CC BY
33
ЕР
КОНТРОЛЬ ТЕХНОЛОГИЧЕСКИХ МИКРООРГАНИЗМОВ
В ФЕРМЕНТИРОВАННОЙ ПИЩЕВОЙ ПРОДУКЦИИ
М .Ю. Минаев, канд. техн. наук, Д. С. Батаева, канд. техн. наук, К. А. Курбаков
ГНУ ВНИИМП им. В.М. Горбатова Россельхозакадемии
В данной статье описывается разработка методики идентификации про-мышленно значимых микроорганизмов при помощи анализа полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), подобраны прай-меры для родовой идентификации молочнокислых микроорганизмов. Отработаны режимы постановки реакции, и последующей рестрикции, показана целесообразность их применения.
УДК 637.524.5:579.67
Ключевые слова: контроль технологических микроорганизмов, рестракционный анализ, ПЦР, ферментированная пищевая продукция, стартовые культуры
В настоящее время в пищевой промышленности широко используются бактериальные препараты, в состав которых могут входить микроорганизмы различных родов, в том числе Lactobacillus spp., Pediococcus spp., Staphylococcus spp., Micrococcus spp..
В ГНУ ВНИИМП подготовлена окончательная редакция ГОСТ Р 55456-2013 «Колбасы сырокопченые. Технические условия». Одним из основных нововведений в нём относительно ГОСТ 16131-86 является использование в рецептурах этих колбас стартовых культур [1]. В связи с этим возникает необходимость в проведении входного контроля бактериальных препа-татов при поступлении их в производство сырокопчёных колбас с целью установления видового состава их микрофлоры и соответствия его заявленному.
Согласно ГОСТ Р 55456 - 2013 допускаются «стартовые культуры, содержащие штаммы микроорганизмов родов лактобацилл(Lactobacillus spp., педиококков (Pediococcus spp.) и микрококков (Micrococcus/Kocuria spp.)». При этом следует отметить, что в настоящее время широко распространены бактериальные препараты содержащие различные виды Staphylococcus ssp. а согласно Единым санитарно-эпидемиологическим и гигиеническим требованиям к товарам, подлежащих санитарно-эпидемиологическому надзору (контролю) при оценке бактериального препарата определяют только общее количество всей технологической микрофлоры (не менее 109- 1010 КОЕ/г), что не позволяет дать оценку родового состава препарата.
Для этих целей подходит метод полиморфизма длин рестрикционных фрагментов (ПДРФ), который при подборе праймеров с высокой разрешающей способностью позволяет обнаружить наличие микроорганизмов определённого рода в продукте без выделения чистой культуры.
Целью данной работы, являлось обоснование применения метода ПДРФ для идентификации состава мик-
роорганизмов стартовых культур и ферментированной пищевой продукции с использованием пары праймеров, специфичных для родов, используемых в мясной промышленности, подобранных на основе анализа литературных данных и экспериментальных исследований.
Для решения поставленной цели решались следующие задачи:
- на основе анализа литературных данных подобрать участок гена и произвести дизайн праймеров для исследуемых микроорганизмов;
- отработать метод ПДРФ с использованием полученных праймеров на чистых культурах микроорганизмов и пищевой продукции.
Объекты и методы исследования
Объектами исследования служили:
- штаммы целевых микроорганизмов Lactobacillus rhamnosus Lactobacillus casei, Pediococcus pentosaceus, Leuconostoc mesenteroides и Staphylococcus carnosus,;
- пищевая продукция, изготовленная с применением стартовых культур.
Анализ генома молочнокислых бактерий с выбором в нем участков, обладающих различной разрешающей способностью осуществляли при помощи международной базы данных геномов NCBI, дизайн праймеров по выбранному фрагменту ДНК - с использованием программы Primer Express, оптимизацию реакции - на основе градиента концентрации температуры плавления. ДНК выделяли набором «ДНК-сорб-АМ» компании Ин-терЛабСервис. ПЦР в реальном времени осуществляли на анализаторе АНК-32 с использованием флуоресцентного красителя EVAGreen. Рестрикцию проводили набором «HhaI» компании Thermo Scientific. Разделение продуктов амплификации и рестрикции проводили методом гель-электрофореза в электрофоретической камере «SE-1» фирмы «ХЕЛИКОН» комплектом реагентов для детекции ДНК фирмы «ДНК-технология».
