Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами — реагенты для направленной окислительной модификации нуклеиновых кислот Текст научной статьи по специальности «Химические науки»

УДК 541.145:547.963.32.07:577.133.4/6

Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами — реагенты для направленной окислительной модификации

нуклеиновых кислот

А. А. Черноносов, Д. Г. Кнорре, О. С. Федорова

АЛЕКСАНДР АНАТОЛЬЕВИЧ ЧЕРНОНОСОВ — младший научный сотрудник Института химической биологии и фундаментальной медицины (ИХБФМ) СО РАН. Область научных интересов: синтез и исследование механизма взаимодействия с нуклеиновыми кислотами производных олигонуклеотидов с фталоцианинами.

ДМИТРИЙ ГЕОРГИЕВИЧ КНОРРЕ — академик, советник РАН, профессор, главный научный сотрудник ИХБФМ СО РАН. Область научных интересов: биоорганическая химия и молекулярная биология процессов репликации и транскрипции, разработка ген-направленных биологически активных веществ на основе олигонуклеотидов.

ОЛЬГА СЕМЕНОВНА ФЁДОРОВА— доктор химических наук, заместитель директора ИХБФМ СО РАН, профессор Новосибирского государственного университета. Область научных интересов: разработка ген-направленных биологически активных веществ на основе олигонуклеотидов, кинетика и механизмы их взаимодействия с нуклеиновыми кислотами.

630090 Новосибирск, просп. Акад. Лаврентьева, 8, ИХБФМ СО РАН, тел. (3832)30-92-74, факс (3832)-33-36-77, E-mailfedorova@niboch.nsc.ru

Созданию терапевтических препаратов селективного действия на основе олигонуклеотидов, содержащих реакционноспособные группы, посвящено большое число исследований [1]. Они основаны на высказанной в работе [2] идее о том, что если к олигонуклео-тиду присоединить такую группу, то он будет способен направить (адресовать) ее на участок РНК- или ДНК-мишени, комплементарный адресующему оли-гонуклеотиду. Поэтому олигонуклеотиды, их производные, содержащие химические группы различной природы, а также аналоги олигонуклеотидов начали широко исследовать для подавления экспрессии генов как возможные противовирусные и противоопухолевые препараты [3].

В реакционноспособных производных олигонуклеотидов в настоящее время применяют различные химически активные группы: термически активируемые, фотоактивируемые и каталитически активные группы [1]. Среди таких группировок представляют интерес соединения порфиринов и их аналогов как в форме металлокомплексов, так и неметаллированные. Эти соединения в силу уникальности своей электронной структуры обладают широким спектром полезных свойств: 1) некоторые типы порфиринов обладают высоким сродством к нуклеиновым кислотам [4]; 2) в отличие от большинства металлокомплексов, генерирующих свободные гидроксильные радикалы, диффундирующие в раствор, в металлопорфиринах активные кислородные частицы не выходят из координационной сферы металлокомплекса [5], что позволяет осуществлять высокоселективную модификацию нуклеиновых кислот; 3) порфириновые группы способны эффективно проникать в клетки [6] и, вероятно, могут способствовать проникновению в клетки олигонуклео-тидных производных.

Свободные основания порфиринов и их комплексы с диамагнитными металлами (Хп, А], Рё) обладают фотохимической активностью как за счет сенсибили-

зации генерации синглетного кислорода, так и из-за возможности прямой реакции возбужденного порфи-рина с нуклеиновой кислотой [7]. Комплексы порфиринов с ионами переходных металлов способны катализировать окислительную деструкцию ДНК и РНК с помощью 02, Н202 и других окислителей.

В данном обзоре рассмотрены методы синтеза производных олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами и результаты их испытания в качестве адресованных реагентов. Для удобства рассмотрения проведено разбиение всех производных на основе гомологии реакционных групп. Так фотоактивируемые группировки были разделены на: 1) порфирины, 2) хлорины, 3) сапфирины и комплексы тексафирина Lu(III). Соответственно, группировки участвующие в реакциях с сопряженными восстановителями были разделены на: 1) различные производные порфиринов, 2) текса-фириновые комплексы, 3) корриновые комплексы.

Список сокращений

АСС1 — адамантанкарбонилхлорид

ВОР — бензотриазол-1-ил-Ы-окси-трис(диметилами-

но)фосфоний

CDI — 1,Г-карбоксидиимидазол DCC — дициклогексилкарбодиимид DMAP — диметиламинопиридин DMF — диметилформамид DM SO — диметилсульфоксид DMT-C1 — 4,4'-диметокситритилхлорид DPEA — диизопропилэтиламин

HEPES — 4- (2- гидроксиэтил) пи перазин -1 -этансул ь-фоновая кислота

HOBT — 1-гидроксибензотриазол Melm — l-N-метилимидазол

MOPS — 3-(Ы-морфолино)пропансульфоновая кислота

NMM — N-метилморфолин

ODN — олигодезоксирибонуклеотид

ODN" — защищенный олигодезоксирибонуклеотид

PNA — пептидоолигонуклеотид Ph3P — трифенилфосфин Рог — порфирин Ру — пиридин

Py2S2 — дипиридилдисульфид ТА — тетразол

TBAF — тетрабутиламмонийфторид TEA — триэтиламин ТЕАВ — триэтиламмоний бикарбонат THF — тетрагидрофуран

TPS — триизопропилбензолсульфонилхлорид

Фотоактивируемые конъюгаты олигонуклеотидов Порфирины

Порфирины представляют собой 18 п-электронные ароматические макроциклические системы, которые имеют характерный оптический спектр с очень сильным п-п* переходом при длине волны около 400 нм (известный как полоса Соре) и с 4 Q-полосами в видимой области в интервале 500—600 нм. Было установлено, что порфирины служат сенсибилизаторами генерации синглетного молекулярного кислорода '02 по механизму фотопроцесса типа II. Это их свойство используется в методе лечения онкологических заболеваний — фотодинамической терапии (ФДТ) [8]. Основой ФДТ служит способность сенсибилизатора локализоваться в опухолях и разрушать их под действием света. В отличие от радиационной и химиотерапии ФДТ обладает незначительной мутагенностью. За исключением высокой светочувствительности кожи в первый период после курса лечения этот метод не имеет тяжелых побочных эффектов. В настоящее время он разрешен к применению во многих странах и продолжает интенсивно развиваться.

Развитие метода ФДТ идет как по пути улучшения фотофизических характеристик сенсибилизаторов, так и повышения селективности их действия в отношении опухолевых клеток, не затрагивая здоровые ткани. Улучшение фотофизических свойств направлено на поиск соединений, обладающих поглощением в более длинноволновой части спектра видимого света, чем порфирины, то есть, в области 600—700 нм и выше. Это расширяет возможности метода ФДТ и уменьшает светотоксичность препаратов. Однако по-прежнему актуальной является задача улучшения специфичности

действия реагентов, используемых в ФДТ. Один из путей увеличения специфичности — присоединение фотосенсибилизатора к какому-либо вектору, способствующему селективному его накоплению опухолевыми клетками и направляющими его действие на определенные клеточные мишени. Такими векторами могут служить молекулы олигонуклеотидов, комплементарные определенным участ-

Н,сч

/N:

0

-O-P-O-ODN

1

О-

Ph,P. Py2S2

ОМАР

DMF

О II

кам матричных РНК, кодирующих белки, которые участвуют в процессах возникновения и развития он кологических заболевай и й.

Первое фотоактивируемое производное олигонук-леотида на основе порфирина было использовано в работе [9], где описан синтез конъюгата К1 17-звен-ного олигонуклеотида 01 с соединением 1 (РсЦП)-копропорфирином I).

CH2CH2COOH

HOOCCH2CH2-

Рс1(11)-К01ф01юрфирин 1, Рс1(11)([Рог(СООН>4] 1

Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидов О, мишеней М и образуемых ими комплексов — дуплексов Д и триплексов Т приведены на рис. 1.

Для синтеза конъюгата необходимо было активировать концевой 5'-фосфат олигонуклеотида 01 (схема 1). Синтез конъюгата К1 проводили в две стадии: на первой стадии синтеза к одному из остатков про-пионовой кислоты порфирина 1 присоединяли эти-лендиаминовый линкер. На второй стадии свободная аминогруппа линкера вступала в реакцию с активированным 5'-концевым фосфатом олигонуклеотида 01 (схема 1). Выход конечного продукта К1 по отношению к исходному олигонуклеотиду составил 10%.

В качестве мишени использовали 34-звенный оли-гонуклеотид М1, содержащий комплементарную последовательность к реагенту К1.

Для исследования модификации мишени М1 в составе дуплекса Д1 проводили облучение смеси растворов мишени М1 и конъюгата К1 светом ртутной лампы высокого давления в области спектра 330^ 410 нм. Было показано, что между мишенью и реагентом образуются ковалентные сшивки, которые после

О

Por' (С-ОН)4

H2N—(СН2)2— nh2 Н20 : DMF = 2:1 CMC. рН=6

СМС =

О

(CH2)2-N=C=N

о

-o_s.

