Научная статья на тему 'Исследование защитных свойств биополимеров углеводной природы Shigella sonnei на моделях эндотоксического шока'

Исследование защитных свойств биополимеров углеводной природы Shigella sonnei на моделях эндотоксического шока Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

CC BY
79
17
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.
Ключевые слова
ЭНДОТОКСИЧEСКИЙ ШОК / ENDOTOXIC SHOCK / ЭКЗОПОЛИСАХАРИД / EXOPOLYSACCHARIDE / ЛИПОПОЛИСАХАРИД / LIPOPOLYSACCHARIDE / SHIGELLA SONNEI / ЭНДОТОКСИЧEСКАЯ ТОЛЕРАНТНОСТЬ / ENDOTOXIN TOLERANCE / ФНО-A / TNF-A

Аннотация научной статьи по фундаментальной медицине, автор научной работы — Маркина Анна Александровна, Кондратьева Ирина Анатольевна

Проведено исследование толерогенных свойств нового апирогенного, низкоэндотоксичного комплексного препарата на основе биополимеров углеводной природы Shigella sonnei на D-галактозаминовой и прямой моделях эндотоксического шока. Профилактическое введение препарата защищает мышей (CBA Ѕ C57Bl/6)F1 от гибели при введении летальных доз эндотоксина E. coli О:55. На прямой модели эндотоксического шока было показано, что повышение дозы иммунизации коррелирует с увеличением выживаемости и снижением уровня ФНО-a в сыворотках крови экспериментальных животных.

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Похожие темы научных работ по фундаментальной медицине , автор научной работы — Маркина Анна Александровна, Кондратьева Ирина Анатольевна

iНе можете найти то, что вам нужно? Попробуйте сервис подбора литературы.
i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.

Investigation of protective properties of Shigella sonnei carbohydrate biopolymers under experimental endotoxic shock models

Study tolerogenic properties of new non-pyrogenic low-endotoxic complex preparation composed of Shigella sonnei carbohydrate biopolymers under D-galactosamine and direct experimental endotoxic shock models. Pretreatment with complex preparation protects mice (CBA Ѕ C57Bl/6)F1 against lipopolysaccharide ( E. coli O:55) — mediated death. We demonstrate correlation between increasing pre-immunization dose of complex preparation with rate of survival and reduction of TNF-a serum level under direct endotoxic shock model.

Текст научной работы на тему «Исследование защитных свойств биополимеров углеводной природы Shigella sonnei на моделях эндотоксического шока»

УДК 616-002:579.842.15

ИССЛЕДОВАНИЕ ЗАЩИТНЫХ СВОЙСТВ

БИОПОЛИМЕРОВ УГЛЕВОДНОЙ ПРИРОДЫ SHIGELLA SONNEI НА МОДЕЛЯХ ЭНДОТОКСИЧЕСКОГО ШОКА

А.А. Маркина, И.А. Кондратьева

(кафедра иммунологии; e-mail: markinanna@mail.ru)

Проведено исследование толерогенных свойств нового апирогенного, низкоэндотоксич-ного комплексного препарата на основе биополимеров углеводной природы Shigella sonnei на D-галактозаминовой и прямой моделях эндотоксического шока. Профилактическое введение препарата защищает мышей (CBA х C57Bl/6)F1 от гибели при введении летальных доз эндотоксина E. coli 0:55. На прямой модели эндотоксического шока было показано, что повышение дозы иммунизации коррелирует с увеличением выживаемости и снижением уровня ФНО-а в сыворотках крови экспериментальных животных.

Ключевые слова: эндотоксический шок, экзополисахарид, липополисахарид, Shigella sonnei, эндотоксическая толерантность, ФНО-а.

Сепсис, обусловленный действием грамотрица-тельных бактерий, является одной из причин развития серьезных осложнений при хирургических вмешательствах, а также при травмах и ожогах. Несмотря на применение антибиотиков последнего поколения, обладающих широким спектром действия, и высокотехнологичных методов лечения сепсис остается патологическим состоянием, ассоциированным с высоким уровнем летальности, которая при септическом (эндотоксическом) шоке достигает 50% [1]. Неэффективность иммунотерапии на фоне септических состояний и при хирургических вмешательствах диктует необходимость разработки новых подходов не только к лечению сепсиса, но и к предотвращению, профилактике, подготовке пациента к возможному септическому состоянию.

