CC BY
19
УДК 616-002:579.842.15
ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ
БИОПОЛИМЕРОВ УГЛЕВОДНОЙ ПРИРОДЫ SHIGELLA SONNEI НА МОДЕЛЯХ ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО ШОКА
А.А. Маркина, И.А. Кондратьева
(кафедра иммунологии; e-mail: markinanna@mail.ru)
Проведено исследование толерогенных свойств нового апирогенного, низкоэндотоксич-ного комплексного препарата на основе биополимеров углеводной природы Shigella sonnei на D-галактозаминовой и прямой моделях эндотоксического шока. Профилактическое введение препарата защищает мышей (CBA х C57Bl/6)F1 от гибели при введении летальных доз эндотоксина E. coli 0:55. На прямой модели эндотоксического шока было показано, что повышение дозы иммунизации коррелирует с увеличением выживаемости и снижением уровня ФНО-а в сыворотках крови экспериментальных животных.
Ключевые слова: эндотоксический шок, экзополисахарид, липополисахарид, Shigella sonnei, эндотоксическая толерантность, ФНО-а.
Сепсис, обусловленный действием грамотрица-тельных бактерий, является одной из причин развития серьезных осложнений при хирургических вмешательствах, а также при травмах и ожогах. Несмотря на применение антибиотиков последнего поколения, обладающих широким спектром действия, и высокотехнологичных методов лечения сепсис остается патологическим состоянием, ассоциированным с высоким уровнем летальности, которая при септическом (эндотоксическом) шоке достигает 50% [1]. Неэффективность иммунотерапии на фоне септических состояний и при хирургических вмешательствах диктует необходимость разработки новых подходов не только к лечению сепсиса, но и к предотвращению, профилактике, подготовке пациента к возможному септическому состоянию.
Эндотоксический шок развивается при попадании бактериального эндотоксина (липополисахарида, ЛПС) — компонента клеточной стенки грамотрица-тельных бактерий — в организм в чистом виде, деструктивная роль которого заключается в массированной выработке провоспалительных цитокинов, прежде всего ФНО-а и ИЛ-1Р [2, 3]. Их чрезмерная продукция обусловливает запуск патологических процессов, характерных для сепсиса: генерализация воспаления, повреждение эндотелия сосудов, активация коагуляции и снижение фибринолиза. Эти нарушения могут привести к развитию синдрома диссеми-нированного внутрисосудистого свертывания крови, гипоксии тканей и, как следствие, к повреждению тканей и органной дисфункции [4], которая в совокупности с устойчивой гипотензией приводит к развитию эндотоксического (септического) шока.
В последние годы была сформулирована концепция иммунопрофилактики эндотоксического шока, направленная на разработку противошоковых вакцин
с использованием биополимеров углеводной природы (БУП), применение которыгх позволит создать рефрак-терность (устойчивость) организма к последующему массивному попаданию бактериального эндотоксина. Несмотря на важность проблемы, количество работ по профилактике эндотоксического шока ограничено, так как связано в том числе и с использованием ЛПС, уровень эндотоксичности которого не позволяет использовать его в клинической практике [5].
В настоящем исследовании мы проводили оценку принципиальной возможности коррекции эндотоксического шока при профилактической иммунизации мышей (CBA х C57Bl/6)F1 новыш апирогенныш низкоэндотоксичным комплексным препаратом на основе БУП S. sonnei — экзополисахарида (ЭПС) и на-тивного (0,1% по массе), обладающего полноценной эндотоксической активностью, ЛПС с использованием экспериментальных моделей эндотоксического шока.
Методы
Модель эндотоксического шока на мышах (CBA х C57B1/6)F1, сенсибилизированных D-галактозамином.
Мышам (СВА х C57Bl/6)F1 (филиал "Андреев-ка" НЦБМТ РАМН, Россия) весом 20—22 г вводили внугрибрюшинно (в/б) комплексный препарат (ЭПС + ЛПС) S. sonnei в разныгх дозах (0,1; 1; 10 или 25 мкг/мышь) за 12 ч до введения 0,1 мкг стандартного эндотоксина E. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США) (далее — ЛПС E. coli 0:55) совместно с 15 мг D-GalN (Alfa Aesar, Германия) в 0,5 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия (физраствор). Группу контрольных мышей составили особи, которым вводили в/б 0,5 мл
физраствора за 12 ч до введения D-галактозамина и ЛПС E. coli 0:55 в тех же дозах, что и иммунизированным животным.