V \\

-СН,

н,с

N—P-O-ODN

I

O-

о о

Por'(C-OH)3-C-HN-(CH2)2- NH2

DMSO/DMF

'КОМЕЕ.36 Ч

оо о

Por'(C-OH)3-C-HN-(CH2)2-NH-P-0-ODN

-

K1

ODN = Ol

Por' = остаток Pd(II)[Por(COOH)4

Д1

Д2

дз

Д4

Д5

СССАСССАСААСТААТСААТСААССТССАСАССТ 3' М1 СССТСССТСТТСАТТСр 5' 01

стесссетстетосисисАсисис АСССССАСАСААр

ТСААТСССААСАСССТСАССТТ

т^С1 с г^^р Т ^Тр

ААААААААААААСТСТ

АТАТСССССССАСАААССАСААСАА

3' 5'

3' 5'

3' 5'

3' 5'

Л16 5' САТАССАСАССААСАААТССАСССАСТАСАТССТА 3' М17 3' СТСТССТТСТТТАССТСССр 5' 013

Д17 3'

Д18

САТСТССТАТСССАССААСААССССАСАСАСССАС АСССТАСССТССТТСТТССССТр ААСС

3' 3'

ссссетАсс

Д19

-436

3' 5'

5' 5'

Д6

С ААС АС С ССССТ С АС АСАТСААСТ СТ С СААААТААА 3' м8 ССССССАСиСиСиАСр 5' 06

Д20

сиссссисисс

Д21 "те ссис

есеССАССАСе

Д7

5' АСА6ААСАТТС6СТАТ66СС6А6Т66А6А6АСС6С6 3' МЭ 3' ААСССАОАСССССиСр 5' 07

Д22 3'

СААСАССС66СЦСАСА6АШАА6ЦСЦССААААЦААА 3' М20 СТТСТССССССАСТСТСТАСр 5' 019

Д8

Д9

5' 3'

ААССОТОАОТААААААААААААТОАОТОАОТ ТТТТТТТТТТТТр

(АААААА)П

5 10 15 20 25

ТСАСТСАСТААААААААТСАСТСССАА

3' 5'

3' 5'

3' 5'

Д23 3'

Д24

СААСАССС66СЦСАСА6АШАА6ЦСЦССААААЦААА 3' М20 АСТСТСТАСХГСАСАССТ 5' 020

666АА6А666ТСА6

^С4 гр гр с^^р р

3' 5'

35''

, ТТ6ААТ666АА6А666ТСА66ТТСС, , гМ (СССТТСТСССАСТ)

3' 5'

Т1

ТАТСС6С6С6А6ААА66А6АА6АА ТАТАСАС СССТСТТТ ССТСТТСТТ

3' 5' 3'

Д12

35''

5' 3'

5' 3'

. .ТТСААТСССААСАСССТСАССТТСС. . . 3'М13

5 10

ТСААТСССААСА 3' М14

ТТАСССТТр 5' 011

5'

5 10 15 20 25 30 35

САСАССАСАССААСАААТССАСССАСТАСАТССТА 3' м15

5 10 15 20 25 30 35

САСАССАСАССААСАААТССАСССАСТАСАТССТА 3' М15

АССССТСТССТТСТТТАССТСССр 5' 014 ААСС

Т2

тз

„Т ССССАСАААССАСААСАА

АССТССАССТСААААСААСААСАССТААСТАССТТСС

J = осевдоцитозин

3' 5' 5'

3' 5'

-(^0)П-ТТ^Т ^ТТТ-^о)3-ТТТТСТТСТТ 3' мь

^ аёо = 8-амино-3,6-диоксаоктаноил

™ [-НЫ{СН2СН20)2СН2СО]

п =1,2,3

015*

Рис. 1. Нуклеотидные последовательности олигонуклеотидов О, мишеней М и образуемых ими комплексов Д и Т

* пептидоолигонуклеотид

обработки 1 М пиперидином давали продукты расщепления олигонуклеоти да-мишени по основаниям в17 и, в меньшей степени, Т16. Положение в мишени модифицированных нуклеотидов свидетельствовало о протекании реакции в комплементарном комплексе между оли-гонуклеотидным фрагментом реагента и комплементарным участком ДНК-мишени. Общий выход реакции модификации достигал 30%. Косвенные доказательства образования в ходе реакции в качестве промежуточного соединения синглетного молекулярного кислорода были получены в экспериментах с использованием Г)20 вместо Н20. В этих условиях наблюдали повышение уровня

сн3

сн3

сн=сн2

н3с-

н3с-

сн2-сн3

сн2-сн3

соон

Метилпирропорфирин XXI 2а, М = 2Н 26, М = Тп(\\)

н3с

н3с

сн=сн2

сн3

Протопорфирин IX За, М = 2Н 36, М = Тп(\\)

5

5

5

5

5

5

O

M Por' -CoH

DCC DMAP

O

HO-N 6

СН,СЬ : ОМБО

. 1:1

чаши , 24 Ч

O

МРо^^^-К

O

O

р1 I 5.5 4 °С , ночь

-O-P-O-ODN 6",

(CH3)^N-(CH2)3-N=C=N-Et • на :

О

II

N-(CH2)2-S-OH.H2O

' О

H2N-(CH2)2-S-S-(CH2)2-NH-O-P-O-ODN

О"

а

N^3)2

O

/коми, НОЧЬ

ТЕА

MPor'-C-HN-(CH2)2-S-S-(CH2)2-NH-O-P-O-ODN

6-Схема 3

ODN = 02

МРог' = остаток порфирина

неспецифического расщепления мишени, что может быть обусловлено большим временем жизни '02 в Г)20 [10] и, следовательно, большим расстоянием, на которое может диффундировать эта молекула по сравнению с реакцией в Н20.

В работе [11] авторы использовали в качестве реакционных групп свободные или содержащие ионы /п(П) метилпирропорфирин XXI 2а, б и протопорфи-рин IX За, б (схема 2). В молекулах порфиринов 2а, б и За, б имеются, соответственно, один и два остатка пропионовой кислоты. Наличие второй карбоксильной группы у соединения За, б давало возможность образования в ходе синтеза конъюгатов двух изомеров, не отличающихся по химическим свойствам.

Для синтеза конъюгатов был использован 12-звенный дезоксирибоолигонуклеотид 02, комплементарный 24-звенному рибоолигонуклеотиду — мишени М2 (рис. 1). Порфирины 2а, б и За, б переводили в форму Ы-оксисукцинимидных эфиров, которые

инкубировали далее с оли гонуклеоти дом 02, содер-'

вый линкер (схема 3). Были синтезированы конъюга-ты К2—К5 (см. табл. 1). Выход продуктов составлял около 50%.

Таблица 1

Обозначения конъюгатов, содержащих порфирины 2 и 3

Конъюгат Порфирин М Олигонуклеотид

К2 2а 2Н 02

КЗ 26 Тп(\\) 02

К4 За 2Н 02

К5 36 Тп(\\) 02

Эксперименты по модификации РНК проводили со всеми синтезированными конъюгатами К2—К5 в составе комплекса Д2. Облучение реакционных смесей полосой излучения ртутной лампы (408 нм) приводило к образованию ковалентных сшивок между конъюгатами и мишенями, причем получали два различных продукта. Было показано, что выход реакции

возрастает с увеличением концентрации порфирина. Однако, максимальное значение выхода реакции модификации составило 34% для содержащего прото-порфирин К4 и 14% в случае его 7 п (I Г) - пр о из I дадн о г о К5. После гидролиза продукта в щелочных условиях было показано, что модификации подверглись, главным образом, основания в14, в16 и в18, находящиеся вблизи порфириновых групп в составе комплементарных комплексов.

Для конъюгата содержащего метилпирропорфирин К2, как было показано, выход продуктов реакции достигал всего 4%, а в случае его производного с Хп(\\) КЗ - 2%.

Другой способ синтеза производного порфирина был предложен в работе [12], где в качестве реакционной группы использовали как неметаллированный лгезо-трис(4-пиридил)[4-(метилкарбокси)фенил]пор-фирин 4, так и его N - метилп ири ди н иевый аналог 5 (схема 4).

Я

л<ето-Трис(4-пиридил) [(метилкарбокси)фенил] порфирин, ТРуР-СООСНз

ш3

л<ето-Трис(4-М-метилпиридиний) [(4-метилкарбокси)фен:ил] порфирин, ТМРуР-СООСНз

O

O

COOCH

зГ 11+1

+

4П

Дс00Н/Дс,0

O

NH

CHO Cнo

o

O ЫН2-(СН2)6-ОН

. ТРуР-^ CH3 -60-65 °С ^ Трур C_ нн- (СН2)6-ОН

1) [(СР3)2СН-0]3Р,

о

сюи'

трурC-ин-(СН2)6-О-Р-О-ООЫ1~/СРО ^• н

12/Ру/Н?0 Е13ЫЯНР/Н20

o

Е13Ы, СН2С12 2) ТЕАВ/Н?0

о

II

o

о

ТРуР-^ ЫН-(СН2)6-0-Р-0-00Ы'Ц СРв

АСС1

МНз / Н20 25 °С, 12 ч

ТРуР- C- ИН- (СН2)6-0-Р-0" +ЫЕ13Н

o

-ТИз^й

ODN = ОЗ, 04

СРв — стекло с контролируемыми порами

О

ТРуР- C- ЫН- (СН,)6-0-Р-0-00Ы

I

0~

СН31, ОМБ, 25 С

0

^ ЫН- (СН,)6-0-Р-0-00Ы

1

-о

N I

ОН3Г

Схема 5

Синтез проводили в несколько этапов: сначала был синтезирован порфирин, затем вводили бифункциональный линкер, содержащий на одном конце амино-, а на другом гидроксильную группу. На следующем этапе синтеза порфирин переводили в его Н-фосфонатное производное, которое в присутствии адамантанкарбонилхлорида реагировало с полностью защищенным олигонуклеотидом, находящимся на твердом носителе. Далее были проведены стадии окисления Н-фосфоната, гидролиза, снятия защитных групп и реакция Ы-метилирования остатков пиридина в порфирине (схема 5). Продукты синтеза были получены с 60—70% выходом.

