CC BY
7УДК 66.085.3/.5 DOI 10.33632/1998-698Х.2021-5-24-30
КОНЦЕНТРИРОВАНИЕ СИБИРЕЯЗВЕННОГО БЕЛКОВОГО АГЕНТА НА УСТАНОВКЕ УЛЬТРАФИЛЬТРАЦИИ В ТАНГЕНЦИАЛЬНОМ ПОТОКЕ
И. С. Литау - аспирант, Д. А. Девришов - член-корреспондент РАН, доктор биологических наук,
Московская государственная академия Ветеринарной Медицины и биотехнологий -МВА имени К. И. Скрябина, Москва, Российская Федерация E-mail: 11 litau 11@mail.ru
Исследования направлены на создание принципиально новой технологии и процессов разделения, очистки и концентрирования жидких систем в биотехнологическом производстве методами фильтрования и ультрафильтрования, включая применение новых материалов. Цель исследования - отработка метода приготовления концентрированного белкового субстрата вакцинного штамма Bacillus anthracis 55-ВНИИВВиМ на ультрафильтрационной установке АСФ-020.
В ходе эксперимента была получена белковая субстанция B.anthracis со следующими показателями: температура на выходе не превышала 25оС, рН - 6,9, концентрация белка 0,7мг/мл.
Предложена принципиальная технологическая схема ультраконцентрирования, позволяющая получать белковые субстанции, удовлетворяющие по качеству требования нормативной документации.
Ключевые слова: ультрафильтрация, концентрирование, B.anthracis.
Введение. Существование на территории России множества эндемических районов различных инфекционных заболеваний создает реальную угрозу возникновения эпизоотических очагов заболеваний среди сельскохозяйственных животных и населения в природных очагах и в этой связи одной из глобальных задач ветеринарных инфек-тологов, является защита продуктивных животных и продукции животноводства от инфицирования опасными биологическими патогенами.
Широко распространенным опасным зоонозами являются сибирская язва и бруцеллез с их способностью сохраняться в биологических объектах формируя природные очаги. Особенностью возбудителя сибирской язвы является способность к споруляции, позволяющая Bacillus anthracis десятилетиями сохраняться в различных экосистемах и окружающей среде, до тех пор, пока не появится возможность внедриться в восприимчивый организм [12, 13].
Важнейшим условием подъёма животноводства и обеспечения населения продуктами питания является защита сельскохозяйственных животных от различных инфекционных заболеваний в процессе их воспроиз-
водства. На сегодняшний день наиболее эффективными средствами борьбы с инфекционными заболеваниями людей и животных является специфическая профилактика, а наибольшее значение имеет иммунопрофилактика [1].
Производство ветеринарных биопрепаратов связано со сложными технологическими процессами, в которых участвуют жидкие системы со специфическими требованиями. В каждом технологическом процессе необходимо применять соответствующие операции по разделению, очистке, концентрированию биожидкостей методами сепарирования, центрифугирования, фильтрования, ультрафильтрования или комбинированными методами. От правильно выбранного метода в большинстве случаев зависят качество и стоимость конечного продукта. В технологии производства противобактерийных и противовирусных препаратов и гипериммунных лечебных сывороток данные операции являются трудоемкими и несовершенными по техническому обеспечению[2,7,8].
Поэтому исследования направлены на создание принципиально новой технологии и процессов разделения, очистки и концентрирования жидких систем в биотехнологическом
производстве методами фильтрования и ультрафильтрования, включая применение новых материалов [15,16].
Материалы и методы. Исследование было проведено на базе биотехнологического комплекса ООО «Агровет» и на кафедре иммунологии и биотехнологии ФГБОУ ВО «Московская государственная академия ветеринарной медицины и биотехнологии -МВА имени К.И. Скрябина». В работе использовался производственный штаммы B^thracis 55-ВНИИВВиМ. Для глубинного культивирования использовалась питательная среда на основе гидролизата казеина и дрожжевого экстракта, приготовленную по регламенту производства живой сибиреязвенной вакцины; 50%-ный раствор глюкозы с витаминами; для контроля бактериологической чистоты МПБ, МПА. Сырье, реактивы и материалы подвергались входному контролю и после подтверждения их свойств требованиям действующих на предприятии нормативных документов использовались в работе.