Прямая модель эндотоксического шока
Мышам (CBA х C57B1/6)F1 в/б вводили летальную дозу 2 мг/мышь ЛПС E. coli 0:55 без сенсибилизаторов через 72 ч после их в/б иммунизации комплексным препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei в дозах 100, 200 или 400 мкг/мышь в 0,5 мл физраствора. Группу контрольных мышей составили особи, которым вводили в/б 0,5 мл физраствора за 72 ч до введения 2 мг ЛПС E. coli О:55.
Содержание ФНО-а в сыворотках крови интакт-ных и иммунизированных комплексным препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei мышей определяли с помощью тест-системы Quatikine Mouse TNF a/TNFSF1A (R&D Systems, США) методом твердофазного имму-ноферментного анализа согласно стандартной методике производителя. Кровь для анализа брали через 90 мин [6] после индукции эндотоксического шока по методу, описанному выше.
Результаты и обсуждение
Профилактика эндотоксического шока
при предварительном введении комплексного
препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei
Изучение протективных свойств комплексного препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei непосредственно от патологического действия ФНО-а in vivo проводили на модели эндотоксического шока с использованием сенсибилизатора эндотоксичности — D-га-лактозамина (D-GalN). Клетки печени участвуют в процессах элиминации ЛПС из кровотока, детокси-кации ЛПС и в продуцировании медиаторов воспаления в ответ на присутствие эндотоксина в кровотоке [7]. D-GalN истощает запасы уридинтрифосфата в печени, в результате чего нарушается синтез мембранных гликопротеинов, гликогена, что приводит к повреждению и гибели гепатоцитов и клеток Куп-фера, печень утрачивает защитную функцию и, как следствие, понижается порог чувствительности организма мышей не только к ЛПС, но и к ФНО-а [8], который играет решающую роль в гибели мышей при введении D-GalN/ЛПС [9] за счет специфичного апоптоза гепатоцитов и острой печеночной недостаточности [10].
При профилактической иммунизации мышей в дозах 0,1; 1; 10 или 25 мкг/мышь комплексный препарат (ЭПС + ЛПС) S. sonnei обеспечивал 100% выживаемость животных при индукции эндотоксическо-го шока с применением D-GalN. В течение первых 24 ч гибель контрольных мышей составила 100%. Защитное действие комплексного препарата, с учетом механизма действия D-GalN, связано с подавлением синтеза ФНО-а в печени.
Прямая модель эндотоксического шока воспроизводит такой важный патогенетический аспект клинического течения шока, как массированное поступление (выброс) бактериального эндотоксина в организм больного за счет введения летальной дозы ЛПС E. coli 0:55, составляющей 150 мг/кг. Первичная умеренная активация клеток при низких дозах эндотоксина позволяет создать невосприимчивость к массированному (в летальных дозах) вторичному попаданию ЛПС в организм. Данный феномен получил название эндотоксической толерантности. Использование ЛПС грамотрицательных бактерий в качестве агента для коррекции эндотоксического шока основано на феномене ранней эндотоксической толерантности, в основе которой лежит блокирование связывания бактериального эндотоксина с TLR4 рецепторами или нарушение передачи сигнала от рецепторного комплекса TLR4/MD-2 и продукции провоспалительных цито-кинов [11]. Ранняя эндотоксическая толерантность неспецифична и развивается через 3—4 дня после введения эндотоксина [5], поэтому толерогенное действие препарата оценивали по выживаемости животных в течение 3 дней после введения ЛПС E. coli 0:55 (таблица).
Выживаемость мышей (CBA х C57B1/6)F1 на прямой модели эндотоксического шока при иммунизации препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei
Доза препарата Количество Гибель мышей (часы) % выжи-
(мкг/мышь) мышей 0—24 24—48 48—72 ваемости
400 10 0 0 0 100
200 10 1 0 0 90
100 10 2 2 0 60
Контроль (0 мкг) 10 8 2 — 0
Выживаемость животных, иммунизированных комплексным препаратом в дозе 400 мкг/мышь, составила 100%. Иммунизация в дозах 200 и 100 мкг к исходу 3-х сут обеспечила соответственно 90 и 60% уровни выживаемости мышей. Гибель контрольной группы к исходу 2-х сут составила 100%. Полученные данные показывают, что введение препарата (ЭПС + ЛПС) 5. $опп& защищает животных от последующего введения эндотоксина в летальной дозе, причем была выявлена зависимость доза—эффект: повышение дозы иммунизации коррелирует с увеличением выживаемости животных.