С олигонуклеотидами ОЗ и 04 были синтезированы конъюгаты К6 К9. структуры которых приведены в таблице 2. Эти конъюгаты образовывали с мишенями МЗ и М4 комплексы ДЗ и Д4, соответственно (рис. 1).

Таблица 2

Структуры конъюгатов порфиринов 4 и 5 с олигонуклеотидами

Конъюгат Порфирин Олигонуклеотид

Кб 4 ОЗ

К7 4 04

кх 5 ОЗ

К9 5 04

Реакционные смеси облучали в течение 10 мин светом Ыс1:УЛС лазера при длине волны 532 нм. Для всех конъюгатов, содержащих в структуре порфирина как неметилированный остаток пиридина — Кб—К7, так Ы-метилированный остаток пиридина — К8 К9. было показано, что в результате реакции модификации образуются продукты сшивки с выходом примерно 20%. После обработки пиперидином было обнаружено, что модификация протекала преимущественно по основаниям в11, в13—в15 в случае 22-звенного олигонуклеотида — мишени МЗ, и по основаниям в13 и в15 16-звенной мишени М4. Общий выход реакции модификации олигонуклеотида МЗ составил 77% и 84% в случае конъюгатов Кб и К8, соответственно. Положения модифицированных нуклеотидов свидетельствовали о протекании реакции в комплементарных комплексах.

Хлорины

В работе [13] авторы использовали в качестве реакционной группы хлорины 6 и 7 (схема 6), получив их путем восстановления протопорфирина и гептаэтил-винилпорфирина. Хлорины характеризуются сильным возрастанием интенсивности длинноволновой полосы спектра поглощения и ее батохромным смещением по сравнению с порфиринами. В длинноволновой области спектра свет способен проникать в живые ткани, что удобно для проведения ФДТ. Причем с возраста-

OH

COOH

COOH

Хлоринпротопорфирин, СРР б

Хлорингептаэтилвинил-порфирин, CHEVP 7

Схема 6

нием длины волны света увеличивается глубина его проникновения в ткани.

Хлоринпротопорфирин 6 был выбран из-за наличия в его структуре двух остатков пропионовой кислоты, что, по замыслу авторов, (как и в случае других реакционно-способных соединений, имеющих карбоксильную группу) позволяло сразу использовать 6 в синтезе олигонуклеотидного производного (схема 7). Выход конечных продуктов составил 30—4

о

ОБК-О-Р-СТ б" Ру2й2, РЬ3Р БМАР

O II

(HO-C-(CH2)2)2CPP'

O \

2

O

O //-\ CH3

ODN-O-P-O-N VN'

О" \=/ ^CH3

H2N-(CH2)rNH2

O

ODN -O-P-O- HN-(CH2)6- NH2 O"

O

II

HO^(CH2)2

ODN-0-P-0-HN-(CH2)6-NH-C-(CH2)2''

O" O

Схема 7

.CPP'

ODN = O5

CPP' = остаток CPP

Было предложено синтезировать конъюгаты, содержащие СНЕУР 7, двумя методами. В первом случае к олигонуклеотиду присоединяли линкер в виде ди-гидразида адипиновой кислоты, аминогруппа которого участвовала в дальнейшей реакции с альдегидной группой хлорина (схема 8). В этом случае получали продукты реакции с выходом около 40%. Другой метод синтеза отличался тем, что диаминогексанол, как линкер, сначала присоединяли к альдегиду хлорингепта-этилвинилпорфирина 7, и только потом проводили реакцию с активированным фосфатом олигонуклеоти-да с выходом 70—80% (схема 9).

Были синтезированы три конъюгата К10—К12 (см. табл. 3). Только К11 был испытан как реагент для направленной фотомодификации нуклеиновых кислот.

ODN-O-P-O-N V-N О" \=/

,СНз Py2S2, Ph3P

CH3

DMAP

ODN-O-P-CT O"

OO H2N-NH-^(CH2)4-C-NH-NH2

O O O

и Ii II

ODN-0-P-0-NH-HN-C-(CH2)4-^NH-NH2

O"

H-C-CH=CHEVP'

O O » O

N II II

ODN-0-P-0-NH-HN-C-(CH2)4-^NH-N=CH-CH=CHEVP'

O"

ODN = O5

CHEVP' = остаток CHEVP

Схема 8

O

H-C-CH=CHEVP'

THF

H2N-(CH2)6-NH2

O

H2N-(CH2)6-NH-C-CH=CHEVP'

O

ODN-O-P-O"

O" Py2S2, Ph3P DMAP

ODN-O-P-O-N VN

О" \=/ CH3

ODN = O5

O » O

ODN-0-P-0-HN-(CH2)6-NH-C-CH=CHEVP O"

Схема 9

Использовали три различные мишени: одноцепо-чечный оли гонуклеоти д М5; дуплекс, состоящий из мишеней М5 и Мб и дуплекс, образованный олиго-нуклеотидом М7. Взаимодействие мишеней М5, Мб и М7 с конъюгатом К11 приводило к образованию дуплекса Д5, триплексов Т1 и Т2, соответственно (рис. 1).

Комплексы Д5, Т1 и Т2 облучали светом ксеноно-вой лампы в видимой области спектра (свыше 310 нм) и при длинах волн 428 и 668 нм. Для всех комплексов было обнаружено, что выход продуктов модификации растет от времени облучения. На примере 41-звенного оли гонуклеоти да- ми шен и М7 было показано, что максимальная степень модификации по положениям 13—26 достигала 29% и 23% за 900 с при облучении на длинах волн 428 нм и 668 нм, соответственно. Также было обнаружено, что в основном модифицируются основания, преимущественно гуанозины, находящиеся в области расположения молекулы хлорина в составе комплексов.

Таблица 3

Структуры конъюгатов, содержащих хлорины 6 и 7

Конъюгат Хлорин Олигонуклеотид № схемы синтеза

К10 б 05 7

К11 7 05 8

К12 7 05 9

O

O

Комплексы тексафирина и сапфирина

Дальнейший поиск фотоактивных группировок, поглощающих в более длинноволновой области спектра по сравнению с порфиринами и хлоринами, привел к аналогам порфиринов с расширенным циклом, таким как сапфирин 8 и тексафирин 9, содержащий 1л1(Ш) (схема 10). Лютециевый комплекс тексафирина растворим в воде и имеет сильное поглощение вблизи 740 нм. Сапфирин 8 также поглощает свет в области спектра свыше 600 нм. В работе [14] были исследованы олигонуклеотидные конъюгаты с обоими соединениями.

[ з ^ {

2 Cl"

Сапфирин, Тексафирин

ЭР лютеция(Ш), 8 Я = СН2СОМ(СН2СН2ОН)2 ЬиТх 10 Я = СН2СН2ОН 9

Схема 10

Сравнив способность реагентов 8 и 9 расщеплять ДНК, авторы выяснили, что более эффективен комплекс тексафирина лютеция 9, который и использовали для синтеза конъюгатов. Метод синтеза заключался во взаимодействии активированной карбоксильной группы тексафирина лютеция 9, в виде Ы-оксисук-цинимидного эфира, с аминогруппой линкера олиго-рибонуклеотида (схема 11). Выход продуктов синтеза

не приведен. В синтезе конъюгатов К12 и К13 были

'

леотиды Об и 07, комплементарные 36-звенным де-зоксирибоолигонуклеотидам — мишеням М8 и М9, соответственно (рис. 1).

Фотомодификацию проводили в дуплексах Д6 и Д7, облучая комплексы в течение 15 мин светом лазера на красителях, настроенного на длину волны 732 нм. Было показано, что модификация протекает в основном (70— 80%) в пределах сайта комплементарного взаимодействия конъюгата с мишенью, преимущественно по гуано-зинам. Щелочелабильными сайтами модификации для

(CH2)2-OH

J.

SP'

\

(CH2)2-OH

DMT-Cl Py, DMAP

Lu Tx'-OCH-C-OH

DCC O

HO-N

Lu Tx'- O CH2 C O N

H2N-(CH2)6-OP-O-ODN

o-

ODN = O6, O7

Lu Tx' = остаток LuTx

Lu Tx!_O-CH2-aHN-(CH2)6-O-P_O-ODN

I

O

Схема 11

M8 являлись G9, G17,G20 и G23, а для M9 - G12, G17,G18, G21 и G23. Общий выход реакции модификации в обоих случаях был невысоким.

Синтез конъюгата сапфирина с олигонуклеотидом и испытание его как фотомодифицирующего агента было описано в работе [15]. Сапфирин 10 (см. схему 10) отличался от 8 только боковым заместителем R.