Нативные культуры получали в лабораторных ферментерах Sysbiotech объемом 10 л (Франция) и в биореакторах БИОР-0,25 м3, оснащенных перемешивающим устройством магнитного типа. В процессе глубинного культивирования контролировались и регулировались основные физико-химические параметры - температура культивирования, отсутствие роста посторонней микрофлоры, pH, расход воздуха, скорость вращения перемешивающего устройства, давление и вакуум.
Для концентрирования нативных культур вакцинного штамма В.аПЬгаод 55-ВНИИВВиМ использовали установки микро- и ультрафильтрации АСФ-020, мембранные модули "Ультрасарт" на основе поли-сульфона с диаметром пор 300 кДа.
Для изучения свойств микробных суспензий применяли регламентные методы оценки качества, указанные в ГОСТ Р 52616-2006. «Вакцина против сибирской язвы животных из штамма 55-ВНИИВВиМ живая. Технические условия» по следующим показателям:
3
- оптическую концентрацию в 1 см нативной культуры (метод, основанный на визуальном сравнении мутности исследуемой взвеси со стандартным образцом мутности);
- содержание жизнеспособных спор в 1 см3 концентрированной микробной суспензии (методом высева на плотную питательную среду);
- рН (потенциометрическим методом);
- наличие посторонней микрофлоры (микроскопией мазков и методом выращивания на плотной питательной среде);
- определение концентрации белка (определение методом Брэдфорда);
Результаты исследований. Концентрирование вакцинных антигенов, является одним из важных технологических процессом, позволяющим формировать серию вакцины с необходимым дозировкой в готовой форме. Известны и широко используются концентрирование методом седиментации (процесс длительный по времени с большой потерей (более 30% микробных клеток), концентрирование натриевой солью карбоксиметил-целлюлозы (КМЦ), которую вносят в суспензию до концентрации 0,2 - 0,3%, а отстаивание осуществляют при температуре 0 - 250С в течение 23 - 25 ч [2, 4, 11, 15], недостатком которого является, наличие в готовом препарате КМЦ.
Культивирование вакцинного штамма 55-ВНИИВВиМ осуществляют в жидкой спо-руляционно-ростовой среде, на основе гид-ролизата казеина, дрожжевого экстракта и солей: калий фосфорнокислый двузамещен-ный, кальций хлористый, цинк сернокислый, медь сернокислый, железо сернокислый, аммоний сернокислый и вода (рН 7,2±0,2). Культивирование штамма осуществлялось в реакторе в течение 20 - 25 ч, из них первые 17 - 19 ч при аэрации, поддерживая скорость растворения кислорода в среде 5,5±0,2 ммоль на 1 л среды в час.
В процессе выполнения экспери-ме нтальной работы были отработаны методы стерилизации микро- и ультрафильтрационного оборудования. Зафиксированные режимы стерилизации на всем протяжении дальнейших исследований позволяют получить культу-ральную жидкость (КЖ) свободную от бактериальных клеток и спор и концентрированную суспензию спор микробных клеток. Подготовленное ультрафильтрационное оборудование (стерилизованное) было применено для окончательного разделения белкового субстрата от компонентов среды выращивания. Полученная белковая субстанция использовалась для дальнейшего фракционирования в биохимической лаборатории [6].
По окончанию эксперимента были рассчитаны биохимические показатели белкового агента, а также рассмотрено его соответствие с требованиями нормативных документов. Все 1В ОТ ПРОФЕССИОНАЛОВ
данные, полученные в исследовании, обработаны биометрически, определены параметры достоверности результатов исследований.
Концентрирование проводили на ультрафильтрационной установке в соответствии с режимами, необходимыми для получения белкового субстрата, полученного при культивировании вакцинного штамма В.айЫ^ 55-ВНИИВВиМ.
Режимы ультрафильтрации (концентрирования) белковой суспензии при-
Белковый субстрат концентрируется в 8-14 раз с высоким уровнем содержания белка и низкой потерей. Полученные результаты свидетельствуют о том, что ультраконцентрированная белковая субстанция, по основным биологическим и физико-химическим показателям соответствует требованиям нормативной документации (НД) (таблице 4).
