CC BY
28
ОРИГИНАЛЬНАЯ СТАТЬЯ
Концентрация кальция и фосфора и их производных у черепах, содержащихся в неволе (виды рода Testudo)
Цели: оценить соотношение между концентрациями общего и ионизированного кальция и фосфора у клинически здоровых черепах.
Методы: в рамках проверки здоровья популяции у 25 черепах забирали кровь из яремной вены. Виды включали черепах Германа, Testudo her-manni boettgeri, шпоровых черепах, Testudo graeca ibera, окаймленных черепах, Testudo marginata, и среднеазиатских черепах, Testudo horsfiel-di. Образцы плазмы от этих черепах исследовали на содержание общего кальция, ионизированного кальция и фосфора. Образцы отбирали сразу после спячки, до начала репродуктивной активности.
Результаты: у самок концентрация фосфора была статистически выше. Концентрации ионизированного и общего кальция у самок были выше по сравнению с самцами, однако отличие не было статистически значимым. У самок выявлены статистически более высокие коэффициенты растворимости и более низкие соотношения по сравнению с самцами.
Клиническая значимость: благодаря этому исследованию были получены данные о соотношениях и коэффициентах растворимости у черепах, которые могут улучшить понимание значения этих параметров у рептилий в дальнейшем.
K. Eatwell
Journal of Small Animal Practice (2010) 51, 472-475
DOI: 10.1111/j.1748-5827.2010.00963.x
Accepted: 14 April 2010; Published online: 12 July 2010
Division of Veterinary Clinical Sciences, Royal (Dick) School of Veterinary Science, Hospital for Small Animals, Easter Bush Veterinary Centre, Roslin, Midlothian EH25 9RG
ВВЕДЕНИЕ
В литературе очень мало данных о пределах нормы общего кальция, ионизированного кальция и фосфора у черепах. Их установление связано со многими сложностями, обусловленными влиянием рациона, пола, температуры и половой активности in vivo, а также влиянию рН, связывания гепарина, температуры хранения и анализа in vitro [9-11, 18]. Разные лаборатории используют разные пределы нормы, таким образом, определение снижения
или повышения показателей находится под вопросом. Содержание общего кальция в сыворотке не регулируется и является суммой кальция, связанного с белками, кальция в форме комплексных соединений и свободных ионов. Содержание ионизированного кальция в сыворотке регулируется, таким образом, его все чаще определяют при ветеринарном осмотре рептилий [11].
Общепризнано, что при исследовании рептилий необходимо определять соотношение общего кальция и фосфора. У зеленых игуан это
соотношение должно быть больше 0,77, а падение ниже этого предела обычно считается показателем почечного заболевания [7, 8, 18]. Нормальное соотношение у здоровых черепах большей частью неизвестно, однако среднее соотношение, определенное в маленькой группе средиземноморских черепах, составило 3,43 [18]. По данным другого исследования, среднее соотношение у самок было 3,12, а у самцов 3,54 [15]. Соотношение менее 0,77 необычно для черепах, однако описано соотношение 0,55 у черепахи с гиперфосфатемией и метастатическим обызвествлением [12, 18]. Это частично может быть обусловлено повышением общего кальция, встречающегося у черепах [11, 18].
Коэффициент растворимости вычисляется как произведение концентраций общего кальция и фосфора. Он является показателем риска обызвествления мягких тканей. У здоровых зеленых игуан он обычно меньше 9,0, при значении 12,0 возможно обызвествление пораженной ткани (дистрофическая каль-цификация), а значение выше 12,0 связано с высоким риском метастатического обызвествления [7, 8, 16].
Считается, что, учитывая высокую вариабельность концентрации общего кальция у черепах, эти соотношения использовать не следует [13, 15].
Целью этого исследования была оценка соотношений кальция и фосфора и коэффициента растворимости у здоровых черепах с учетом концентрации как общего, так и ионизированного кальция. Это позволит получить исходные данные для этих параметров с использованием концентрации ионизированного кальция, подлежащей физиологической регуляции; в дальнейшем
полученные результаты помогут лучше понять значение этих параметров у черепах.