Синтез конъюгата авторы проводили в несколько стадий по тому же методу синтеза, что и в работе [12] с выходом 56% (см. схему 5). Отличиями были использование вместо адамантанкарбонилхлорида пива-лоилхлорида в качестве конденсирующего агента и отсутствие стадии N-метилирования (схема 12).

Для синтеза конъюгата К14 использовали олиго-нуклеотид 04, который образует дуплекс Д8 с олигонуклеотидом — мишенью М10 (рис. 1).

Дуплекс Д8 облучали светом ксеноновой лампы высокого давления с использованием фильтра, вырезающего из спектра область ниже 620 нм. Было показано, что образуются сшивки с выходом 4—7%. После обработки пиперидином для выявления щелочелабильных модификаций было обнаружено, что модификация мишени М10 протекала в области расположения реакционной группы, преимущественно по положениям G24, G^G28, G30 с общим выходом 15—23%.

SP'

(CH2)2-Ov / DMT

\

(CH2)2-OH

1)P[(CF3)2-CH-0]3 Et3N, СН2С12

2) TEAB/H,0

SP'

(CH2)2-O„

DMT O

(CH2)2-^P-O' CH3 O H

NEt3H

(CH2)^O„ J.

CH3-^C

CH3 4C1

SP' \

DMT O

OOHL0

(ch2)2-^P-o-odn;

# b/Py

1/cpg)

(CH2)rO.

./Py/Melm/THF/H,0 / SP

SP'

NH3 H20 25 °C, 1 ч

(CH2)2-OH /

O

DMT

(CH2)2-^P-O-odn O

,/Et,N/THF/H,0

C6H4-O-CH3-^-C6H4

C6H4-^CH3-

\

DMT O

(CH2)2-<^P-O-ODNL^cí^

ODN = O4

O

O

OH

OH

n

n

Комплексы фталоцианинов цинка(П) и алюминия(III)

Синтетические аналоги порфиринов — фталоциан ин ы (тетрабензотетраазапорфи -рины) по сравнению с порфиринами обладают рядом достоинств. Во-первых, электронный спектр у них сдвинут в длинноволновую область, поэтому они могут возбуждаться светом с длиной волны более 600 нм, что существенно для их применения в фотодинамической терапии [16]. Во-вторых, химически они более стабильны, чем порфирины. В-третьих, комплексы фталоцианинов с некоторыми ионами переходных металлов катализируют окисление органических субстратов молекулярным кислородом в темновых условиях.

В работе [17] описан синтез коньюгатов олигонуклеотидов с фталоцианинами /п(П) 11 и А1(Ш) 12:

Таблица 4

Структуры коньюгатов, несущих фталоцианины 11 и 12

Конъюгат Фталоцианин Олигонуклеотид Линкер

К15 11 ОЗ -NH-(CH2)3-0-

К1б 11 ОЗ -NH-(CH2)6-0-

К17 12 ОЗ -NH-(CH2)3-0-

К18 12 ОЗ -NH-(CH2)6-0-

Для синтеза коньюгатов К15—К18 (см. табл. 4) был использован оли гонуклеоти д ОЗ, комплементарный оли гонуклеоти ду — мишени МЗ (рис. 1).

Реакционные смеси облучали как светом ртутной лампы видимой области спектра (X > 360 нм), так и светом гелий-неонового лазера на длине волны 633 нм. В ходе экспериментов не было обнаружено образования сшивок, поэтому продукты модификации выявляли обработкой пиперидина и 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой из Е. coli. Степень модификации при облучении светом ртутной лампы составляла 18%, 14%, 12% и 7% после обработки пиперидином и 8%, 6%, 5% и 5% после обработки 8-оксогуанин-ДНК-гликозилазой для коньюгатов К15, К16, К17 и К18, соответственно. Модификация проходила в основном

Фталоциан ин, Ptc

11

М = Zn(II) R = S-CH.

12

М = Al(III) R = S()-\'H-(CH.)<

;13

по гуанозинам в'^в20, преимущественно в15 (неопубликованные данные).

Светом гелий-неонового лазера облучали комплексы ДЗ, содержащие конъюгаты К16 и К18. Степень модификации, выявляемая пиперидином, достигала 24% для К16 и 10% для К18. В отличие от экспериментов с использованием света ртутной лампы модификации также подвергались основания в6, в7 и в8.

Твердофазный метод синтеза коньюгатов, предложенный авторами, заключался во взаимодействии аминогруппы линкера, присоединенного к олигонук-леотиду, с Ы-оксисукцинимидным эфиром соответствующего фталоцианина (схема 13). Продукты синтеза были получены с выходом 30—40%.

Н^ - (СН,)6- О-

О °

Ptc' (C-0-N

О

Ptc'(C-0-

DPEA/DMF

t . 2 ч

|)3 -t-HN-(CH2)6-O-0DNi^CPG^

60 С, 12 ч

ЫНз(конц.)

О

О ^ о Ptc'(C-0-N |)3-C-HN-(CH2)6-0-0DN

0,1 МЫаНСОз 0,1 MNa2C03

45 С, 24 ч

О о Ptc' (¿-ОН)з-У- HN -(CH2)6-0-0DN

ODN = O3

Таким образом, проведенные исследования показали, что порфирины и их аналоги способны выступать в качестве реагентов для направленной модификации нуклеиновых кислот. Модификацию в РНК выявляли по появлению прямых разрывов цепи, а в случае ДНК — по наличию повреждений, приводящих к разрыву цепи в щелочных условиях. Наибольшая эффективность модификации (-80%) была достигнута для коньюгатов, содержащих остатки порфирина, замещенные по мезо- положениям 4-п:иридильными и 4- N - метилп ири ди н иевыми группами [12]. При этом облучение проводили видимым светом с длиной волны 532 нм, что свидетельствует о перспективности использования данных соединений в ФДТ.

Конъюгаты олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами, катализирующими окислительную модификацию нуклеиновых кислот

Порфирины

Известно, что комплексы парамагнитных ионов Гс(11), Со(П), Мп(П) и других металлов катализируют в гомогенных условиях реакции окисления органических соединений молекулярным кислородом 02. В ходе процессов окисления происходит образование активных промежуточных частиц: радикалов 02'~ и НО', и молекул Н202. Комплексы порфиринов и фта-

лоцианинов с парамагнитными ионами переходных металлов являются одними из наиболее эффективных катализаторов таких процессов окисления [18]. Поэтому эти комплексы могут выступать в качестве активных группировок в реакционноспособных производных олигонуклеотидов и вызывать специфическую деградацию нуклеиновых кислот в темновых условиях.

Первое производное олигонуклеотида, содержащие железопорфириновый фрагмент, получено на основе комплекса метилпирропорфирина XXI 2а с Ре(Ш) [19]. В рассматриваемой работе описывается синтез конъюгата Ре(Ш) метилпирропорфирина XXI с оли-гонуклеотидом и испытание его как реагента для сайт-специфической модификации. Авторы предложили следующий метод синтеза: этиловый эфир метилпирропорфирина XXI взаимодействует с амино-1-гек-санолом с образованием амидной связи; полученное соединение вступает в реакцию с З'-фосфатной группой защищенного гептатимидилата. После снятия защитных групп в атмосфере аргона в остаток порфи-рина вводится ион металла (схема 14).

О

С2Н5-0-С-(СН2)2-Рог'

НО-(СН2)б-МН2

о

НО-(СН2)6-МН-С-(СН2)2-Рог'

\1STe

о

II

0

#ОБ]Ч-0-Р-СГ

1

О"

о

Р

О"

снзсоон

о

II

ВНА-БВи О

ОВК-О-Р-О-(СН2)6-МН-С-(СН2)2-Р0г' О"

Аг, РеС12 О

60-80 С О

О"

СН3

О N.

\1STe: Н3С-

ВНА

ОБК = 08 Схема 14

Таким же методом в работе [19] присоединяли '

'

Для получения порфиринового производного гептатимидилата, не имеющего фосфатной группы на

'

этого синтеза (схема 16). Сначала синтезировали за'

'

фатическую аминогруппу. Полученный замещенный О

Рог'-СН^СН^-ТЧНЧСН^б-ОН О

М8Те ЧЭ-Р-О-ОБК-(СИ2)5-Асг

О

0 О Por,-CH2-CH2-¿-NH-(CH2)6-O-P-O—ODN-(CH2)5—Acr

1 О-

1 ВНА-ОВи

О

Por,-CH,-CH,-C-NH-(CH2)6-^^^OD^(CH2)^Acr

Аг, РеСЫ 60-80°С

О О

Fe(III) Por'—CH2-CHrC-NH-(CH2)6-O-P-O-ODN-(CH2)5-Acr

О"

CH3O.

