CC BY
22
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
Рассматривая динамику изменения гемоглобинового профиля костного мозга и периферической крови после иммобилизации, было установлено, что доминирующими фракциями остаются 3 и 4 на фоне снижения 1 и 2 белковых изоформ.
Выводы. Изменения гемоглобинового профиля костного мозга и системы крови при действии на организм острой массивной кровопотери и иммобилизации обусловлены качественной перестройкой эритропоэза. Острая массивная кровопотеря и иммобилизационный стресс вызывают увеличение интенсивности эритропоэза на поздние сроки после воздействия, которое сопровождается возрастанием числа молодых эритроцитов и незрелых форм (ретикулоцитов).
РОЛЬ МАКРОФАГОВ В ЛОКАЛЬНОЙ РЕГЕНЕРАЦИИ ОСТРОВКОВОГО АППАРАТА ПОДЖЕЛУДОЧНОЙ ЖЕЛЕЗЫ ПРИ АЛЛОКСАНОВОМ ДИАБЕТЕ
Булавинцева Т.С.1, 2, Данилова И.Г.1, 2
1 Уральский федеральный университет им. Б.Н. Ельцина, Екатеринбург, Россия
2Институт иммунологии и физиологии УрО РАН, Екатеринбург, Россия
Введение. Инсулинозависимый сахарный диабет (СД1) является аутоиммунным заболеванием, которое сопровождается разрушением ß-клеток островков Лан-герганса и развитием абсолютного дефицита инсулина. Макрофагам, локализованным в поджелудочной железе, принадлежит центральная роль, как в поддержке воспалительной реакции, так и в регуляции регенерации. Основными факторами, обеспечивающими эти два процесса, являются цитокины, локально выделяющиеся клетками моноцитарно-макрофагального ряда в очаг повреждения (Gusdon A.M., Corbett J.A., Mathews C.E., 2006).
Цель. Оценить секреторную активность макрофагов в поджелудочной железе и ее влияние на пролиферацию ß-клеток в течении СД 1.
Материалы и методы. Исследование проведено на половозрелых крысах — самцах Wistar. Аллоксановый диабет был вызван путем введения раствора аллоксана в дозе 30 мг/100г (Danilova I.G. et al., 2015). Через 30 дней после первой инъекции аллоксана животные получали лечение иммунномодулятором (дериваты аминофталгидрозида) в течение 30 дней по схеме (Jukic T, Abidov M., Ihan A., 2011). В крови животных определяли уровень глюкозы, гликозилированного гемоглобина (НЬА1с) и инсулина. В микропрепаратах поджелудочной железы с помощью иммуногистохимического исследования проведена оценка количества ß-клеток, Ki-67+ß-клеток, макрофагов (CD68) а также особенности их локализации. В гомоге-нате поджелудочной железы путем иммуноферментного анализа определялось содержание основных макрофа-гальных цитокинов — IL-1a, IL-6, IL-10.
Результаты. В периферической крови группы животных с аллоксановым диабетом были отмечены гипергликемия, повышение уровня Hb А1с, уменьшение содержание инсулина. В поджелудочной железе выявлено снижение общего количества инсулин-синтезирующих клеток более чем в 10 раз, а пролиферативная активность ß-клеток (Ki-67+ß-клеток) уменьшалась в 2 раза. Количество CD68+ клеток возрастало в 9 раз относительно ин-тактных животных, что сопровождалось значительным увеличением количества провоспалительных цитокинов
(TNFa, IL-1a, IL-6). Компенсаторно возрастал уровень IL-10 в железе.
Модуляция функциональной активности макрофагов на фоне аллоксанового диабета способствовала снижению уровня глюкозы, нормализации Hb А1с и увеличению концентрации инсулина в периферической крови. Содержание ß-клеток в поджелудочной железе увеличилось в 3 раза по сравнению с контрольными животными с аллоксановым диабетом, а количество Ki-67+ß-клеток соответствовало уровню интактных крыс. Макрофаги локализовались преимущественно возле островков, а их число уменьшалось в 3 раза. Данный факт отразился и на содержании цитокинов в поджелудочной железе. Уровень IL-1a снижался в 2 раза, а IL-6 в 1,7 раза по сравнению с контрольной группой животных, а содержание IL-10 соответствовало показателям интактных крыс.
