CC BY
26
2017, Т. 19, Специальный выпуск 2017, Vol. 19, Special Issue
Экспериментальные модели Experimental models
всех принципов работы с лабораторными животными. ХАИ моделировали 30- или 60-кратным (ХАИ-30 и ХАИ-60), через 24 часа, внутрижелудочным введением 20% раствора этанола, соответственно, в дозах 3 и 2 мл/кг. Экспериментальный ОДП моделировали на 25 и 55 день, соответственно, от первого введения этанола путем перевязки протоков левой и правой долей поджелудочной железы и трехкратной через 60 мин стимуляцией прозерином в дозе 0,2 мг/кг. Экспериментальных животных с ОДП и ХАИ-30 делили на 3 равные части: 1-я группа фармакотерапию не получала; во 2-й группе вводили гепон (5 мг/кг внутрь через 24 часа, № 14), ги-поксен (750 мг/кг внутрь в 1% крахмальной суспензии, № 14) и фосфоглив (800 мг/кг, внутрь в 1% крахмальной суспензии, № 14); в 3-й группе вводили глутоксим (20 мг/кг внутримышечно через 24 часа, № 5), мексидол (50 мг/кг внутрибрюшинно через 24 часа, № 5) и геп-трал (760 мг/кг внутрибрюшинно через 24 часа, № 5). При ОДП на фоне ХАИ-60 одна часть животных получала только этанол, вторая — сочетание глутоксима, мексидола и гептрала. Забой крыс осуществляли через 24 часа после последнего введения этанола и препаратов. В качестве контроля использовали 15 животных без внешних признаков заболеваний. Формирование гуморального иммунного ответа оценивали на пятые сутки после иммунизации путем определения в селезенке числа АОК адаптивных форм иммунного ответа оценивали по количеству антителообразующих клеток (АОК). Гиперчувствительность замедленного типа оценивали по разнице масс регионарного и контрлатерального лимфатических узлов (РМ) и по разнице количества в них кариоцитов (РК) после введения разрешающей дозы антигена. Фагоцитарная активность нейтрофилов периферической крови оценивалась по фагоцитарному показателю (ФП), фагоцитарному числу (ФЧ) и индексу активности фагоцитоза (ИАФ). Кислородзависимую активность оценивали по НСТ-тестам, спонтанному (НСТ-сп.) и стимулированному опсонизированным и неопсонизированным зимозаном (НСТ-ст. н/з, НСТ-ст. о/з), коэффициентам активации на опсонизирован-ный и неопсонизированный зимозан, коэффициент оп-сонизации (Кан, КАо, КО).
Результаты. У крыс с моделируемым ОДП на фоне ХАИ-30, в большей степени при ХАИ-60, установлено по сравнению со здоровыми животными снижение количества иммунных АОК в селезенке, РМ, РК, выраженное снижение числа фагоцитирующих клеток и поглощенных ими частиц, повышение метаболической активности нейтрофилов в НСТ-сп., НСТ-ст. о/з и н/з тестах. Однако резервы кислородзависимой активности фагоцитов (КАо, КАн и КО) снижались. Введение комбинации препаратов гепон, гипоксен и фосфоглива крысам с ОДП в сочетании с 30-дневной ХАИ корригировало, но не до нормы формирование адаптивных форм иммунного ответа (АОК и РМ), ФП, ФЧ, ИАФ, НСТ-сп. и НСТ-ст. о/з и н/з, еще более значимо КАн и КО. Использование сочетания глу-токсима, мексидола и гептрала нормализовало число иммунных АОК в селезенке экспериментальных животных, ФЧ, НСТ-ст. о/з и н/з, КАн, КО, корригировало, но не до контрольной группы РМ, РК, ФП, ИАФ, НСТ-сп., КАо. Использование глутоксима, мексидола и гептрала в условиях ОДП и ХАИ-60 корригировало уровень АОК, РМ, РК, фагоцитарную активность нейтрофилов, НСТ-сп. и НСТ-ст. о/з и н/з, КАн, но не влияло на сниженные КАо и КО.
Заключение. Таким образом, более эффективным сочетанием в коррекции адаптивных и врожденных форм иммунного ответа при ОДП, моделируемом на фоне ХАИ, оказалось сочетание глутоксима, мексидола и гептрала.