Acr =

ODN = 08

та

N

I

H

Схема 15

О

ММТг-Т-СН2-ё-0-СН3 Н2Ы-(СН2)2-:ЫН2

о

ММТг-Т-СН,-^- НЫ-(СН,)7-ЫН,

о "

С2Н5-0-С- Рог

о

о

ММТг-Т-СН2-Ь- НМ-(СН2)2-1\1Н—'¿—Рог'

н+

о

о

НО- т- СН2- ё- НЫ-(СН2)2-ЫН-£- Рог'

МБТе

О

О-

О О ' "О

#001М-0- №-Т-СН2-ё- НЫ-(СН2)2-ЫН—'¿—Рог' 0~

снзсоон о о

ВНА-ЭВи

о

ОБИ - о- т- СН2-Ь- НТМ (СН2)2- 1МН -'¿- Рог' О-

Аг, РеС12

60-80'°С

0 0 о

ОБИ-О-Р-Т-СН2-Ь-РТЫ (СН2)2-ИН-Ь-Рог'Fe(III)

о-

ООИ = 08 Схема 16

H

Таблица 5

Расположение порфирина 2 в конъюгатах К22—К25

Конъюгат 3' Конец '

К22 Рог- -МН-(СН2)2- NH-CO- -СН2- -0- -ОН

К23 Рог- -NH-(CH2)4- NH-CO- -СН2- -О- -ОН

К24 Рог- -NH—(СН2)6— -ОН

К25 Асг- -сн2)5- —(СН2)6—NH—Рог

Рог''

О

(СН2)2-С-ОН

(СН2)-

о О Н3С-С-О-С-СН3

О

(СН,),-С Рог'С "" У> (СН2)2-С

о

тимидин вводили в реакцию с этиловым эфиром порфирина (взаимодействие по алифатической аминогруппе линкера) и затем наращивали олигонуклеоид-ную цепь.

Были синтезированы конъюгаты К19 (схема 14), К20 (схема 15) и К21 (схема 16), содержащие олиго-нуклеотид 08, комплементарный олигонуклеотиду — мишени М11 (рис. 1). Как мишень использовали и олигодезоксирибонуклеотид и олигорибонуклеотид. Модификацию мишеней проводили в составе дуплекса Д9 при О °С в присутствии 5 мМ дитиотреита в качестве сопряженного восстановителя.

Максимальный выход реакции модификации конъюгатами К19 и К21 составлял 37% для поли(ёА) и 20% для поли(гА). Использование неметаллированных аналогов конъюгатов К19 и К21 не приводило к расщеплению олигонуклеотида М12. В экспериментах с конъюгатом К20 при 0 °С степень модификации была низкой, однако повышалась при более высокой температуре.

В следующей работе этой лаборатории [20] были синтезированы несколько конъюгатов метилпирро-порфирина XXI с олигонуклеотидом 08 (см. табл. 5) такими же методами синтеза (см. схемы 14—16).

В этой работе авторы провели детальное испытание полученных конъюгатов, как реагентов специфичных к последовательности олигонуклеотида мишени М12 в комплексе Д10 (рис. 1). Модификацию проводили в присутствии аскорбата натрия, дитиотреита или мер-капто-пропионовой кислоты как сопряженных восстановителей или в присутствии перекиси водорода. Для сравнения эффективности модификации в зависимости от координированного металла в порфирине синтезировали соединение К23 с различными метал-локомплексами метилпирропорфирина XXI: Fe(III), Co(III), Mn(III) и Cu(II). Было показано, что конъю-гат К23, содержащий Fe(III), является наиболее реак-ционноспособным, тогда как К23 с Mn(III) и Cu(II), так и без металла показали очень низкую активность. В присутствии аскорбата натрия как восстановителя наибольшую активность проявило соединение К24. Поэтому для дальнейших экспериментов был выбран наиболее реакционноспособный конъюгат К24, содержащий Fe(III).

В присутствии дитиотреита и меркапто-пропионовой кислоты — сопряженных восстановителей, в экспериментах с конъюгатом К24 Fe(III) было обнаружено образование одного и двух продуктов сшивок, соответственно. В этих условиях наиболее сильной модификации подвергался остаток Т9, тогда как с аскорбатом натрия — G8, которые находились в области расположения порфиринового кольца. Общий выход реакции после обработки пиперидином был относительно низок и составлял 1—2%.

В присутствии Н202 в экспериментах с конъюгатом К24 Ге(Ш) обнаружено образование продуктов сшивок с выходом 10%. После обработки пиперидином были выявлены три главных фрагмента модификации: в8, в6 и С)4. Выход реакции модификации в присутствии Н202 был выше по сравнению с реакциями расщепления в присутствии сопряженных восстановителей, но модификация проходила по большему числу нуклеотидов мишени, то есть была менее локализована.

Синтез и испытание конъюгата гемина (комплекс Ре(Ш) с протопорфирином IX За) с олигонуклеотидом описаны в работе [21]. На первой стадии синтеза проводили конденсацию двух карбоксильных групп в молекуле протопорфирина IX За, получая ангидрид. В условиях фосфотриэфирного метода синтеза к олигонуклеотиду присоединяли аминоэтанол, аминогруппа которого в дальнейшем реагировала с внутренним ангидридом гемина. Выход продукта с учетом стадий переосаждения, проводимых в целях очистки, составил около 20% (схема 17).

O

-#

-с-он

II

о

-O-P-O-ODN' OO

F3C-C-NH-(CH2)2-OH I TPS, MeIm

O O

F3C-C-NH-(CH2)2-O-P-O-ODN# O

NH4OHk0H4 *O

NH2-(CH2)2-O-P-O-ODN O

(CH3-(CH2)3)4NF

Py : H20 = 1:1

Рог''

(CH2)2 O P O ODN

(CH2)2-C-OH О

O

ODN = O9

Схема 17

Для синтеза конъюгата К26 использовали олиго-нуклеотид 09, комплементарный участку 261—274 М13 303-звенного одноцепочечного фрагмента кДНК вируса клещевого энцефалита (рис. 1). Было установлено, что после протекания реакции расщепления в присутствии аскорбиновой кислоты как сопряженного восстановителя, появляются два разных продукта сшивок с выходом 45% и 6%. Последующая обработка пиперидином приводила к их исчезновению и селективному расщеплению фрагмента ДНК по остаткам

С275 „ С276^

Исследования геминовых производных олигонук-леотидов получило продолжение в работе [22], где авторы использовали в качестве реакционной группы не только гемин, но и дейтерогемин 13.

Синтез проводили по предыдущему методу (схема 17), где в зависимости от синтезируемого конъюгата, добавляли ангидрид либо гемина, либо дейтерогемин а. Для синтеза конъюгатов К27—КЗО (табл. 6) использовали

Структуры конъюгатов, несущих порфирины 3 и 13

Конъюгат Порфирин Олигонуклеотид Линкер Положение реакционной группы

K27 3 OIO —NH—(СН2)3- -0- 5'

K28 3 OIO —NH—(СН2)6- -0- 3'

K29 13 OIO —NH—(СН2)3- -0- 5'

КЗО 13 OIO —NH—(СН2)6- -0- 3'

Н3С-

Н3С-

COOH

СООН Дейтерогемин 13

олигонуклеотид 010, комплементарный участку 259—274 М13 303-звенного одноцепочечного фрагмента кДНК вируса клещевого энцефалита (рис. 1).

Модификацию мишени М13 конъюгатом К27 проводили в присутствии перекиси водорода в течение 1 ч при 25 °С. Было показано, что образуются продукты сшивки, которые после обработки пиперидином преобразуются в продукты модификации ДНК по основаниям О215 и 021Ь. Кроме того, наблюдали расщепление в олигогуаниновой области ДНК (в17—в34), по-видимому, за счет образования неканонического комплекса с участием пар в—Т. Общий выход реакции расщепления составлял 52%. Модификация мишени М13 конъюгатом К28 в присутствии перекиси водорода приводила к расщеплению ДНК, выявляемому после обработки пиперидином, по основаниям

с;17 с;34, с;174 и в258.

При синтезе конъюгатов К29—КЗО авторам удалось методом обращенно-фазовой ВЭЖХ выделить по два различных продукта в каждом случае: К29а. К296 и КЗОа, КЗОб. Использование конъюгатов К29а и КЗОа приводило к неспецифической модификации с общим выходом реакции около 20%, тогда как конъюгаты К296 и КЗОб специфически модифицировали мишень по основаниям в258 и О215, , соответственно, с общим выходом реакции модификации 60%.

В работе [23] описаны синтез и испытание конъюгатов олигонуклео-тидов с дейтеропорфирином IX, замещенным по второму и четвертому положениям а-(2-гидроксиэтокси)-этильными группами.

Авторы предложили общую схему

'

Таблица 6 (схема 18). Выход синтеза на стадии конденсации олигонуклеотида с порфирином составлял 95%.

Для синтеза конъюгата К31, несущего комплекс 2,4-ди[а-(2-гидрок-сиэтокси)этил]-дейтеропорфирина IX с Ре(Ш), как и в предыдущей работе использовали олигонуклеотид 010, комплементарный мишени М13 (рис. 1). Так как 14 содержит две несимметричные ОН-группы, то в результате синтеза образуются два изомера, разделяемые только частично, поэтому в исследовании модификации ДНК использовали смесь этих изомеров. Вторая ОН-группа в ходе синтеза замещается на 2,4,6 - триизопропилфе-нилсульфонильный остаток.