Концентрации общего кальция, ионизированного кальция и фосфора определяли в образцах крови 25 черепах в рамках проверки здоровья популяции, содержащейся в неволе. Группа включала черепах Германа, Testudo hermanni boettgeri, шпоровых черепах, Testudo graeca ibera, окаймленных черепах, Testudo marginata, и среднеазиатских черепах, Testudo horsfieldi. Эти черепахи были пойманы в природе, но содержались в неволе много лет и были в репродуктивном возрасте (старше 20 лет). Каждую зиму черепахи находились в спячке, и сразу после пробуждения им обеспечивали подогрев (температура 35 °C) до тех пор, пока погода не становилась достаточно теплой для нахождения снаружи (более 20 °C). Все животные успешно перенесли трехмесячную спячку. Они не получали искусственного освещения, но находились под солнечными лучами [Южная Англия - Чиппенхем, долгота 51:30:21 N (51 5059)] ежедневно в наружных загонах. Их рацион включал белокочанную и цветную капусту, салат, зелень, латук, цикорий, кресс-салат, томаты, огурцы, дыню, клубнику, листья одуванчика и листья осота. Этот рацион дополняли карбонатом кальция (при каждом кормлении). Среднее соотношение кальция и фосфора в рационе по данным анализа было 7,4:1. Содержание кальция было 2,4 % на сухой вес. Рацион содержал 20,7 % белка, 5,2 % жира и 45,6 % сырой клетчатки на сухой вес. Результаты получали с помощью компьютерной программы для анализа кормов «Zootrition» (версия 2, общество по сохранению дикой природы, Бронкс, Нью-Йорк, США). Следует отметить, что точное содержание питательных веществ в рационе может варьировать в зависимости от условий выращивания. Прямого анализа диеты для подтверждения этих результатов не проводилось. Пище-
вые источники холекальциферола не давали. Образцы крови у этих черепах брали сразу после извлечения из емкостей в рамках плановой проверки здоровья коллекции. Всех животных осматривали клинически и исключали из исследования животных, выглядящих нездоровыми или больными. Образцы отбирали в марте, до начала половой активности (обычно с июня и далее). Всем животным делали плановый клинический и биохимический анализ крови, и всех животных с результатами, выходящими за границы нормы, указанные лабораторией, исключали из исследования.
Образцы крови (0,5 мл) брали шприцем из яремной вены и переливали в пробирки с гепарином лития (Sarsstedt Ltd, Лестер, Великобритания) с концентрацией гепарина 35 мЕд/мл. Пробирки наполняли полностью во избежание газообмена с воздухом. Образцы хранили в форме гепаринизированной цельной крови при 5 °C до анализа в течение 48 часов. Полный клинический анализ крови (с исследованием мазка) и биохимический анализ проводили после пробуждения от спячки для подтверждения того, что животные здоровы. При биохимическом исследовании определяли общий белок, альбумин, глобулин, мочевину, мочевую кислоту, глутаматдегидроги-назу, аспартатаминотрансферазу, креатининкиназу, фосфор, 25-гид-рокси витамин D, натрий, калий и ионизированный кальций. Критериям включения соответствовало 30 животных. Дальнейшей диагностики не проводилось, если в этом не было клинической необходимости, которая определялась по результатам клинического и биохимического анализов крови.
