б.В., Маянский А.Н. Нейтрофилы: структура и функция // Иммунология. - 2007. - № 6. - С. 374-382.
6. Подосинников И.С., Нилова Л.Г, Бабаченко И.Б. Метод определения хемотаксической активации лейкоцитов // Лаб. дело.
- 1981. - № 8. - С. 468-470.
7. Чеботарь И.В., Кончакова Е.Д., Евтеева Н.И. Нейтрофилза-висимое разрушение биопленок, образованных Staphylococcus aureus // Журн. микробиол. - 2012. - № 1. - С. 10-15.
8. Bello V., Mattei G., Mazzoldi P. et al. Transmission electron microscopy of lipid vesicles for drug delivery: Comparison between positive and negative staining // Microsc. Microanal. 2010. - Vol. 16. - P. 456-461.
9. Benedicte H., Carmen M.M., Corinne K., Freyssinet J.-M. Membrane microparticles: Two sides of the coin // Physiology. - 2005
- Vol. 20. - Р. 22-27.
10. Bhatnagar S., Shinagawa K., Castellino F.J., Schorey J.S. Exosomes released from macrophages infected with intracellular pathogens stimulate a proinflammatory response in vitro and in vivo // Blood. - 2007 - Vol. 110, № 9. - P 3234-3244.
11. Borregaard N., Kjeldsen L., Lollike K., Senge0v H. Granules and secretory vesicles of the human neutrophil // Clin. Exp. Immunol.
- 1995. - Vol. 101, № 1. - P 6-9.
12. Brinkmann V., Reichard U., Goosmann C. et al. Neutrophil extracellular traps kill bacteria // Science. - 2004. - Vol. 303. -P. 1532-1535.
13. BykhovskaiaM. Synapsin regulation of vesicle organization and functional pools // Semin. Cell Dev. Biol. - 2011. - Vol. 22, №
4. - P. 387-392.
14. Donlan R.M., Costerton J.W. Biofilms: Survival mechanisms of clinically relevant microorganisms // Clin. Microbiol. Rev. -2002. - Vol. 15, № 2. -P. 167-193.
15. Ellis T.N., Kuehn M.J. Virulence and immunomodulatory roles of bacterial outer membrane vesicles // Microbiol. Mol. Biol. Rev. -2010. - Vol. 74. - P. 81-94.
16. Gasser O., Hess C., MiotS. et al. Characterisation and properties of ectosomes released by human polymorphonuclear neutrophils // Exp. Cell Res. - 2003. - Vol. 285, № 2. - P. 243-257.
17. Gunther F., Wabnitz G.H., Stroh P. et al. Host defence against Staphylococcus aureus biofilms infection: phagocytosis of biofilms by polymorphonuclear neutrophils (PMN) // Mol. Immunol. - 2009. - Vol. 46, № 8-9. - P 1805-1813.
18. Gurung M., Moon D.C., Choi C.W. et al. Staphylococcus aureus produces membrane-derived vesicles that induce host cell death // PloS One. - 2011. - Vol. 6, № 11. - P. e27958.
19. Hess C., Sadallah S., HeftiA. et al. Ectosomes released by human neutrophils are specialized functional units // J. Immunol. - 1999.
- Vol. 163. - P. 4564-4573.
20. Higgins J.A. Fine-structural changes in rat liver microsomes treated with phospholipase C // J. Cell Sci. - 1982. - Vol. 53. - P. 211-225.
21. Lee E.Y., Choi D.Y., Kim D.K. et al. Gram-positive bacteria produce membrane vesicles: proteomics-based characterization of Staphylococcus aureus-derived membrane vesicles // Proteomics. - 2009. - Vol. 9. - P. 5425-5436.
22. Leid J.G., ShirtliffM.E., Costerton J.W., StoodleyP. Human leukocytes adhere to, penetrate, and respond to Staphylococcus aureus biofilms // Infect. and Immun. - 2002. - Vol. 70. - P. 6339-6345.
23. Mashburn-Warren L., Howe J., Garidel P. et al. Interaction ofquo-
- 38 -
ИНФЕКЦИОННАЯ ИММУНОЛОГИЯ
rum signals with outer membrane lipids: insights into prokaryotic membrane vesicle formation // Mol. Microbiol. - 2008. - Vol. 69, № 2. - P. 491-502.
24. Mashburn-Warren L.M., Whiteley M. Special delivery: vesicle trafficking in prokaryotes // Mol. Microbiol. -2006. - Vol. 61, № 4. - P. 839-846.
25. Meyle E., Stroh P., Gunther F. et al. Destruction of bacterial biofilms by polymorphonuclear neutrophils: relative contribution of phagocytosis, DNA release, and degranulation // Int. J. Artif. Organs. - 2010. - Vol. 33, № 9. - P. 608-620.