CH2-CH2-OH O

CH3—CH CH

CH3

л/"^ CH-^CH^CH2-OH

V M

Fe //

/ . //

^—CH3

H3C-

COOH

COOH

2,4-ди[а-Гидроксиэтокси)этил]дейтеропорфирин IX, DDP 14

Модификацию ДНК проводили в дуплексе Д12 в присутствии перекиси водорода. Было показано, что образуется несколько продуктов сшивки с общим выходом 37%, и с невысоким выходом (3%) происходит прямое селективное расщепление ДНК. Обработка реакционной смеси пиперидином приводила к исчезновению продуктов сшивки и селективному расщеп-

O

NC-

-ch2-ch2-»P-<oodn#

O-C6H4-Ci O

Cl-P-Cl

NEt3

O

oP-

O

O-ODN

C6H4 Cl

#

O C6H4 Cl O C6H4 Cl

DDP'-OH

TPS

Melm

O

DDP'-OP-O

TBAF NH4OH

O-ODN# C6H4 Cl

N2HH> ^СбН^С1

2 O O

NC—CH2- CH2- O P-O- ODN#- O- P- O

^6H4 """

DDP'-OH TPS Melm

O O

NC—CH2- CH2- O P-O- ODN#- O-P-^DDP' 0-СбЩ-С1 O-C6H4-C1

O

DDP'-OP-O

O-ODN

TBAF NH4OH

ODN = OIO Схема 18

OO "O P-O- ODN-^ P- O- DDP' OO

лению мишени по основаниям в17—в34, О215 и 021Ь с общим выходом 67%.

Кинетические исследование модификации ДНК конъюгатом олигонуклеотида, содержащим дейтеро-порфирин 14, в составе другого дуплекса проводили в работе [24]. Синтез конъюгата проводили методом, описанным в предыдущей работе [23] (схема 18).

Для синтеза конъюгата К32 использовали олиго-нуклеотид ОН, комплементарный олигонуклеотиду мишени М14 (рис. 1). Модификацию проводили в составе дуплекса Д13 в присутствии перекиси водорода. Было показано, что выход реакции модификации зависел от концентрации конъюгата и Н202, причем оптимальным сочетанием были следующие концентрации: 1 • 1СГ5 М для реагента и 5 • 1СГ4 М для Н202. В этом случае выход реакции модификации составлял 25%. Кроме того, было обнаружено, что реакционная группа 14 конъюгата К32 деградирует в присутствии перекиси водорода.

Другой цикл работ посвящен конъюгатам, содержащим синтетические порфирины, несущие в трех мезо-положениях пиридильные 15 или Ы-метилпи-ридиниевые группы 16а-б, а в четвертом мезо-положении — алифатическую карбоксильную группу, присоединенную через фенильный заместитель. В работе [25] описываются методики синтеза конъюгатов со следующими порфиринами и их комплексами с металлами:

R

„N N

а ч- / \

// М Л—R2—L—COOH

L — линкер

л<ето-Трис(4-пиридил)[4-(4-карбоксил-бутокси)фенил]пор-фирин, ТРуРог 15, М = 2Н, Mn(III)

N; r,

// V

О—; L = (CH2)4

,мет<>Трис(4^-метилпиридиний)[4-(карбоксилбутокси)фе-нил]порфирин, ТМРуРог 16а

16а: R,

ГЛ-CH« / 0 ; L = (CH2)4;

X3

166: R, = —(! V-CH3; R2 = L = CH2:

9 Wo-

X3

16в: R| = —v V-CH^

L = (CH2)4;

X

для 16a—в M = 2Н, Mn(III), Ni(II), Cu(II), Co(II), Fe(III)

Синтез конъюгата олигонуклеотида с порфирином ТРуРог 15 проводили через стадию образования эфира СООН-группы порфирина с 1-гидроксибензо-триазолом HOBT, который в дальнейшем реагировал с аминогруппой линкера, заранее присоединенного к 5'-концевому фосфату олигонуклеотида (схема 19). Выход синтеза составил 45%.

O

TPyPor'-C-OH

СН2С12, CDlj34 HOBT |12 ч

N

о N

TPyPor'-C-O-N

H2N-(CH2)6-NH-C-0-0DN

O

60 С ,3ч

HEPES, pH = 8,0

O и

TPyPor'- C HN - (CH2)6- NH- C- O-ODN

HOBT =

N

H O N N

ODN =

Схема 19

При синтезе конъюгатов олигонуклеотидов с порфирином ТМРуРог 16а, основным отличием от вышеописанного метода было введение в порфирин иона металла, которое проводили (после присоединения олигонуклеотида) со 100%-ным выходом (схема 20).

о

TMPyPor'-C —OH

DMF, CDI | 'коми, 13 ч HOBT | 2,5 ч

O

H2N-(CH2)6-NH-C-0-0DN

60 С ,5ч HEPES, pH = 8,0

0 о

TPyPor'-C-HN-(CH2)6-NH-C-O-ODN

Мп(ОАС)2 • 4Н20 или СиС12

O

или СоС12*6Н20

100 С, 1 ч

O

MTPyPor'-C-HN-(CH2)6-NH-C-O-ODN M = Mn(III), Cu(II), Co(II); ODN = O12 Схема 20

При синтезе конъюгатов, содержащих олигонукле-отид 012, исключение составил лишь никелевый (II) комплекс 4- N - метилп ири дин иевого порфирина 16а, который получали до синтеза с олигонуклеотидом (схема 21). Выход конъюгата составил около 80%. Конъюгат олигонуклеотида 013 с комплексом порфирина 16а, содержащим Мп(Ш), синтезировали также согласно схеме 21 с выходом 25%.

О

N1(11} ТМРуРог'-С—ОН

ИМБ, сга (коищ 2 ч

HOBT 1 ч

O

H2N-(CH2)6-NH-C-O-ODN

60 С, 3 ч HEPES, pH =

8,0

O

O

Ni(II) TPyPor'—С— HN—(CH2)6-NH— С- O- ODN ODN = O12, O13 Схема 21

Для синтеза конъюгатов КЗЗ—К38 (табл. 7) были использованы олигонуклеотиды 012 и 013.

Конъюгат К38 был испытан в качестве ДНК-расщепляющего реагента на мишени М14, содержащей инициирующий кодон tat гена HIV-1 [26]. Показано, что он эффективно расщепляет мишень в комплексе Д14 по основаниям Т18—С23 находящимся вблизи порфириновой группы.

Таблица 7

Структуры конъюгатов, содержащих порфирины 15 и 16а

Конъюгат Порфирин Олигонуклеотид Металл, M

КЗЗ 15 012 2Н

К34 16а 012 Mn(III)

К35 16а 012 Cu(II)

К36 16а 012 Co(II)

К37 16а 012 Ni(II)

К38 16а 013 Mn(III)

В следующей работе авторов [27] был описан синтез и испытание конъюгатов олигонуклеотидов с пор-фирином 16а. Синтез конъюгатов проводили согласно упомянутому выше методу синтеза (см. схему 21) с 30% выходом. В этом случае вместо 1-гидрок-сибензотриазола как активирующего соединения использовали 1-гидрокси-7-азабензотриазол и присоединение олигонуклеотидов проводили не в HEPES-, а в MOPS-буфере (рН = 7,5). В синтезе конъюгатов К39 и К40 использовали олигонуклеотиды 013 и 017 соответственно, а в качестве мишени — олигонуклеотид М15 (рис. 1).

Модификацию мишени в дуплексах Д14 и Д15 проводили в присутствии свежеприготовленного раствора KHS05 в качестве окислителя [28]. Это соединение активировало порфирин, приводя к образованию оксокомплекса иона металла, находящемуся в высшей степени окисления (+4 или +5). В этом случае окисление субстратов должно происходить путем переноса на субстрат атома кислорода в синглетном

состоянии. Такой механизм называется «оксеноидным» [29]. В настоящее время он постулируется для процессов с участием цитохрома Р-450 [30], а также для противоопухолевого антибиотика блеомицина [31].

Различия в модификации мишени конъюгатами К39 и К40 не наблюдали. После обработки пиперидином были выявлены основания нуклеотидов, по которым проходило расщепление: Т18 и G19—G26. Общий выход реакции модификации составлял 50% при соотношении концентраций конъюгат/мишень 10 нМ/10 нМ, и 90% при отношении 100 нМ/10 нМ.

Синтез конъюгатов пептидоолигонуклеотида 015, содержащего ado„ (я = 1, 2, 3), с порфирином 16а описан в работе [32], выход их достигал 80—90%. Синтез проводили через образование эфира при взаимодействии СООН-группы порфирина с 1-гидрокси-бензотриазолом, который в дальнейшем реагировал с аминогруппой PNA 015 (схема 22).

O

Mn(III) TMPyPor'-C-OH

DMF, CD1 »B

HOBT I 1ч

MV PNA

1

, 0,75 ч

MOPS, pH = 7,5 O

C

Мп(Ш) ТМРуРог'

Схема 22

В качестве мишени использовали дуплекс, состоящий из олигонуклеотидов М16а и М166 (рис. 1). Модификацию конъюгатом К41 проводили в триплексе ТЗ в присутствии КIIБыли обнаружены прямые разрывы олигонуклеотидов-мишеней: по основаниям Т12—Т23 для М16а и по основаниям в13, в16 и А17 для М166 с общим выходом реакции модификации 10%. Было показано, что константа образования комплекса конъюгатом К41 с олигонуклеотидом-мишенью в 100 раз выше, чем константа образования такого же комплекса неконъюгированной РЫА.