Заключение. Таким образом, в результате проведенного исследования выявлена зависимость между содержанием макрофагов инфильтрирующих островки Лангерганса, уровнем провоспалительных цитокинов в поджелудочной железе и пролиферативной активностью ß-клеток в островке. Модуляция макрофагов, с одной стороны, обеспечивала снижение альтерации за счет уменьшения содержания «медиаторов воспаления», а с другой — стимуляцию пролиферации и функциональной активности ß-клеток островкового аппарата. Сочетание этих процессов способствует повышению уровня инсулина в крови и частичного уменьшения гипергликемии. Полученные результаты представляют несомненный интерес с позиций раскрытия механизмов регуляции регенераторных процессов при развитии СД1 и имеют непосредственное отношение к решению задач клинической практики.
Исследование поддержано грантом РНФ № 16-1500039.
КОРРЕКЦИЯ АДАПТИВНЫХ И ВРОЖДЕННЫХ ФОРМ ИММУННОГО ОТВЕТА ПРИ ОСТРОМ ДЕСТРУКТИВНОМ ПАНКРЕАТИТЕ НА ФОНЕ ХРОНИЧЕСКОЙ АЛКОГОЛЬНОЙ ИНТОКСИКАЦИИ
Бушмина О.Н., Локтионова А.В., Долгарева С.А., Литвинова Е.С., Локтионов А.Л.
Курский государственный медицинский университет, Курск, Россия
Введение. Актуальность дальнейшего изучения деструктивных форм острого алкогольного панкреатита не вызывает сомнения, поскольку характеризуется максимально высокой летальностью и наибольшим числом осложнений. Это связано с объективными трудностями диагностики и выбора обоснованной лечебной тактики. Недостаточно ясен вопрос о сроках и методах проведения иммунореабилитации при остром деструктивном панкреатите (ОДП), развивающимся на фоне хронической алкогольной интоксикации (ХАИ).
Цель и задачи. Оценка фармакологической эффективности различных сочетаний иммуномодуляторов, анти-оксидантов и мембранопротекторов в коррекции врожденных и адаптивных форм иммунного ответа при экспериментальном остром деструктивном панкреатите на фоне хронической алкогольной интоксикации.
Материалы и методы. В исследовании использовано 189 крыс Вистар средней массой 150 г с соблюдением
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
всех принципов работы с лабораторными животными. ХАИ моделировали 30- или 60-кратным (ХАИ-30 и ХАИ-60), через 24 часа, внутрижелудочным введением 20% раствора этанола, соответственно, в дозах 3 и 2 мл/кг. Экспериментальный ОДП моделировали на 25 и 55 день, соответственно, от первого введения этанола путем перевязки протоков левой и правой долей поджелудочной железы и трехкратной через 60 мин стимуляцией прозерином в дозе 0,2 мг/кг. Экспериментальных животных с ОДП и ХАИ-30 делили на 3 равные части: 1-я группа фармакотерапию не получала; во 2-й группе вводили гепон (5 мг/кг внутрь через 24 часа, № 14), ги-поксен (750 мг/кг внутрь в 1% крахмальной суспензии, № 14) и фосфоглив (800 мг/кг, внутрь в 1% крахмальной суспензии, № 14); в 3-й группе вводили глутоксим (20 мг/кг внутримышечно через 24 часа, № 5), мексидол (50 мг/кг внутрибрюшинно через 24 часа, № 5) и геп-трал (760 мг/кг внутрибрюшинно через 24 часа, № 5). При ОДП на фоне ХАИ-60 одна часть животных получала только этанол, вторая — сочетание глутоксима, мексидола и гептрала. Забой крыс осуществляли через 24 часа после последнего введения этанола и препаратов. В качестве контроля использовали 15 животных без внешних признаков заболеваний. Формирование гуморального иммунного ответа оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа АОК адаптивных форм иммунного ответа оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК). Гиперчувствительность замедленного типа оценивали по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов (РМ) и по разнице количества в них кариоцитов (РК) после введения разрешающей дозы антигена. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови оценивалась по фагоцитарному показателю (ФП), фагоцитарному числу (ФЧ) и индексу активности фагоцитоза (ИАФ). Кислородзависимую активность оценивали по НСТ-тестам, спонтанному (НСТ-сп.) и стимулированному опсонизированным и неопсонизированным зимозаном (НСТ-ст. н/з, НСТ-ст. о/з), коэффициентам активации на опсонизирован-ный и неопсонизированный зимозан, коэффициент оп-сонизации (Кан, КАо, КО).