Ионизированный кальций определяли на анализаторе электролитов AVL 9181 electrolyte analyser (Diamond Diagnostics Ltd, Holliston, MA, USA). Метод основан на измерении с помощью ионоселективных электродов. Дальнейшие подробности методологии обсуждаются Ting-Kai and Piechocki (1971). Общий кальций и фосфор определяли на анализаторе для клинической биохимии
spACE (Randox Laboratories Ltd, Crumlin, County Antrim, UK). Соотношение кальция и фосфора и коэффициент растворимости вычисляли для всех данных с использованием результатов определения общего кальция и ионизированного кальция. Для каждого набора данных вычисляли среднее, СО, медиану и 95 % доверительный интервал. Данные проверяли на нормальное распределение с помощью критерия Андерсона. Анализ между образцами с нормальным распределением проводили с помощью двухвыбороч-ного t-критерия. Данные, распределение которых отличалось от нормального, анализировали далее с помощью критерия Манна - Уитни. Сравнивали данные для обоих полов в группе. Статистический анализ проводили с помощью программы «Minitab 15» (корпорация Microsoft, Microsoft Ltd, Reading, UK), за значимость принимали Р < 0,05.
РЕЗУЛЬТАТЫ
Оценка здоровья всех черепах не показала значительных признаков заболеваний. Распределение всех результатов было нормальным, за исключением общего кальция у самок (табл. 1-3). У самок обнаружена статистически большая концентрация фосфора. Сравнивали концентрации ионизированного и общего кальция у самок и самцов, однако различие не было статистически значимым. У самок обнаружены статистически большие коэффициенты растворимости по сравнению с самцами. У самцов соотношение было выше, чем у самок, и это различие было статистически значимым.
ОБСУЖДЕНИЕ
В ходе этого исследования были получены данные, позволившие лучше установить соотношение кальция и фосфора, а также коэффициенты растворимости у черепах. Эти результаты помогут клиническому врачу при интерпретации биохимических показателей для оценки обмена кальция и почечных заболеваний.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
Таблица 1. Результаты биохимического исследования
Вид Пол Ионизированный кальций (моль/л) Общий кальций (моль/л) Фосфор (моль/л) Соотношение ионизированного кальция и фосфора Соотношение общего кальция и фосфора Произведение ионизированного кальция и фосфора Произведение общего кальция и фосфора
Окаймленная самка 1,24 3,11 1,06 1,1698 2,934 1,3144 3,2966
Окаймленная самка 1,03 2,59 0,85 1,2118 3,0471 0,8755 2,2015
Германа самка 1,41 4,19 1,3 1,0846 3,2231 1,833 5,447
Германа самка 1,37 3,14 1,09 1,2569 1,2569 1,4933 3,4226
Германа самка 1,24 2,81 1,3 0,9539 2,1615 1,612 3,653
Германа самка 1,25 2,92 1,19 1,0504 2,4538 1,4875 3,4748
Германа самка 1,51 2,59 1 1,51 2,59 1,51 2,59
Германа самка 1,28 3,13 1,15 1,113 2,7217 1,472 3,5995
Германа самка 1,41 3,17 1,29 1,093 2,4574 1,8189 4,0893
Германа самка 1,32 3,22 1,27 1,0394 2,5354 1,6764 4,0894
Германа самка 1,41 4,15 1,29 1,093 3,2171 1,8189 5,3535
Шпоровая самка 1,39 3,08 1,06 1,3113 2,9057 1,4734 3,2648
Шпоровая самка 1,42 3,1 1,02 1,3922 3,0392 1,4484 3,162
Среднеазиат. самка 1,36 4,17 0,99 1,3737 4,2121 1,3464 4,1283
Германа самец 1,48 3,21 0,86 1,7209 3,7326 1,2728 2,7606
Германа самец 1,63 3,38 0,56 2,9107 6,0357 0,9128 1,8928
Германа самец 1,51 3,13 0,75 2,0133 4,1733 1,1325 2,3475
Шпоровая самец 1,09 2,86 0,99 1,101 2,8889 1,0791 2,8314
Шпоровая самец 1,24 3,05 0,77 1,6104 3,961 0,9548 2,3485
Шпоровая самец 1,32 3,23 0,75 1,76 4,3067 0,99 2,4225
Шпоровая самец 1,3 2,56 1,14 1,1404 2,2456 1,482 2,9184
Шпоровая самец 1,26 3,1 0,68 1,8529 4,5588 0,8568 2,108
Шпоровая самец 1,14 2,89 0,91 1,2527 3,1758 1,0374 2,6299
Шпоровая самец 1,28 3,07 0,97 1,3196 3,1649 1,2416 2,9779
Среднеазиат. самец 1,14 2,51 1,05 1,0857 2,3905 1,197 2,6355
Результаты, полученные при исследовании всех четырех видов черепах, объединяли для статистического анализа, что могло повлиять на представленные здесь результаты. Предыдущая работа показала некоторые вариации между видами [9-11].