Таким образом, предложенная технологическая схема ультраконцентрирования позволяет получать белковые субстанции, удовлетворяющие требованиям нормативной документации.
ведены в таблице 1.
Необходимо отметить, что снижение давления на линии входа в фильтрующий модуль приводило к значительному увеличению продолжительности процесса, а увеличение значения давления усиливало гидродинамическую нагрузку на коммуникации (соединительные шланги) [2]. В результате были получены концентрированные споровые культуры, основные характеристики которых представлены в таблице 2.
На заключительном этапе были изучены биологические и физико-химические свойства белкового субстрата, полученного на ультрафильтрационной установке (представлены в таблице 3). Из полученных данных, можно сделать вывод, что концентрированная белковая суспензия отвечает всем требованиям НД и может быть применена для дальнейших испытаний и приготовления вакцины против сибирской язвы.
Заключение. Применение метода ультрафильтрации по отработанным режимам позволило получить белковую субстанцию,
Таблица 1 - Технологические параметры ультрафильтрации белковой суспензии
Наименование параметра Единица измерения Значение параметра
Производительность фильтрации Дм3-ч-1 14,0±2,0
Площадь фильтрующей поверхности см2 не менее 18-103
Количество мембранных модулей шт. не менее 5
Размер пор фильтрующего материала кДа 300
Давление: - на входе фильтрующего модуля - на выходе фильтрующего модуля МПа 0,15-0,2 0,01-0,05
Кратность концентрирования (по объему) разы 5-6
Температура процесса °С 18-25
Таблица 2 - Характеристики белкового субстрата, полученного на ультрафильтрационнойустановке «АСФ-020»
Наименование показателя Единица измерения Требования НД Значения показателя
Степень концентрирования по объему разы не нормируется 5-6
Степень концентрирования по биологической концентрации разы не нормируется 8-14
Реакция среды ед. рН 6,8-7,2 6,9±0,1
Наличие ПМФ клетки не допускается не содержат
Концентрация белка кДа 150-300 280
соответствующую требованиям инструкции по ПМФ не обнаружено, рН - 6,9, концентрация
изготовлению со следующими показателями: белка равна 0,7 мг/мл, молекулярная масса
температура на выходе не превышала 25оС, частиц 280кДа.
Таблица 3 - Показатели качества белкового субстрата, полученного методом ультрафильтрации
на установке АСФ-020 из среды культивирования штамма В.аnthracis 55-ВНИИВВи М
Наименование показателя Единица измерения Требования НД Значения показателя
Концентрация белка мг/мл 0,6±0,2 0,7
Степень концентрирования по объему разы не нормируется 8-14
Степень концентрирования по биологической концентрации разы не нормируется 6-8
Молекулярная масса кДа 300 280
Реакция среды ед. pH 6,8-7,2 6,9±0,1
Наличие ПМФ клетки не допускается не содержат
Температура оС < 25 23±2
Плотность г/л не нормируется 1,4
Литература
1. Агафонов, А.П.Способ получения концентратов вирусов, вызывающих геморрагические лихорадки и обладающих иммуногенной и протективной активностью /А.П. Агафонов, М.А. Стрельцова, Г.М. Игнатьев,А.В. Твердохлебов, А.А. Чепурнов, С.А. Калиберов, В.А. Кузьмин, Н.Б. Черный. - Патент 2029561 РФ, опубл.27.02.1995. - Бюл. № 6.
2. Бирюков, В.В. Основы промышленной биотехнологии / В.В. Бирюков. - М.: Колос С. -2004.- 296 с.
3. Борковски, А. Множественная вакцинация, включающая менингококки серогруппы С /А. Борковски. - Патент 2457858 РФ, опубл.10.08.2012. - Бюл. № 22.
4. Брахт, К. Фильтрация кросс-флоу/ К. Брахт, Е.Е. Каталевский, С.П. Савельева// Фармацевтические технологии и упаковка - 2009. - С. 47-51.
5. Брок, Т. Мембранная фильтрация / Т. Брок Т. - . М.: Мир; 1987, 462 с.
6. Бывалов, А.А. Антигенный состав чумной химической вакцины/А.А. Бывалов,
B.И. Евстигнеев, И.В. Дармов, Е.В. Пименов. - Патент2190424 РФ, опубл. 10.10.2002. - Бюл. № 28.