АНАЛИЗ КЛОНАЛЬНОГО РАЗНООБРАЗИЯ ГЕНОВ ИММУНОГЛОБУЛИНА ПРИ СЕКВЕНИРОВАНИИ ЕДИНИЧНЫХ B-ЛИМФОЦИТОВ
Бязрова М.Г.1, 2, Лушова А.А.2, Садыкова Г.К.3, Прилипов А.Г.3
1 Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова, Москва, Россия
2 ФГБУ«Государственный научный центр "Институт иммунологии"» Федерального медико-биологического агентства, Москва, Россия
3 ФГБУ «Федеральный научно-исследовательский центр эпидемиологии и микробиологии им. почетного академика Н.Ф. Гамалеи» Министерства здравоохранения РФ, Москва, Россия
Известны несколько некомбинаторных стратегий получения антигенспецифических моноклональных антител. К ним относятся гибридомная технология, иммор-тализация B-лимфоцитов вирусом EBV, а также создание моноклональных антител путем секвенирования генов иммуноглобулина методом NGS из пула клеток или стандартного секвенирования из единичных В-лимфоцитов. Последний метод имеет ряд преимуществ при выявлении редких клонотипов и в настоящее время активно разрабатывается. Метод состоит из следующих этапов: выявление и выделение антигенспецифических В-лимфоцитов, выделение мРНК из единичных клеток, секвенирование генов иммуноглобулина с последующей экспрессией в клетках-продуцентах. Каждый из отмеченных этапов представляет определенные трудности и требует оптимизации. Сложность метода связана с незначительным количеством мРНК, содержащейся в единичном B-лимфоците.
Цель. Создание человеческих терапевтических моноклональных антител против вируса клещевого энцефалита.
Задача работы состояла в отработке отдельных этапов технологии секвенирования генов иммуноглобулинов из единичных В-лимфоцитов: получение конъюгатов антител, необходимых для многоцветного окрашивания клеток; сортировка субпопуляции активированных В-лимфоцитов; амплификация и секвенирование генов Ig из единичных клеток.
Объекты исследования: лимфоциты периферической крови и костного мозга человека.
Методы. Обогащение лимфоцитов методом магнитной сепарации, проточная цитометрия, гнездовая ПЦР и секвенирование методом Сэнгера.
Результаты. Для окрашивания клеток использовали следующие комбинации антител: IgG-FITC/CD19-PE, CD19-FITC/CD27-PE, CD38-FITC/CD27-PE, а также CD19-FITC/CD38-PE/CD27-PE-Cy5.5. В препаратах лимфоцитов периферической крови и костного мозга человека были определены субпопуляции В-лимфоцитов: CD19+IgG+, CD19+CD27+, CD19+CD38+, CD19+CD27+CD38+.
Популяции CD19+IgG+, CD19+CD27+, CD27+CD38+ и CD27+CD38+CD3-CD16- были отсортированы и разнесены по одной клетке в пробирки для ПЦР. Далее была проведена реакция обратной транскрипции с последующей амплификацией генов иммуноглобулина с помощью гнездовой ПЦР. Полученные ПЦР-фрагменты секвени-
«Дни иммунологии в СПб 2017» Immunology Days in St. Petersburg 2017
Медицинская Иммунология Medical Immunology (Russia)/Meditsinskaya Immunologiya
ровали методом Сэнгера, при этом были получены отдельные сиквенсы генов иммуноглобулинов.
Выводы. Были отработаны некоторые этапы технологии получения человеческих моноклональных антител путем секвенирования генов иммуноглобулина из единичных клеток.
ГАЛЕКТИН-3 МОДУЛИРУЕТ ПРОДУКЦИЮ ЦИТОКИНОВ Th-ЛИМФОЦИТАМИ IN VITRO
Васильева О.А., Прохоренко Т.С., Зима А.П., Новицкий В.В.
ФГБОУ ВО «Сибирский государственный медицинский университет» Министерства здравоохранения РФ, Томск, Россия
Введение. Галектин-3 функционирует как экстра-целлюлярная регуляторная молекула и принимает участие в активации различных типов клеток, таких как моноциты, макрофаги, тучные клетки, нейтрофилы и лимфоциты.
Цель. Оценить влияние рекомбинантного галектина-3 на продукцию профильных цитокинов Th-лимфоцитами здоровых доноров in vitro.
Материалы и методы. Исследование проведено на лимфоцитах, выделенных методом градиентного центрифугирования из крови здоровых доноров (n = 25), с дальнейшим культивированием в течение 72 ч в питательной среде с добавлением рекомбинантного галектина-3 в дозах 0,5 и 1 мкг/мл (R&D, США). Для создания in vitro условий, близких к естественным, использовали моно-клональные активирующие антитела — анти-CD3/анти-CD28 (BD Pharmingen™, США). За 4 ч до окончания инкубации к клеткам добавляли стимуляторы синтеза цитокинов ФМА (50 нг/мл) и кальция иономицин (1 мкг/мл). Определение уровня продукции интерлейкинов (IL) 17А, IL-10, интерферона (IFN) у и IL-13, IL-22, TGF-Pp TNFa в культуральных супернатантах осуществляли методом твердофазного иммуноферментного анализа типа «сэндвич» согласно протоколам фирмы-производителя (R&D, США).