Эндотоксический шок развивается при попадании бактериального эндотоксина (липополисахарида, ЛПС) — компонента клеточной стенки грамотрица-тельных бактерий — в организм в чистом виде, деструктивная роль которого заключается в массированной выработке провоспалительных цитокинов, прежде всего ФНО-а и ИЛ-1Р [2, 3]. Их чрезмерная продукция обусловливает запуск патологических процессов, характерных для сепсиса: генерализация воспаления, повреждение эндотелия сосудов, активация коагуляции и снижение фибринолиза. Эти нарушения могут привести к развитию синдрома диссеми-нированного внутрисосудистого свертывания крови, гипоксии тканей и, как следствие, к повреждению тканей и органной дисфункции [4], которая в совокупности с устойчивой гипотензией приводит к развитию эндотоксического (септического) шока.

В последние годы была сформулирована концепция иммунопрофилактики эндотоксического шока, направленная на разработку противошоковых вакцин

с использованием биополимеров углеводной природы (БУП), применение которыгх позволит создать рефрак-терность (устойчивость) организма к последующему массивному попаданию бактериального эндотоксина. Несмотря на важность проблемы, количество работ по профилактике эндотоксического шока ограничено, так как связано в том числе и с использованием ЛПС, уровень эндотоксичности которого не позволяет использовать его в клинической практике [5].

В настоящем исследовании мы проводили оценку принципиальной возможности коррекции эндотоксического шока при профилактической иммунизации мышей (CBA х C57Bl/6)F1 новыш апирогенныш низкоэндотоксичным комплексным препаратом на основе БУП S. sonnei — экзополисахарида (ЭПС) и на-тивного (0,1% по массе), обладающего полноценной эндотоксической активностью, ЛПС с использованием экспериментальных моделей эндотоксического шока.

Методы

Модель эндотоксического шока на мышах (CBA х C57B1/6)F1, сенсибилизированных D-галактозамином.

Мышам (СВА х C57Bl/6)F1 (филиал "Андреев-ка" НЦБМТ РАМН, Россия) весом 20—22 г вводили внугрибрюшинно (в/б) комплексный препарат (ЭПС + ЛПС) S. sonnei в разныгх дозах (0,1; 1; 10 или 25 мкг/мышь) за 12 ч до введения 0,1 мкг стандартного эндотоксина E. coli 0:55 (Sigma-Aldrich, США) (далее — ЛПС E. coli 0:55) совместно с 15 мг D-GalN (Alfa Aesar, Германия) в 0,5 мл 0,9%-го раствора хлорида натрия (физраствор). Группу контрольных мышей составили особи, которым вводили в/б 0,5 мл

физраствора за 12 ч до введения D-галактозамина и ЛПС E. coli 0:55 в тех же дозах, что и иммунизированным животным.

Прямая модель эндотоксического шока

Мышам (CBA х C57B1/6)F1 в/б вводили летальную дозу 2 мг/мышь ЛПС E. coli 0:55 без сенсибилизаторов через 72 ч после их в/б иммунизации комплексным препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei в дозах 100, 200 или 400 мкг/мышь в 0,5 мл физраствора. Группу контрольных мышей составили особи, которым вводили в/б 0,5 мл физраствора за 72 ч до введения 2 мг ЛПС E. coli О:55.

Содержание ФНО-а в сыворотках крови интакт-ных и иммунизированных комплексным препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei мышей определяли с помощью тест-системы Quatikine Mouse TNF a/TNFSF1A (R&D Systems, США) методом твердофазного имму-ноферментного анализа согласно стандартной методике производителя. Кровь для анализа брали через 90 мин [6] после индукции эндотоксического шока по методу, описанному выше.