7. Бывалов, А.А. Идентификация и выделение антигена, защищающего морских свинок от экспериментальной чумы / А.А. Бывалов, В.И. Евстигнеев, И.В. Дармов, Е.В. Пименов // Проблемы особо опасныхинф. - 2005. - 1(89) - С. 54-8.
8. Генералов, С.В. Опыт получения кроличьего антирабического иммуноглобулинас применением культурального антигена / С.В. Генералов, Е.Г. Абрамова, Ж.В. Матвеева, И.М. Жулидов, А.К. Никифоров, О.А. Лобовикова, Л.В. Савицкая, Л.Н. Минаева, М.В. Галкина, Т.А. Михеева, А.В. Комиссаров, М.Н. Киреев //Пробл. особо опасныхинф. - 2012. - 2 (112). -
C.78-81.
9. Громова, О.В. Новый способ получения О-антигена холерного очищенного с целью создания холерных диагностических препаратов / О.В. Громова, М.Н. Джапаридзе, И.А. Дятлов, М.Н. Кирееев, В.А. Федорова, Т.В. Аленкина, Е.Г. Абрамова // Биотехнология. - 2002. - 2. - С. 42-6.
10. Громова О.В.. Оптимизация процесса производства холерной химической таблетированной вакцины с помощью технологии ультрафильтрации. Пробл. особо опасных инф./ Нижегородцев С.А., Дятлов И.А., Кутырев В.В. - 2011. - 109. - С.71-4.
11. Гаврилов В.А. Числов Ю.В. Николайчук Л.Ф. Способ изготовления вакцины против сибирской язвы животных. Патент (авторское свидетельство), 1837071.
12. Родионов А.П. Анализ эпизоотической ситуации по зооантропонозным болезням в Приволжском федеральном округе за период с 2015 по 2019 годы / Родионов А.П., Артемьева Е.А.,
Мельникова Л.А. //Вопросы нормативно-правового регулирования в ветеринарии. - 2021. - № 1. -С.34-37.
13. Родионов А.П., Артемьева Е.А., Мельникова Л.А., Иванова С.В. "Особенности природной очаговости сибирской язвы и экологии Bacillus anthraus" / Родионов А.П., Артемьева Е.А., Мельникова Л.А., Иванова С.В. //Ветеринария сегодня. - 2021. - №2. - С.151-158
14. Jang H., Hyo S.K., Jeong A.K. Improved Purification Process for Cholera Toxin and its Application to the Quantification of Residual Toxin in Cholera Vaccines. J. Microbiol. Biotechnol. 2009; 19(1): 108-12.
15.Takagi M., Barbosa R. Purification of capsular polysaccharide produced by Haemophilus influenzae type b through a simple, efficient and suitable method for scale-up. Appl. Microbiol. Biotechnol.2008; 35:1217-22.
16. Zydney A.L., Kuriyel R. Protein concentration and buffer exchange using ultrafiltration. Methods in Biotechnology.2000;9:35-46.
CONCENTRATION OF THE SIBERIAN PROTEIN AGENT IN A TANGENTIAL FLOW
ULTRAFILTRATION UNIT
I.S. Litau- graduate student, D. A. Devrishov - corresponding member of the Russian Academy
of Sciences, Doctor of Biological Sciences
Moscow State Academy Veterinary Medicine and Biotechnology -MVA named after K. I. Scriabin, Moscow, Russian Federation E-mail: 11litau11@mail.ru
Research is aimed at creating innovative technology and processes for separation, cleaning and concentrating liquid systems in biotechnological production by means of filtering and ultrafiltering, including the use of new materials. The aim of the study is to develop a method of preparation of concentrated protein substrate Bacillus anthracis 55-INVIViM vaccine strain on the ultra-filtration plant ASF-020.
During the experiment, the protein substance B.anthracis was obtained with the following indicators: the output temperature did not exceed 25oC, pH 6.9, protein concentration 0.7 mg/ml.
The principle technology scheme of ultra-concentric concentration, which allows receiving protein substances, satisfying the quality requirements of normative documentation, is offered.