Задержка забора пробы может привести к колебаниям результатов, например определения ионизированного кальция в результате метаболизма и фосфора в результате гемолиза. Итоги недавнего исследования свидетельствуют, что результат определения ионизированного кальция у черепах не изменяется при хранении в течение 48 часов [9]. Описывалось влияние гемолиза на результаты определения фосфора у зеленой игуаны (Iguana iguana) в сторону увеличения, однако в настоящем исследовании не было образцов с гемолизом [1].
Половые различия в концентрации ионизированного кальция уже
описывались ранее, однако в настоящем исследовании они не были статистически значимыми [10]. Факторы, влияющие на концентрацию ионизированного кальция в сыворотке у черепах, исследовались также в предыдущей работе [9].
Концентрация общего кальция у самок была выше, чем у самцов, однако различие не было статистически значимым в связи со временем года и малым количеством образцов. Однако хорошо известно, что у самок концентрация общего фосфора выше и на нее влияет репродуктивная активность и мобилизация кальция из костной ткани [4, 6].
Такое повышение может достигать 400 % по сравнению с нормальным уровнем [3, 6].
Полагают, что повышение концентрации общего кальция связано с повышением содержания кальция, связанного с белками, в циркулирующей крови и минимальными изменениями концентрации
ионизированного кальция. Это было недавно исследовано на видах Testudo; результаты подтвердили минимальное повышение ионизированного кальция, коррелировавшее с большим увеличением общего кальция. Однако корреляции между концентрациями общего кальция и альбумина не обнаружено [11].
Гиперфосфатемия считается отличительным признаком гиперпа-ратиреоидизма и обусловлена снижением выделения почками при продолжении поступления фосфора с рационом [14]. Однако у самок черепах возможна легкая гиперфос-фатемия в результате усиленного ремоделирования костной ткани и образования фолликулов, что может вносить вклад в различия, обнаруженные в данном исследовании [2, 4]. Прочие авторы считают гиперфосфатемию недостоверным показателем почечного заболевания [18]. Соотношение общего кальция
Таблица 2. Описательная статистика
Образец Пол Среднее СО Медиана 95 % ДИ
Ионизир. кальций (моль/л) всего (п = 25) 1,32 0,14 1,32 1,26-1,38
самцы (п = 14) 1,33 0,12 1,37 1,26-1,40
самки (п = 11) 1,31 0,17 1,28 1,19-1,42
всего (п = 25) 3,13 0,45 3,10 2,95-3,32
Общий кальций (моль/л) самцы (п = 14) 3,24 0,54 3,12 2,93-3,55
самки (п = 11) 3,00 0,27 3,07 2,81-3,18
всего (п = 25) 1,01 0,21 1,02 0,93-1,10
Фосфор (моль/л) самцы (п = 14) 1,13 0,14 1,12 1,05-1,22
самки (п = 11) 0,86 0,17 0,86 0,70-0,97
Соотношение ионизир. кальция и фосфора всего (п = 25) 1,38 0,43 1,25 1,20-1,55
самцы (п = 14) 1,19 0,16 1,14 1,10-1,28
самки (п = 11) 1,62 0,54 1,61 1,25-1,98
Соотношение общего кальция и фосфора всего (п = 25) 3,18 0,97 3,03 2,77-2,58
самцы (п = 14) 2,77 0,66 2,81 2,39-3,15
самки (п = 11) 3,69 1,09 3,73 2,96-4,43
Коэффициент раствори- всего (п = 25) 1,33 0,30 1,35 1,21-1,46
мости ионизир. кальция самцы (п = 14) 1,51 0,25 1,49 1,37-1,66
и фосфора самки (п = 11) 1,11 0,18 1,08 0,98-1,23
Коэффициент раствори- всего (п = 25) 3,19 0,91 2,98 2,81-3,56
мости общего кальция самцы (п = 14) 3,70 0,90 3,54 3,17-4,22
и фосфора самки (п = 11) 2,53 0,34 2,63 2,30-2,76