Результаты и обсуждение

Профилактика эндотоксического шока

при предварительном введении комплексного

препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei

Изучение протективных свойств комплексного препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei непосредственно от патологического действия ФНО-а in vivo проводили на модели эндотоксического шока с использованием сенсибилизатора эндотоксичности — D-га-лактозамина (D-GalN). Клетки печени участвуют в процессах элиминации ЛПС из кровотока, детокси-кации ЛПС и в продуцировании медиаторов воспаления в ответ на присутствие эндотоксина в кровотоке [7]. D-GalN истощает запасы уридинтрифосфата в печени, в результате чего нарушается синтез мембранных гликопротеинов, гликогена, что приводит к повреждению и гибели гепатоцитов и клеток Куп-фера, печень утрачивает защитную функцию и, как следствие, понижается порог чувствительности организма мышей не только к ЛПС, но и к ФНО-а [8], который играет решающую роль в гибели мышей при введении D-GalN/ЛПС [9] за счет специфичного апоптоза гепатоцитов и острой печеночной недостаточности [10].

При профилактической иммунизации мышей в дозах 0,1; 1; 10 или 25 мкг/мышь комплексный препарат (ЭПС + ЛПС) S. sonnei обеспечивал 100% выживаемость животных при индукции эндотоксическо-го шока с применением D-GalN. В течение первых 24 ч гибель контрольных мышей составила 100%. Защитное действие комплексного препарата, с учетом механизма действия D-GalN, связано с подавлением синтеза ФНО-а в печени.

Прямая модель эндотоксического шока воспроизводит такой важный патогенетический аспект клинического течения шока, как массированное поступление (выброс) бактериального эндотоксина в организм больного за счет введения летальной дозы ЛПС E. coli 0:55, составляющей 150 мг/кг. Первичная умеренная активация клеток при низких дозах эндотоксина позволяет создать невосприимчивость к массированному (в летальных дозах) вторичному попаданию ЛПС в организм. Данный феномен получил название эндотоксической толерантности. Использование ЛПС грамотрицательных бактерий в качестве агента для коррекции эндотоксического шока основано на феномене ранней эндотоксической толерантности, в основе которой лежит блокирование связывания бактериального эндотоксина с TLR4 рецепторами или нарушение передачи сигнала от рецепторного комплекса TLR4/MD-2 и продукции провоспалительных цито-кинов [11]. Ранняя эндотоксическая толерантность неспецифична и развивается через 3—4 дня после введения эндотоксина [5], поэтому толерогенное действие препарата оценивали по выживаемости животных в течение 3 дней после введения ЛПС E. coli 0:55 (таблица).

Выживаемость мышей (CBA х C57B1/6)F1 на прямой модели эндотоксического шока при иммунизации препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei

Доза препарата Количество Гибель мышей (часы) % выжи-

(мкг/мышь) мышей 0—24 24—48 48—72 ваемости

400 10 0 0 0 100

200 10 1 0 0 90

100 10 2 2 0 60

Контроль (0 мкг) 10 8 2 — 0

Выживаемость животных, иммунизированных комплексным препаратом в дозе 400 мкг/мышь, составила 100%. Иммунизация в дозах 200 и 100 мкг к исходу 3-х сут обеспечила соответственно 90 и 60% уровни выживаемости мышей. Гибель контрольной группы к исходу 2-х сут составила 100%. Полученные данные показывают, что введение препарата (ЭПС + ЛПС) 5. $опп& защищает животных от последующего введения эндотоксина в летальной дозе, причем была выявлена зависимость доза—эффект: повышение дозы иммунизации коррелирует с увеличением выживаемости животных.