26. Pap E., PallingerE., PasztoiM., Falus A. Highlights of a new type of intercellular communication: microvesicle-based information transfer // Inflamm. Res. - 2009. - Vol. 58, № 1. - P. 1-8.
27. Pilsczek F.H., Salina D., Poon K.K. et al. A novel mechanism of rapid nuclear neutrophil extracellular trap formation in response to Staphylococcus aureus // J. Immunol. - 2010. - Vol. 185, № 12. - P. 7413-7425.
28. Sadallah S., Eken C., Schifferli J. A. Ectosomes as modulators of inflammation and immunity // Clin. Exp. Immunol. - 2010. -Vol. 63. - P. 26-32.
28. Stroh P., Gunther F., Meyle E. et al. Host defence against Staphylococcus aureus biofilms by polymorphonuclear neutrophils: oxygen radical production but not phagocytosis depends on op-sonisation with immunoglobulin G // Immunobiology. - 2011. - Vol. 216, № 3. - P. 351-357.
Поступила 10.05.12
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2013 УДК 615.373.03:616.94-036.11].079.6
А.А. Маркина1, В.Л. Львов2, П.Г. Апарин1
КОРРЕКЦИЯ СЕПТИЧЕСКОГО И ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО ШОКА ПРИ ИММУНИЗАЦИИ
цвиттерионным экзополисахаридом shigella sonnei, фаза 1
1Лаборатория полисахаридных вакцин, Лаборатория препаративной биохимии ФГБУ ГНЦ Института иммунологии ФМБА России (115478, Россия, г Москва, Каширское ш., д. 24, корп. 2) Институт иммунологии. Тел: 8(499)616-49-25; e-mail: institute@immune.umos.ru
Из энтеробактерии Shigella sonnei, фаза 1, выделен новый природный вариант цвиттерионного полисахарида -экзополисахарид (ЭПС), в состав которого входит липидный компонент, представляющий собой диацилглицерофосфат, а повторяющееся звено идентично с таковым О-специфичного полисахарида S. sonnei. Препарат ЭПС отличался высокой степенью безопасности: не вызывал пирогенной реакции у крыс и гибели мышей при введении в сверхвысокой дозе (1 г/кг). При профилактической иммунизации ЭПС отмечены замедление развития экспериментального перитонита и продление времени выживаемости мышей (CBA*C57B1/6)F1 при развитии септического процесса. При предварительном введении препарат также эффективно обеспечивал выживаемость мышей и подавлял продукцию фактора некроза опухоли а при нагрузке бактериальным эндотоксином E.coli 0:55 в дозе 150 мг/кг.
Ключевые слова: экзополисахарид, Shigella sonnei, септический шок, эндотоксический шок A. A. Markina, V L. Lvov
APARIN CORRECTION OF SEPTIC AND ENDOTOXIC SHOCK WHEN IMMUNIZATION ZWITTERIONIC EXOPOLYSACCHARIDES SHIGELLA SONNEI, PHASE 1
From enterobacterien Shigella sonnei, phase 1, a new natural variant of zwitterionic polysaccharide - exopolysaccharide (EPS), which includes the lipid component, representing the diacilglycerophosphate, and repeated the link are identical with those of The o-specific polysaccharide S.sonnei. The drug EPMs possessed a high degree of security: not called for pyrogenic reactions in rats and death of mice when administered in high doses (1 g/kg). When preventive immunization EPMs noted slowing down the development of the experimental peritonitis and the extension of the time of the survival rate of mice (CBA*C57B1/6)F1 in the development of septic process. In the preliminary introduction the drug also effectively ensured the survival rate of mice, and mastered the production of TNF-а with a load of bacterial endotoxine E.coli O:55 in the dose of 150 mg/kg.
Key words: exopolysaccharide, Shigella sonnei, septic shock, endotoxic shock
Септические и эндотоксические шоковые состояния, вызванные массивным попаданием в организм пациента грамо-трицательных бактерий или их эндотоксина (липополисахарида - ЛПС), относят к клиническим патологиям, в лечении которых не удается достичь существенного успеха. В мире
Маркина Анна Александровна - мл. науч. сотр., тел. 8(909)931-61-25, e-mail: markinanna@mail.ru
ежегодно диагностируют 1,5 млн случаев септических состояний, которые занимают первое место по смертности пациентов в отделениях реанимации и интенсивной терапии не кардиологического профиля и 11-е место среди всех причин смертности населения [1, 2]. Ежегодно от сепсиса умирают около 500 тыс. человек [3].
Поиск биологически активных веществ - потенциальных модуляторов течения (профилактики) как эндотоксического, так и септического шока, является одной из актуальных задач современной фармакологии. Биополимеры углеводной
- 39 -