Таблица 3. Результаты, полученные с помощью двухвыборочного t-критерия
Параметр Среднее, самки Среднее, самцы Значение Т Значение Р
Ионизированный кальций 1,33 1,31 0,40 0,689
Общий кальций 3,24 3,00 1,35 0,191
Фосфор 1,13 0,86 4,34 < 0,001
Соотношение ионизированного кальция и фосфора 1,19 1,62 -2,81 0,010
Соотношение общего кальция и фосфора 2,77 3,69 -2,63 0,015
Коэффициент растворимости ионизированного Са х Р 1,51 1,11 4,53 < 0,001
Коэффициент растворимости общего Са х Р 3,70 2,53 4,05 < 0,001
Критерии Манна - Уитни для общего кальция, Р = 0,4869
и фосфора длительное время использовалось при оценке вероятности почечного заболевания [7, 8, 13].
Опубликованные ранее результаты для видов Testudo (среднее соотношение у самок 3,12, а у самцов 3,54) содержат более высокие показатели для самок и более низкие для самцов, чем в настоящем исследовании, хотя выборка была маленькой [15].
Коэффициент растворимости общего кальция и фосфора используется для оценки риска метастатического обызвествления, и некоторые авторы считают, что это самый достоверный показатель почечного заболевания [7, 8, 13]. На ткани, с наибольшей вероятностью подвергающиеся обызвествлению, а также на необходимую для этого концен-
трацию влияет ряд местных условий [5]. Сообщалось о повышенном коэффициенте растворимости (среднее 4,42) у черепах с повышенной концентрацией мочевой кислоты в крови [15]. У черепахи с задержкой яйца и метастатическим обызвествлением аорты и почек, а также ги-покальциемией коэффициент растворимости был 14,09, а соотношение общего кальция и фосфора 0,55. Первичного почечного заболевания в этом случае не выявлено [12]. В другом клиническом случае у самца бо-кошейной черепахи со значительным почечным заболеванием и множественным метастатическим обызвествлением тканей коэффициенты растворимости были 3 и 2,82, а соотношение общего кальция и фосфора 2,08 и 2,82 [16]. У черепах та-
кая вариабельность концентрации общего кальция ставит под вопрос достоверность этого параметра, и некоторые авторы полностью отрицают ее [13, 18]. Описания клинических случаев свидетельствуют о выраженной вариабельности этих параметров и прибавляют веса этому аргументу [12, 16].
Предполагалось, что измерение ионизированного кальция устранит эту вариабельность и даст более значимые результаты [13]. Однако пока опубликована только одна работа с подробным описанием определения ионизированного кальция и фосфора. В таком случае при использовании ионизированного кальция коэффициент растворимости равен 2,79, а соотношение ионизированного кальция и фосфора 0,11 [12].
В настоящем исследовании соотношение концентрации ионизированного кальция и фосфора у самцов была статистически выше, а коэффициент растворимости ионизированного кальция и фосфора ниже, чем у самок, прежде всего за счет снижения концентрации фосфора в сыворотке.
Приведенные здесь данные дают представление о показателях здоровых черепах, и их следует использовать при оценке состояния больных животных, особенно с метаболическими или почечными заболеваниями.
Благодарности
Автор благодарит RCVC за финансовую помощь и д-ра Дарнрена Шоу за статистическую обработку.
Конфликт интересов
Ни один из авторов этой статьи не состоит в финансовых или личных взаимоотношениях с другими лицами или организациями, которые могли бы снизить достоверность информации или повлиять на содержание этой работы.