Исследования влияния природы металла и длины линкера на эффективность модификации описано в работе [33] на примере конъюгатов олигонуклеотидов с трис(Ы-метилпиридиний)порфиринами. Синтез некоторых конъюгатов: К42, К46 и К47 проводили по вышеописанному методу (схема 22) с выходом 60— 70%. Часть конъюгатов К43—К44 синтезировали через образование бензотриазол-активированных эфиров при взаимодействии карбоксильной группы порфири-нов с Ы-метилморфолином, бензотриазол-1-ил-окситрис(диметиламино)фосфонием (ВОР) и НВОТ. На второй стадии синтеза активированные эфиры вступали в реакцию с 5'-ЫН2-группой линкера, кова-лентно связанного с олигонуклеотидом. Выход реакции составил 40% для конъюгатов К43 и К45, 30% для К48 и только 10% для К44 (схема 23).

С небольшими отличиями был проведен синтез конъюгата К49 олигонуклеотида с комплексом Ге(Ш)-порфирин (схема 24) с выходом 70%.

Для синтеза конъюгатов К42—К46, несущих линкеры различной длины (см. табл. 8), использовали

O

Mn(III) TMPyPor'-C—OH

I

60 °C, 15 мин O

NMM, BOP, HBOT

H2N(CH2)^nh-C-O-ODN J MOPS 14

pH = 7,5

OO Mn(III) TPyPor' - C- HN-(CH2)n- NH- C- O- ODN

ODN = O13, O16

Схема 23

O

Fe(III) TMPyPor'-C-OH Melm, CD1J йсомн, 2 ч HOBT I 2 ч

0 „„,T I 60оС.12ч

MOPS, pH = 7.5

O 11

O

Fe(III) TPyPor'-C-HN-(CH2)6-NH-C-O-ODN

ODN = O16

Схема 24

олигонуклеотид 013, а для конъюгатов K47—K49 (табл. 9) — олигонуклеотид 016. В качестве мишеней использовали 35-звенные последовательности частей кодонов tat М17 и rev М18 ДНК вируса иммунодефицита человека (HIV), содержащие последовательности, комплементарные олигонуклеотидам 013 и 016, соответственно (рис. 1).

Изучение влияния длины и характера линкера на эффективность модификации проводили в комплексе Д16 конъюгатами К42—К45 в присутствии KHS05. Для всех конъюгатов были обнаружены прямые разрывы мишени по основаниям G19 и Т18, что свидетельствовало о частичной интеркаляции порфирина в малую бороздку ДНК. После обработки реакционных смесей пиперидином было выявлено усиление модификации по основанию G19 и была обнаружена модификация по G20, G22 и G26. Выход реакции составил 50% для конъюгатов К44—К45, 80% для конъюгата К42 и 90% для конъюгата К43.

Таблица 9

Структуры конъюгатов, содержащих порфирины 16а, в

Конъюгат щ M Олигонуклеотид

К47 f "Vo- Mn(III) 016

К48 f Л®- _/ ©Br Mn(III) 016

К49 _f Fe(III) 016

Влияние числа положительных зарядов порфири-новой группы на эффективность модификации изучали в комплексе Д17 на примере конъюгатов К47 и К48. В обоих случаях выход модификации составил 75%, различия наблюдали только в профиле модификации. Конъюгат К47 главным образом модифицировал мишень М18 по основаниям G22—G24 и в меньшей степени по G19, G25 и G27, тогда как в случае конъюгата К48 основная модификация протекала по основанию G22 и незначительно по G19, А21, и G24.

Сравнение реакции модификации конъюгатами К47 и К49, имеющими разные координированные металлы, показало, что в случае соединения К47 выход реакции был больше (75%), чем в случае К49 (50%), то есть комплекс Mn(III) более эффективно катализировал окисление мишени, чем комплекс Fe(III).

Корриновый комплекс кобальта

В качестве реакционноспособной группы в конъю-гатах оли гонуклеоти дов был исследован корриновый комплекс кобальта [34]:

OH

h2ncoch2ch2 %

h2ncoch2'

H3C H2NC0CH2'

HC h3c^ch2conh2

~ch2ch2conh2

НзС / CH2 CH3 ch2ch2cooh ' / 2

CH3

; CH2

2

OC CH2CH

oh XNH

OH

Корриновый комплекс кобальта, e-HOOC-Cbi(OH)2

17

Таблица 8

Структуры конъюгатов с порфиринами 16а, б, содержащие различные линкеры

Конъюгат Линкер M Олигонуклеотид

K42 -0-(CH2)4-C0-NH-(CH2)6-NH-C0-0- Mn 013

K43 -0-CH2-C0-NH-(CH2)6-NH-C0-0- Mn 013

K44 -0-CH2-C0-NH-(CH2)2-NH-C0-0- Mn 013

K45 -0-(CH2)4-C0-NH-(CH2)2-NH-C0-0- Mn 013

K46 -0-(CH2)4-C0-NH-(CH2)3-NH-(CH2)4-NH-(CH2)3-NH-C0-0- Mn 013

Один из предложенных методов синтеза заключался во взаимодействии Со-корринового комплекса, содержащего свободную аминогруппу, с ю-аминоэнан-товой кислотой, предварительно присоединенной к олигонуклеотиду (схема 25). Выход синтеза Со-кор-ринового производного составлял 25—30%.

о

ODN-O-P-O-

O

17

1. HOBT, CDI о

2. NHr(CH2)6-C-OH

O

O

1. HOBT, DCC

2. H2N-(CH2)4-NH2

O

ODN-O-P-ONH-(CH,)6-COH е- H2N-(CH2)4-NH-C-Cbi(OH)2 i

O

CDI

O II

O * O

ODN O P O C HN (CH2)4 NH C Cbi(OH)2

O

ODN = O17

Схема 25

Во втором методе синтеза введение Со-кор-ринового комплекса по 5'-концу олигонуклеотида осуществляли в условиях стандартного автоматического фосфитамидного синтеза. Аминогруппу линкера, ковалентно связанную с олигонуклеотидом, находящимся на полимере, конденсировали со свободной карбоксильной группой Со-корринового комплекса (схема 26). Гидролиз олигонуклеотидного производного для удаления с полимера и гидролиз защитных групп проводили по стандартной методике. Выход целевого продукта составлял 80—90%.

ODN*

MeOTr- NH- (CH2V O- P

N(íPr)2

CPG

4OEtCN

I2 H

NHr (CH2)6 op-o- odn^IÍg) O-EtCN V_.y

O

e-(OH)2Cbi- C

4 OH

DCC

о о \

-(OH)2Cbi'- C NH (CH2)^ O P- O- ODN .~»л/ CPG J O EtCN

NH4OH

O O

e-(OH)2Cbi'- C-NH^CH^oP-O-ODN

O

ODN = O18

Схема 26

Для синтеза конъюгатов К50 и К51 использовали олигонуклеотиды 017 и 018, полностью комплементарные участкам 13—26 и 17—27 5S рибосомальной РНК из Е. coli, соответственно (рис. 1). А в качестве мишени фрагмент 42—120 5S рибосомальной РНК из Е. coli.

Модификацию мишени проводили в составе неполных дуплексов Д18—Д21, образование которых возможно при использовании конъюгата К51. Было показано, что в присутствии аскорбиновой кислоты как сопряженного восстановителя, мишень модифицируется по основаниям, соответствующим частичной комплементарности 018 фрагменту 42—120 5S РНК Е. coli, с общим выходом реакции модификации 30-40%.

Комплексы тексафирина диснрозия(Ш)

Другой тип соединений, используемых для модификации ДНК, — группы с расширенным циклом. Синтез и испытание конъюгатов олигодезоксирибо-нуклеотидов с тексафирином диспрозия(Ш) описан в работе [35].

Тексафирин диспрозия(Ш), ПуТх 18

Синтез конъюгатов проводили через фосфамидное производное тексафирина диспрозия(Ш), которое присоединяли к 5'-концу олигонуклеотида, полученного стандартным твердофазным методом. Выход продукта синтеза достигал 75% (схема 27).

Для синтеза конъюгатов использовали олигонуклеотид 019, комплементарный олигонуклеотиду — ми-

Dy Tx'-O(CH2)„ - OH-"

N(íPr)2

P-O-(CH2)2CN N(íPr)2

TA

CH2Cl2

Dy-(OAc)3

MeOH TEA

Tx-O(CH2)„ - OH

N(íPr)2

Dy Tx'-O(CH2)„ -^PC

-O-(CH2)2CN

TA

EtsN/THF/H?'

odnL^CTG^

Dy Tx'-O(CH2)„ -O-P—ODN:

NH4OH 25 °C, 12 ч

O-(CH2)2CN

O

Dy Tx'-O(CH2)„ -^P-ODN

O ODN = O19

Схема 27

Таблица 10

Структуры конъюгатов с тексофирином 18, содержащие различные линкеры

Конъюгат Линкер Тексафирин X Олигонуклеотид

К52 -CH2-CO-NH-(CH2)6- 18 СН2ОН 019

К53 -(СН2)б- 18 СН2ОН 019

К54 -(СН2)6- 18 н 019

К55 -(СН2)з- 18 СН2ОН 019

К56 -(СН2)з- 18 н 019

шени М20 (рис. 1). Модификацию проводили конъюгатами К52—К56 (табл. 10) в составе дуплекса Д22 в присутствии дитиотреита как сопряженного восстановителя. Оказалось, что модификация в основном проходит по основаниям G20 и А21. Было показано, что скорость реакции обратно пропорциональна длине линкера. Общий выход реакции составлял около 50% для конъюгата К52 и порядка 70—80% К53—К56.