С использованием прямой модели эндотоксиче-ского шока было установлено, что развитие сепсиса происходит в результате острого воспалительного процесса в ответ на быструю массивную продукцию цитокинов: при введении эндотоксина экспериментальным животным или добровольцам у последних отмечают жар, тахикардию и системные симптомы воспаления, которые совпадают по времени с пиком ФНО-а в сыворотке [12], а возрастание концентра-

Уровень ФНО-а в крови мышей (CBA х C57B1/6)F1 через 90 мин после введения эндотоксина E. coli O:55 на прямой модели эндо-токсического шока при иммунизации препаратом (ЭПС + ЛПС)

S. sonnei

ции ФНО-а в сыворотке коррелирует с гибелью пациентов от грамотрицательного сепсиса [13]. Поэтому помимо выживаемости животных на прямой модели эндотоксического шока мы параллельно контролировали уровень ФНО-а в сыворотках периферической крови у интактных и толеризированных мышей. Предварительная иммунизация препаратом (ЭПС + ЛПС) S. sonnei обеспечивала снижение продукции ФНО-а макрофагами in vivo до уровня ниже 500 пг/мл, в то время как уровень ФНО-а в группе контроля составил более 1000 пг/мл (рисунок).

Зарегистрированная нами при введении комплексного препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei понижающая регуляция уровней ФНО-а ниже 400 пг/мл достаточна для обеспечения 100% выживаемости мышей линии (CBA х C57Bl/6)F1 при индукции эндотоксического шока, вызванного введением массивных количеств эндотоксина E. coli О:55 до 150 мг/кг.

Ранняя эндотоксическая толерантность характеризуется снижением продукции провоспалительных

цитокинов мононуклеарными фагоцитами в ответ на повторное введение ЛПС [14]. ФНО-а является маркером эндотоксической толерантности, так как при повторном введении ЛПС толерогенным мышам наблюдается резкое падение уровня ФНО-а по сравнению с быстрым и мощным ростом концентрации последнего при первичном введении ЛПС [15]. Таким образом, угнетение выработки ФНО-а при эндо-токсическом шоке является положительным прогностическим признаком исхода заболевания, а эндоток-сическая толерантность представляет собой защитный механизм, снижающий степень воспалительного ответа, и ассоциируется с увеличением резистентности и защиты тканей от повреждения и гибели экспериментальных животных.

Выводы

При профилактической иммунизации мышей (CBA х C57Bl/6)F1 комплексным препаратом (ЭПС + + ЛПС) S. sonnei нами впервые были зарегистрированы эффекты профилактики течения моделируемого в эксперименте эндотоксического шока. Несмотря на низкую эндотоксичность, комплексный препарат обладает мощным толерогенным действием, защищая экспериментальных животных от гибели за счет понижающей регуляции продукции ФНО-а на фоне эндотоксического шока, индуцируемого введением летальной дозы эндотоксина E. coli О:55, составляющей 150 мг/кг. Полученные результаты позволяют сделать вывод, что эффект при профилактическом введении препарата (ЭПС + ЛПС) S. sonnei был обеспечен феноменом ранней эндотоксической толерантности.

СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ

1. Cross A.S., Opal S.M., Warren H.S., Palardy J.E., Glaser K., Parejo A., Bhattacharjee A.K. Active immunization with a detoxified Escherichia coli J5 lipopolysaccharide group B meningococcal outer membrane protein complex vaccine protects animals from experimental sepsis //J. Infect. Dis. 2001. N 183. P. 1079-1086.

2. Astiz M.E., Rackow E.C. Septic shock // Lancet. 1998. N 361. P. 1501-1505.

3. Dinarello C. Cytokines as mediators in the pathogenesis of septic shock // Curr. Topics Microbiol. Immunol. 1996. N 216. P. 133-165.

4. Ulloa L., Tracey K.J. The "cytokine profile": a code for sepsis // Trends Mol. Med. 2005. N 11. P. 56-63.

5. Madonna G.S., Peterson J.E., Ribi E.E., Vogel S.N. Early-phase endotoxin tolerance: induction by detoxified lipid A derative, monophosphoryl lipid A // Infect. Immun. 1986. N 52. Vol. 1. P. 6-11.

6. Dinarello C.A. Immediate cytokine responses to endotoxin: tumor necrosis factor a and interleukin-1 family // Endotoxin in Health and Disease / Ed. H. Brade. New York: Marcell Dekker, 1999. P. 817-830.