Литература
1. Benson K.G., Paul-Murphy J. & Macwilliams P. The
effects of haemolysis on plasma electrolyte and
chemistry values in the common green iguana (Iguana iguana) // Proceedings of the Association of Reptilian and Amphibian Veterinarians, 1997, October 26 to 30, Houston, TX., pp 21-23.
2. Calvert I. Nutritional problems. In: BSAVA Manual of Reptiles. 2004, 2nd edn. Ed S. Girling. BSAVA, Cheltenham, pp 289-308.
3. Campbell TW. Clinical pathology of reptiles. In: Reptile Medicine and Surgery. 2006, 2nd edn. Ed D. Mader. Saunders, St Louis, MO, pp 453-470.
4. Clarke N.B. Influence of oestrogens upon serum calcium, phosphate and protein concentrations of fresh water turtles // Comparative Biochemistry and Physiology, 1967, 20, 823-834.
5. Dacke C.G. Calcium regulation in sub-mammalian veterbrates. Academic Press Incorporated, 1979 New York, NY pp 1-222.
6. Dessauer H.C. () Blood chemistry of reptiles. In: Biology of the Reptilia, 1970, vol 3. Eds C. Gans and T.C. Parsons. Academic Press, San Diego, CA, pp 1-72.
7. Divers S.J. Renal disease in the green iguana (Iguana iguana): pathogenesis, diagnosis and treatment. Diploma in zoological medicine dissertation. RCVS, 2000, London.
8. Divers S.J. Reptilian renal and reproductive disease diagnostics. In: Laboratory Medicine. Avian and Exotic Pets. 2000. Ed A.M. Fudge. W.B. Saunders Company, Philadelphia, PA, pp 217-222.
9. Eatwell K. Effects of storage and sample type on ionized calcium, sodium and potassium levels in captive tortoises, Testudo spp. // Journal of Herpeto-logical Medicine and Surgery, 2007, 17, 84-91.
10. Eatwell K. Variations in the concentration of ionised calcium in the plasma of captive tortoises (Testudo
species) // Veterinary Record, 2009, 165, 82-84.
11. Eatwell K. Comparison of total calcium, ionised calcium and albumin in captive Tortoises (Testudo species) // Veterinary Record, 2009, 165, 466-468.
12. Eatwell K. Hypocalcaemia in a Tunisian tortoise (Fur-culachelys nabeulensis) // Journal of Herpetologi-cal Medicine and Surgery, 2009, 18, 117-123.
13. Gibbons PM. Comparative vertebrate calcium metabolism and regulation. Proceedings of the Association of Reptilian and Amphibian Veterinarians, 2001, September 19 to 23, Orlando, FL, pp 267-276.
14. Klaphake E. A review of phosphorus for the reptile practitioner. Proceedings of the Association of Reptilian and Amphibian Veterinarians, 2001, September 19-23, Orlando, FL, pp 281-286.
15. McArthur S. Problem solving approach to common diseases of terrestrial and semi-aquatic chelonians. In: Medicine and Surgery of Tortoises and Turtles. 2004, Eds S. McCarthur, R. Wilkinson, J. Meyer, J.C. Innis and S. Hernandez-Divers. Blackwell Publishing, Oxford. pp 309-377.
16. Raiti P., Garner M.M. Metastatic mineralization in a Geoffrey's side-necked turtle, Phrynops geoffroanus // Journal of Herpetological Medicine and Surgery, 2006, 16, 135-139.
17. Ting-Kai L., Piechocki J.T. Determination of serum ionic calcium with an ion selective electrode: Evaluation of methodology and normal values // Clinical Chemistry, 1971, 17, 411-416.
18. Wilkinson R. () Clinical pathology. In: Medicine and Surgery of Tortoises and Turtles. 2004, Eds S. McArthur, R. Wilkinson, J. Meyer, J. C. Innis and S. Hernandez-Divers. Blackwell Publishing, Oxford, pp 141-186.