С использованием прямой модели эндотоксиче-ского шока было установлено, что развитие сепсиса происходит в результате острого воспалительного процесса в ответ на быструю массивную продукцию цитокинов: при введении эндотоксина экспериментальным животным или добровольцам у последних отмечают жар, тахикардию и системные симптомы воспаления, которые совпадают по времени с пиком ФНО-а в сыворотке [12], а возрастание концентра-
Уровень ФНО-а в крови мышей (CBA х C57B1/6)F1 через 90 мин после введения эндотоксина E. coli O:55 на прямой модели эндо-токсического шока при иммунизации препаратом (ЭПС + ЛПС)
S. sonnei
ции ФНО-а в сыворотке коррелирует с гибелью пациентов от грамотрицательного сепсиса [13]. Поэтому помимо выживаемости животных на прямой модели эндотоксического шока мы параллельно контролировали уровень ФНО-а в сыворотках периферической крови у интактных и толеризированных мышей. Предварительная иммунизация препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei обеспечивала снижение продукции ФНО-а макрофагами in vivo до уровня ниже 500 пг/мл, в то время как уровень ФНО-а в группе контроля составил более 1000 пг/мл (рисунок).
Зарегистрированная нами при введении комплексного препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei понижающая регуляция уровней ФНО-а ниже 400 пг/мл достаточна для обеспечения 100% выживаемости мышей линии (CBA х C57Bl/6)F1 при индукции эндотоксического шока, вызванного введением массивных количеств эндотоксина E. coli О:55 до 150 мг/кг.
Ранняя эндотоксическая толерантность характеризуется снижением продукции провоспалительных
цитокинов мононуклеарными фагоцитами в ответ на повторное введение ЛПС [14]. ФНО-а является маркером эндотоксической толерантности, так как при повторном введении ЛПС толерогенным мышам наблюдается резкое падение уровня ФНО-а по сравнению с быстрым и мощным ростом концентрации последнего при первичном введении ЛПС [15]. Таким образом, угнетение выработки ФНО-а при эндо-токсическом шоке является положительным прогностическим признаком исхода заболевания, а эндоток-сическая толерантность представляет собой защитный механизм, снижающий степень воспалительного ответа, и ассоциируется с увеличением резистентности и защиты тканей от повреждения и гибели экспериментальных животных.
Выводы
При профилактической иммунизации мышей (CBA х C57Bl/6)F1 комплексным препаратом (ЭПС + + ЛПС) S. sonnei нами впервые были зарегистрированы эффекты профилактики течения моделируемого в эксперименте эндотоксического шока. Несмотря на низкую эндотоксичность, комплексный препарат обладает мощным толерогенным действием, защищая экспериментальных животных от гибели за счет понижающей регуляции продукции ФНО-а на фоне эндотоксического шока, индуцируемого введением летальной дозы эндотоксина E. coli О:55, составляющей 150 мг/кг. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что эффект при профилактическом введении препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei был обеспечен феноменом ранней эндотоксической толерантности.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Cross A.S., Opal S.M., Warren H.S., Palardy J.E., Glaser K., Parejo A., Bhattacharjee A.K. Active immunization with a detoxified Escherichia coli J5 lipopolysaccharide group B meningococcal outer membrane protein complex vaccine protects animals from experimental sepsis //J. Infect. Dis. 2001. N 183. P. 1079-1086.
2. Astiz M.E., Rackow E.C. Septic shock // Lancet. 1998. N 361. P. 1501-1505.
3. Dinarello C. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock // Curr. Topics Microbiol. Immunol. 1996. N 216. P. 133-165.