Keywords: ultrafiltering, concentration, V.anthracis
References
1. Agafonov, A.P. Sposob of receiving the concentrates of the viruses causing hemorrhagic fevers and having immunogene and protective activity / A.P. Agafonov, M.A. Streltsova, G.M. Ignatyev, A.V. Tverdokhlebov, A.A. Chepurnov, S.A. Kaliberov, V.A. Kuzmin, N.B. Cherny. - Patent 2029561 of the Russian Federation, opubl.27.02.1995. - Bulletin No. 6.
2. Unsociable persons, V.V. Bases of industrial biotechnology / V.V. Biryukov. -M.: Colossus; 2004, 296 pages.
3. Borkovski, And. The multiple vaccination including meningokokk of a serogruppa of R/a. Borkovski. - Patent 2457858 of the Russian Federation, opubl.10.08.2012. - Bulletin No. 22.
4. EpaxT, To. Filtration cross-$.noy/K. Brakht, E.E. Katalevsky, S.P. Savelyeva//Pharm-aceutical technologies and packing, 2009. - Page 47-51.
5. Brock, T. Membrane filtration/T. Brock T. -. M.: World; 1987, 462 pages.
6. Byvalov, A.A. Anti-gene composition of plague chemical vaccine / A.A. Byvalov, V.I. Yevstigneyev, I.V. Darmov, E.V. Pimenov. - Patent2190424 Russian Federation, publ.10.10.2002. - Bulletin No. 28.
7. Byvalov, A.A. Identification and release of the antigen protecting guinea pigs from experimental plague / A.A. Byvalov, V.I. Yevstigneyev, I.V. Darmov, E.V. Pimenov // Problems especially dangerous Inf., 2005; 1(89): 54-8.
8. Generals, S.V. Experience of receiving rabbit antirabichesky HMMyHorao6y.nHHac use of cultural antigen / S.V. Generalov, E.G. Abramova, Zh.V. Matveeva, I.M. Zhulidov, A.K. Nikiforov, O.A. Lobovikova, L.V. Savitskaya, L.N. Minayeva, M.V. Galkina, T.A. Mikheyeva, A.V. Komissarov, M.N. Kireev//Probl. especially onacHbixuH^., 2012; 2(112): 78-81.
9. Gromova, O.V. A new way of receiving O-antigen cholera cleaned for the purpose of creation of cholera diagnostic medicines / O.V. Gromova, M.N. Dzhaparidze, I.A. Dyatlov, M.N. Kireeev, V.A. Fedorova, T V. Alenkina, E.G. Abramova//Biotechnology, 2002; 2:42-6.
10. Gromova O.V. Optimization of the production process of cholera chemical tableted vaccine using ultrafiltration technology. Probl. especially dangerous inf ./Nizhny Novgorod S.A., Dyatlov I.A., Kutyrev V.V. 2011; 109:71-4..
11. Gavrilov V.A. Chislov Yu.V. Nikolaychuk L.F. Sposob of production of vaccine against anthrax of animals. Patent (copyright certificate), 1837071.
12. A.P. Rodionov. The analysis of an epizootic situation by zooantroponozny diseases in the Volga Federal District from 2015 for 2019 A.P. Years / Rodionov, E.A. Artemyeva, L.A. Melnikova.//Questions of legal regulation in veterinary science. - 2021. - No. 1. - P. 34-37.
13. A.P. Rodionov, E.A. Artemyeva, L.A. Melnikova, S.V. Ivanova. "Features of a natural ochagovost of anthrax and ecology of Bacillus anthraus" / A.P. Rodionov, E.A. Artemyeva, L.A. Melnikova, S.V. Ivanova//Veterinary science today. - 2021. - No. 2. - P. 151-158
14. Jang H., Hyo S.K., Jeong A.K. Improved Purification Process for Cholera Toxin and its Application to the Quantification of Residual Toxin in Cholera Vaccines. J. Microbiol. Biotechnol. 2009; 19(1):108-12.
15.Takagi M., Barbosa R. Purification of capsular polysaccharide produced by Haemophilus influenzae type b through a simple, efficient and suitable method for scale-up. Appl. Microbiol. Biotechnol.2008; 35:1217-22.
16. Zydney A.L., Kuriyel R. Protein concentration and buffer exchange using ultrafiltration. Methods in Biotechnology.2000;9:35-46.