В работе [36] авторы синтезировали вышеописанным методом (см. схему 27) два различных конъюгата тексафирина диспрозия(Ш) с олигонуклеотидом, один из которых имел реакционную группу на 5'-конце, а у другого она была присоединена к глицериновому линкеру внутри олигонуклеотидной последовательности.

Для синтеза конъюгатов К57 и К58 использовали олигонуклеотиды 019 и 020, соответственно, а в качестве мишени олигодезоксирибонуклеотид М21 (рис. 1).

Модификацию проводили в составе дуплексов Д22 и Д23, в присутствии дитиотреита как сопряженного восстановителя. Было показано, что мишень в основном подвергалась модификации по основаниям А21, А22 и G23. Выход реакции модификации в обоих случаях составлял около 80%. Однако различия в степени модификации наблюдали при добавлении в систему 25-кратного избытка немеченой РНК: 5% в случае К57 и 67% в случае К58.

Комплекс фталоцианина кобальта(П)

Использование фталоцианина кобальта(П) в качестве реакционной группы для синтеза конъюгатов с олигонуклеотидами описано в работах [17, 37].

HOOC

Фталоцианин Со(П), Со(П) Р1с

19

Синтез конъюгатов проводили в две стадии: на первой стадии синтеза к активированному 5'-концево-му фосфату олигонуклеотида присоединяли этилен-диаминовый линкер. На второй стадии свободная

аминогруппа линкера вступала в реакцию с Ы-окси-сукцинимидным эфиром фталоцианина кобальта(П) (схема 28). Выход синтеза составлял около 30%.

0

-О-Р-О-ОЭК

1

О

РУ2^2, РЬэР ЭМАР

СНз .-ч О

CH3

H2N-(CH2)3-NH2 ' O

H2N-(CH2)6-NH-P-O-ODN O

Co(II) Ptc'

lo

t-O-

O O T O

Co(II) Ptc'(C-OH)3-C- HN-(CH2)3-NH- P-O-ODN

O

ODN = O3

Схема 28

Для синтеза конъюгатов К59 и К60 использовали олигонуклеотид ОЗ, а в качестве мишеней — олигонуклеотиды М21 и МЗ, соответственно (рис. 1).

Модификацию мишеней проводили в составе дуплексов ДЗ и Д24 в присутствии дитиотреита или 2-меркаптоэтанола в качестве сопряженных восстановителей, или в присутствии перекиси водорода. Прямых разрывов в мишени обнаружено не было, однако после обработки пиперидином были выявлены основные сайты модификации: С6, в8—в10 для М21 и в11 для МЗ. Предельная степень модификации в случае использования 2-меркаптоэтанола 15%, а в случае перекиси водорода--35%.

Заключение

Ингибирование экспрессии генов с помощью оли-гонуклеотидов и их аналогов и производных — один из путей химиотерапии онкологических и вирусных инфекций [1]. Введение в олигонуклеотиды химически активных групп позволяет воздействовать на нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК) необратимым образом, тем самым усиливая биологический эффект этих соединений. Различные комплексы переходных металлов, способствующие окислительной деградации нук-

леиновых кислот с помощью фотосенсибилизирован-ной или каталитической генерации активных кислородных частиц, исследовались в качестве одного из типов таких реакционноспособных группировок. Рассмотренные в настоящем обзоре методы синтеза конъюгатов олигонуклеотидов с порфиринами и их аналогами и результаты их исследования в качестве реагентов для модификации нуклеиновых кислот позволяют сделать заключение, что некоторые из этих конъюгатов могут вызывать эффективную и селективную модификацию нуклеиновых кислот. На основе этих соединений можно создавать новые препараты для химиотерапии онкологических и вирусных заболеваний.

Работа авторов данного обзора поддержана грантами РФФИ (№ 02-04-48080, 05-04-48447), грантом поддержки ведущих научных школ (НШ-1419.2003.4), грантом Администрации Новосибирской области на выполнение проекта «Разработка методов повышения селективности фотосенсибилизаторов на основе производных фталоцианина» и грантом CRDF NO-008-X1.

ЛИТЕРАТУРА

1. Knorre D.G., Vlassov V.V., Zarytova V.F. е. a. Design and targeted reaction of oligonucleotide derivatives. Boca Raton: CRC Press Inc., FL, 1994.

2. Belikova A.M., Zarytova V.F., Grineva N.I. Tetrahedron Lett., 1967, v. 8, p. 3557-3562.

3. Antisense Research and Applications. Eds. S.N. Crooke, B. Lebleu. Boca Raton: CRC Press Inc., FL, 1993.

4. Calvin E., Mark E., Fiel R., Howard J. C. Nucleic Acids Res., 1983, v. 11, p. 6141-6154.

5. Bernadou J., Pratviel G., Bennis F. e. a. Biochemistry, 1989, v. 46, p. 663-667.

6. Battiroli G., Ramponi R., Croce A. C. Photochem. Photobiol., 1987, v. 28, p. 7268-7275.

7. Kochevar I., Dunn D. A. In: Bioorganic Photochemistry. Ed. H. Morrison, New York: John Willey&Sons, 1990, v. 1, p. 273-315.

8. Dolphin D. Canad. J. Chem., 1994, v. 72, p. 1005-1013.

9. Fedorova O.S., Savitskii A.P., Shoikhet K.G., Ponomarev G.V. FEBS Lett., 1990, v. 259, p. 335-337.

10. Kearns D.R. Chem. Rev., 1971, v. 71, p. 395-427.

11. Mastruzzo L., Woisard A., Ma D.D.F. e. a. Photochem. Photobiol., 1994, v. 60, p. 316-322.

12. Li II., Fedorova O.S., Trumble W.R. e. a. Bioconjugate Chem., 1997, v. 8, p. 49-56.

13. Boutorine A.S., Brault D., Tarasugi M. e. a. J. Am. Chem. Soc., 1996, v. 118, p. 9469-9476.

14. Magda D., Wright M., Miller R. A. e. a. Ibid., 1995, v. 117, p. 3629-3630.

15. Sessel J.L., Sansom P.I., Kral V. e. a. Ibid., 1996, v. 118, p. 12322-12330.

16. Лукьянец E.A. Рос. хим. ж. (Ж. Рос. хим. об-ва им. Д.И. Менделеева), 1998, т. 42, с. 9—16.

17. Koval V., Chernonosov A., Abramova T. e. a. Nucleosides, Nucleotides & Nucleic Acids, 2001, v. 20, p. 1259—1262.

18. Вольпин M.E., Крайнева Н.Ю., Москалева И.В. и др. Изв. АН, Сер. хим., 1996, т. 8, с. 2105-2111.

19. Le Doan T., Perrouault L., Helene С. e. a. Biochemistry, 1986, v. 25, p. 6736-6739.

20. Le Doan T., Perrouault L., Chassignol M. e. a. Nucleic Acids Res., 1987, v. 15, p. 8643-8659.

И.Иванова E.M., Мамаев C.B., Фёдорова О.С., Фролова Е.И. Биоорган, химия, 1988, т. 14. с. 551—554.

22. Frolova E.I., Ivanova Е.М., Zarytova V.F. e. a. FEBS Lett., 1990, v. 269, p. 101-104.

23. Фролова Е.И., Иванова E.M., Комарова H.И. и др. Там же, 1993, т. 19, с. 439-454.

24. Frolova E.I., Fedorova O.S., Knorre D.G. Biochimie, 1993, v. 75, p. 5-12.

25. Casas C., Lasey C. ./., Meunier B. Bioconjugate Chem., 1993, v. 4, p. 366-371.

26. Pitié M., Casas C., Lacey J. e. a. Angew. Chem. Int. Engl. Ed., 1993, v. 32. p. 557-559.

27. Mestre В., Pratviel G., Meunier B. Bioconjugate Chem., 1995, v. 6, p. 466-472.

28. Bernadou J., Fabiano A. S., Robert A., Meunier B. J. Am. Chem. Soc., 1994, v. 116, p. 9375-9376.

29. Hamilton G.A., Giacin J.R., Hellman T.M. e. a. Ann. N. Y. Acad. Sei., 1973, v. 212, p. 4-12.

30. Estabrook R.W., Hildebrandt A.G., Baron J. e. a. Biochem. Biophys. Res. Commun., 1971, v. 42, p. 132-139.

31 .Murugesan N., Hecht S. M. J. Am. Chem. Soc., 1985, v. 107, p. 493-500.

32. Bigey P., Sonnichsen S.H., Meunier В., Nielsen P.E. Bioconjugate Chem., 1997, v. 8, p. 267-270.

33. Mestre В., Jakobs A., Pratviel G., Meunier B. Biochemistry, 1996, v. 35, p. 9140-9149.

34. Беликов В.M., Крынецкая Н.Ф., Волков E.M. и др. Биоорган, химия, 1995, т. 21, с. 446-453.

35. Magda D., Crofts S., Lin A. e. a. J. Am. Chem. Soc., 1997, v. 119, p. 2293-2294.

36. Magda D., Wright M., Crofts S. e. a. Ibid., 1997, v. 119, p. 6947-6948.

37. Коваль В.В., Черноносов A.A., Абрамова T.B. и др. Биоорган, химия, 2000, т. 26, с. 118-125.