4. Ulloa L., Tracey K.J. The "cytokine profile": a code for sepsis // Trends Mol. Med. 2005. N 11. P. 56-63.
5. Madonna G.S., Peterson J.E., Ribi E.E., Vogel S.N. Early-phase endotoxin tolerance: induction by detoxified lipid A derative, monophosphoryl lipid A // Infect. Immun. 1986. N 52. Vol. 1. P. 6-11.
6. Dinarello C.A. Immediate cytokine responses to endotoxin: tumor necrosis factor a and interleukin-1 family // Endotoxin in Health and Disease / Ed. H. Brade. New York: Marcell Dekker, 1999. P. 817-830.
7. van Amersfoort E.S., van Berkel T.J., Kuiper J. Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis
and septic shock // Clin. Microbial. Rev. 2003. N 16. Vol. 3. P. 379-414.
8. Lehmann B.V., Freudenberg M.A., Galanos G. Lethal toxicity of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice //J. Exp. Med. 1987. N 165. P. 657-663.
9. Tiegs G., Wolter M., Wendel A. Tumour necrosis factor is a terminal mediator in galactosamine/endotoxin-induced hepatitis in mice // Biochem. Pharmacol. 1989. N 38. P. 627—631.
10. Mignon A., Rouquet N, Fabre M., Martin S., Pages J.C., Dhainaut J.F., Kahn A., Briand P., Joulin V.LPS challenge in D-galactosamine-sensitized mice accounts for caspase-dependent fulminant hepatitis, not for septic shock // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999. N 159. P. 1308—1315.
11. Johnston C.A., Greisman S.E. Mechanism of endotoxin tolerance // Handbook of Endotoxin. Vol. 2. Pathophysiology of endotoxin / Ed. L.B. Hishaw. New York: Elsever, 1985. P. 359—391.
12. Suffredini A.F., Reda D., Banks S.M., Tropea M., Agosti J.M., Miller R. Effects of recombinant dimeric TNF-a receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration // J. Immunol. 1995. N 155. P. 5038—5045.
13. Marano M.A., Fong Y, Moldawer L.L., Wei H., Cal-vano S.E., Tracey K.J., Barie J.S., Manogue K., Cerami A., Shires G.T.G., Lowry S.F. Serum cachectin/tumor necrosis factor in critically ill patients with burns correlate with infection and mortality // Surg. Gynecol. Obset. 1990. N 170. P. 32-38.
14. Christman J.W., Lancaster L.H., Blackwell T.S. Nuclear factor sB: a pivotal role in the systemic inflammatory res-
ponse syndrome and new target for therapy // Intens. Care Med. 1998. N 24. P. 1131-1138.
15. Schade F.U., Flach R, Flohe S, Majetschak M., Kreuzfelder E, Dominguez-Fernandes E., Borgermann J., Reuter M, Obertacke U. Endotoxin tolerance // Endotoxin in Health and Disease / Ed. H. Brade. New York: Marcell Dekker, 1999. P. 751-767.
Поступила в редакцию 15.05.12
INVESTIGATION OF PROTECTIVE PROPERTIES
OF SHIGELLA SONNEI CARBOHYDRATE BIOPOLYMERS
UNDER EXPERIMENTAL ENDOTOXIC SHOCK MODELS
A.A. Markina, I.A. Kondratieva
Study tolerogenic properties of new non-pyrogenic low-endotoxic complex preparation composed of Shigella sonnei carbohydrate biopolymers under D-galactosamine and direct experimental endotoxic shock models. Pretreatment with complex preparation protects mice (CBA x C57Bl/6)F1 against lipopolysaccharide (E. coli O:55) — mediated death. We demonstrate correlation between increasing pre-immunization dose of complex preparation with rate of survival and reduction of TNF-a serum level under direct endotoxic shock model.
Key words: endotoxic shock, exopolysaccharide, lipopolysaccharide, Shigella sonnei, endotoxin tolerance, TNF-a.
Сведения об авторе
Маркина Анна Александровна — мл. науч. сотр. лаборатории полисахаридных вакцин ФГБУ "ГНЦ Института иммунологии" ФМБА России. Тел.: 8-909-931-61-25, 8-499-618-67-83; e-mail: markinanna@mail.ru
Кондратьева Ирина Анатольевна — канд. биол. наук, доц. Международного учебно-научного биотехнологического центра. Тел.: 8-926-247-74-53; e-mail: kondratieva9@gmail.com