7. van Amersfoort E.S., van Berkel T.J., Kuiper J. Receptors, mediators, and mechanisms involved in bacterial sepsis

and septic shock // Clin. Microbial. Rev. 2003. N 16. Vol. 3. P. 379-414.

8. Lehmann B.V., Freudenberg M.A., Galanos G. Lethal toxicity of lipopolysaccharide and tumor necrosis factor in normal and D-galactosamine-treated mice //J. Exp. Med. 1987. N 165. P. 657-663.

9. Tiegs G., Wolter M., Wendel A. Tumour necrosis factor is a terminal mediator in galactosamine/endotoxin-induced hepatitis in mice // Biochem. Pharmacol. 1989. N 38. P. 627—631.

10. Mignon A., Rouquet N, Fabre M., Martin S., Pages J.C., Dhainaut J.F., Kahn A., Briand P., Joulin V.LPS challenge in D-galactosamine-sensitized mice accounts for caspase-dependent fulminant hepatitis, not for septic shock // Am. J. Respir. Crit. Care Med. 1999. N 159. P. 1308—1315.

11. Johnston C.A., Greisman S.E. Mechanism of endotoxin tolerance // Handbook of Endotoxin. Vol. 2. Pathophysiology of endotoxin / Ed. L.B. Hishaw. New York: Elsever, 1985. P. 359—391.

12. Suffredini A.F., Reda D., Banks S.M., Tropea M., Agosti J.M., Miller R. Effects of recombinant dimeric TNF-a receptor on human inflammatory responses following intravenous endotoxin administration // J. Immunol. 1995. N 155. P. 5038—5045.

13. Marano M.A., Fong Y, Moldawer L.L., Wei H., Cal-vano S.E., Tracey K.J., Barie J.S., Manogue K., Cerami A., Shires G.T.G., Lowry S.F. Serum cachectin/tumor necrosis factor in critically ill patients with burns correlate with infection and mortality // Surg. Gynecol. Obset. 1990. N 170. P. 32-38.

14. Christman J.W., Lancaster L.H., Blackwell T.S. Nuclear factor sB: a pivotal role in the systemic inflammatory res-

ponse syndrome and new target for therapy // Intens. Care Med. 1998. N 24. P. 1131-1138.

15. Schade F.U., Flach R, Flohe S, Majetschak M., Kreuzfelder E, Dominguez-Fernandes E., Borgermann J., Reuter M, Obertacke U. Endotoxin tolerance // Endotoxin in Health and Disease / Ed. H. Brade. New York: Marcell Dekker, 1999. P. 751-767.

Поступила в редакцию 15.05.12

INVESTIGATION OF PROTECTIVE PROPERTIES

OF SHIGELLA SONNEI CARBOHYDRATE BIOPOLYMERS

UNDER EXPERIMENTAL ENDOTOXIC SHOCK MODELS

A.A. Markina, I.A. Kondratieva

Study tolerogenic properties of new non-pyrogenic low-endotoxic complex preparation composed of Shigella sonnei carbohydrate biopolymers under D-galactosamine and direct experimental endotoxic shock models. Pretreatment with complex preparation protects mice (CBA x C57Bl/6)F1 against lipopolysaccharide (E. coli O:55) — mediated death. We demonstrate correlation between increasing pre-immunization dose of complex preparation with rate of survival and reduction of TNF-a serum level under direct endotoxic shock model.

Key words: endotoxic shock, exopolysaccharide, lipopolysaccharide, Shigella sonnei, endotoxin tolerance, TNF-a.

Сведения об авторе

Маркина Анна Александровна — мл. науч. сотр. лаборатории полисахаридных вакцин ФГБУ "ГНЦ Института иммунологии" ФМБА России. Тел.: 8-909-931-61-25, 8-499-618-67-83; e-mail: markinanna@mail.ru

Кондратьева Ирина Анатольевна — канд. биол. наук, доц. Международного учебно-научного биотехнологического центра. Тел.: 8-926-247-74-53; e-mail: kondratieva9@gmail.com

i Надоели баннеры? Вы всегда можете отключить рекламу.