Результаты. Установлено, что при действии галек-тина-3 на лимфоциты здоровых доноров концентрация Thl-цитокинов — IFNy и TNFa — достоверно увеличивалась относительно соответствующих значений в контрольной группе. Стимулирующее влияние отмечалось при исследовании влияния галектина-3 на продукцию IL-13, свойственного 1Ь2-лимфоцитам. При анализе влияния галектина-3 на Th-17 лимфоциты регистрировалось статистически значимое повышение концентрации профильных цитокинов — IL-17A и IL-22 (при дозе галектина-3 0,5 мкг/мл). Увеличение дозы данного лек-тина до 1 мкг/мл приводило к снижению концентрации IL-17 и IL-22 относительно значений соответствующих показателей в культуре с меньшей концентрацией галек-тина-3 и было достоверно ниже значений в контрольной группе (только для IL-17). Влияние галектина-3 на функциональную активность субпопуляции Т-регуляторных лимфоцитов проводили путем анализа продукции IL-10 и TGF-P1. В результате экспериментов наблюдалось достоверное уменьшение концентрации IL10 и TGF-P1 относительно значений данных показателей в группе контроля.
Заключение. Проведенные эксперименты свидетельствуют о том, что влияние рекомбинантного галектина-3 является дозозависимым, и с увеличением его концентрации до 1 мкг/мл степень стимулирующего влияния на Th-лимфоциты становится менее выраженной, и преоб-
ладает ингибирующее действие на лимфоциты, что может быть обусловлено активацией апоптотической гибели клеток.
Исследование выполнено при финансовой поддержке Совета по грантам Президента Российской Федерации (№ НШ-7906.2016.7, МД-3455.2017.7).
Breg ПРИ ГУМОРАЛЬНОМ ИММУННОМ ОТВЕТЕ
Гаврилова М.В., Чернышова И.Н., Снегирева Н.А.
ФГБНУ «Научно-исследовательский институт вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова», Москва, Россия
Введение. В последние годы выяснилось, что В-клетки, также как и Т-лимфоциты, обладают регуля-торными функциями. В основном их роль сводится к угнетению воспалительных и аутоиммунных процессов. Влияние регуляторных В-клеток (Breg) на патологические процессы, главным образом, обусловлено синтезируемым ими IL-10. Основным источником Breg являются, по-видимому, В1-лимфоциты. Роль Breg в развитии гуморального иммунного ответа практически не изучена. Исследования такого рода удобно проводить в системе in vitro. Ранее нами была разработана модельная система, позволяющая использовать минимальное количество В1-лимфоцитов при изучении их взаимодействий с другими клетками in vitro. В этой системе в качестве клеток-«филлеров» используются спленоциты XID-мышей CBA/N, не имеющих В1-клеток. С другой стороны, адоптивный перенос Breg мышей линии СВА мышам конген-ной линии CBA/N позволяет исследовать влияние этих клеток на гуморальный иммунный ответ in vivo.
Цель. Изучение роли Breg в гуморальном иммунном ответе. В задачи исследования входило: определение влияния Breg на иммунный ответ субпопуляций В-лимфоцитов на Т-зависимый антиген (ТЗ АГ) в модельной системе in vitro и на модели адоптивного переноса in vivo.
Материалы и методы. В1-лимфоциты выделяли из перитонеальной полости, В2 — из селезенки мышей линии СВА методом иммуномагнитной сепарации. При культивировании in vitro В1- и В2-клетки смешивали со спленоцитами линии мышей CBA/N в соотношении 1:9 соответственно. Breg выделяли из перитонеальной полости мышей линии СВА с использованием Regulatory B cell isolation kit. Методом проточной цитометрии было определено, что > 90% Breg синтезировало IL-10. Контрольные В-лимфоциты (Вконтр), получали так же, как и Breg, за исключением добавления активаторов. Вконтр содержали не более 4% синтезирующих IL-10 В-клеток. В качестве ТЗ АГ использовали водорастворимый антиген бараньих эритроцитов (ВРАБЭ), который добавляли в конечной концентрации 25 мкг/мл. Для раздельного культивирования Breg использовали мембранные вставки с полупроницаемой мембраной. Breg или Вконтр вносили в верхнюю камеру в количестве 1 х 106, в нижнюю помещали 5 х 106 клеток смешанных культур. Клетки инкубировали в полной среде в СО2-инкубаторе при 37 °С в течение 4 дней с АГ или без него. Функциональную активность В-лимфоцитов оценивали по числу АТ-и ИГ-образующих клеток (АОК и ИГОК соответственно) в культурах методом ELISPOT.
В опытах in vivo Breg вводили конгенным XID-мышам линии CBA/N по 1,5 млн внутривенно (в/в). Одновременно мышей иммунизировали в/в ВРАБЭ в дозе 50 мкг/мышь. В качестве контроля использовали нормальных мышей линии CBA/N и мышей CBA/N, получивших Вконтр и ВРАБЭ, и только Вконтр. На 4-й день