Результаты. У крыс с моделируемым ОДП на фоне ХАИ-30, в большей степени при ХАИ-60, установлено по сравнению со здоровыми животными снижение количества иммунных АОК в селезенке, РМ, РК, выраженное снижение числа фагоцитирующих клеток и поглощенных ими частиц, повышение метаболической активности нейтрофилов в НСТ-сп., НСТ-ст. о/з и н/з тестах. Однако резервы кислородзависимой активности фагоцитов (КАо, КАн и КО) снижались. Введение комбинации препаратов гепон, гипоксен и фосфоглива крысам с ОДП в сочетании с 30-дневной ХАИ корригировало, но не до нормы формирование адаптивных форм иммунного ответа (АОК и РМ), ФП, ФЧ, ИАФ, НСТ-сп. и НСТ-ст. о/з и н/з, еще более значимо КАн и КО. Использование сочетания глу-токсима, мексидола и гептрала нормализовало число иммунных АОК в селезенке экспериментальных животных, ФЧ, НСТ-ст. о/з и н/з, КАн, КО, корригировало, но не до контрольной группы РМ, РК, ФП, ИАФ, НСТ-сп., КАо. Использование глутоксима, мексидола и гептрала в условиях ОДП и ХАИ-60 корригировало уровень АОК, РМ, РК, фагоцитарную активность нейтрофилов, НСТ-сп. и НСТ-ст. о/з и н/з, КАн, но не влияло на сниженные КАо и КО.
Заключение. Таким образом, более эффективным сочетанием в коррекции адаптивных и врожденных форм иммунного ответа при ОДП, моделируемом на фоне ХАИ, оказалось сочетание глутоксима, мексидола и гептрала.
АНАЛИЗ КЛОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА ПРИ СЕКВЕНИРОВАНИИ ЕДИНИЧНЫХ B-ЛИМФОЦИТОВ
Бязрова М.Г.1, 2, Лушова А.А.2, Садыкова Г.К.3, Прилипов А.Г.3
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 ФГБУ«Государственный научный центр "Институт иммунологии"» Федерального медико-биологического агентства, Москва, Россия
3 ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Известны несколько некомбинаторных стратегий получения антигенспецифических моноклональных антител. К ним относятся гибридомная технология, иммор-тализация B-лимфоцитов вирусом EBV, а также создание моноклональных антител путем секвенирования генов иммуноглобулина методом NGS из пула клеток или стандартного секвенирования из единичных В-лимфоцитов. Последний метод имеет ряд преимуществ при выявлении редких клонотипов и в настоящее время активно разрабатывается. Метод состоит из следующих этапов: выявление и выделение антигенспецифических В-лимфоцитов, выделение мРНК из единичных клеток, секвенирование генов иммуноглобулина с последующей экспрессией в клетках-продуцентах. Каждый из отмеченных этапов представляет определенные трудности и требует оптимизации. Сложность метода связана с незначительным количеством мРНК, содержащейся в единичном B-лимфоците.
Цель. Создание человеческих терапевтических моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита.
Задача работы состояла в отработке отдельных этапов технологии секвенирования генов иммуноглобулинов из единичных В-лимфоцитов: получение конъюгатов антител, необходимых для многоцветного окрашивания клеток; сортировка субпопуляции активированных В-лимфоцитов; амплификация и секвенирование генов Ig из единичных клеток.
Объекты исследования: лимфоциты периферической крови и костного мозга человека.
Методы. Обогащение лимфоцитов методом магнитной сепарации, проточная цитометрия, гнездовая ПЦР и секвенирование методом Сэнгера.
Результаты. Для окрашивания клеток использовали следующие комбинации антител: IgG-FITC/CD19-PE, CD19-FITC/CD27-PE, CD38-FITC/CD27-PE, а также CD19-FITC/CD38-PE/CD27-PE-Cy5.5. В препаратах лимфоцитов периферической крови и костного мозга человека были определены субпопуляции В-лимфоцитов: CD19+IgG+, CD19+CD27+, CD19+CD38+, CD19+CD27+CD38+.
Популяции CD19+IgG+, CD19+CD27+, CD27+CD38+ и CD27+CD38+CD3-CD16- были отсортированы и разнесены по одной клетке в пробирки для ПЦР. Далее была проведена реакция обратной транскрипции с последующей амплификацией генов иммуноглобулина с помощью гнездовой ПЦР. Полученные ПЦР-фрагменты секвени-