18
ВСЁ 0 МЯСЕ № 1 февраль 2014
ЁР
Результаты исследований
Анализ литературных данных показал, что в настоящее время подбор праймеров осуществляется на основе гена 16S РНК [1, 2]. Авторами были подобраны праймеры, специфичные для родов молочнокислых бактерий (МКБ) и некоторых других родов микроорганизмов с использованием данного гена.
При помощи полученных праймеров была проведена реакция аплификации выделенной ДНК микроорганизмов следующих Lactobacillus, Pediococcus, Leu-conostoc, Staphylococcus, а также суммарной ДНК, выделенной из сырокопчёных колбас, выработанных с применением стартовых культур.
Затем продукт амплификации подвергли рестрик-ционному анализу. Фрагменты ДНК были разделены методом электрофореза. Результаты представлены на рис. 1 и 2.
Рис. 1 Результат электрофореза продуктов рестрикции ДНК, выделенных из микроорганизмов родов L. casei (1), L. rhamnosus (2); St carnosus (3); сырокопчёной колбасы (4); смеси продуктов аплификации L.rhamnosus и Stсamosus в соотношении 1:1 (5); маркер длин ДНК 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н. (М).
На рис. 1, 2 представлены электрофореграммы результата ПДРФ анализа ДНК, выделенных из чистых культур различных технологически значимых микроорганизмов (обозначения профилей на рисунке 1 - 1, 2, 3; на рисунке 2 - 1) и суммарной ДНК образца, выделенной из сырокопчёной колбасы (профиль 4). При сравнении профилей 2 и 3 с профилем 5 видно, что в смеси микроорганизмов, содержащих лактобациллы и
1
м
Рис. 2 Результат электрофореза продукта рестрикции ДНК, выделенной из микроорганизма рода £ рentosaceus (1); маркер длин ДНК 1500, 1000, 900, 800, 700, 600, 500, 400, 300, 200, 100 п.н. (М).
стафилококки, микроорганизмы рода Staphylococcus можно выявлять по родоспецифическому фрагменту ДНК длиной 536 п.н.
При этом метод может быть использован как для контроля состава стартовых культур, так и в случае проведения прямой полимеразно-цепной реакции (ПЦР) суммарной ДНК, выделенной из продукции, выработанной с внесением стартовых культур, когда количество технологической микрофлоры с характерным профилем значительно выше количества индигенной микрофлоры. Это хорошо просматривается на рис. 1, где профиль 4, полученный при электрофорезе продукта рестрикции сиквенсов ДНК, выделенной из сырокопченой колбасы совпал с профилем 3 монокультуры Staphylococcuscarnosus.
Выводы
На основе анализа гена 16S РНК подобрана пара праймеров, при помощи которых возможно методом ПДРФ подтверждение наличия родов микроорганизмов, используемых в пищевой промышленности и их дифференциации друг от друга.
Особенностью данного подхода является то, что задействованы не множество пар родоспецифичных прай-меров, а одна, охватывающая широкую группу родов, основная часть которых используется для подбора видов и штаммов для пищевой промышленности. В течение анализа будут выявлены все рода технологических культур, входящие в препарат или готовую продукцию.
Показано, что данный метод позволяет выявить ро-доспецифичные фрагменты определенной длины и, дифференцировать друг от друга рода Lactobacillus, Pe-diococcus, Leuconostoc, Staphylococcus, и таким образом, возможно подтверждать родовое соответствие микроорганизмов бактериальных препаратов заявленному составу и соответствие микроорганизмов стартовой культуры тем родам, которые допускаются к использованию, в частности, для сырокопченых колбас, изготавливаемых по ГОСТ Р 55456-2013. —I
Контакты:
Михаил Юрьевич Минаев Дагмара Султановна Батаева Константин Андреевич Курбаков +7 (495) 676-6011.
Литература
1. Точилина А.Г. Биохимическая и молекулярно-генетическая идентификация бактерий рода Lactobacillus // Автореферат диссертации на соискание учёной степени кандидата биологических наук, Нижний Новгород, 2009, 23 с.;
2. Giovanna E. Felis and Franco Dellaglio Taxonomy of Lactobacilli and Bifidobacteria // Curr. Issues Intestinal Microbiol. 8: 44-61
3. ГОСТ Р 55456-2013 «Колбасы сырокопченые. Технические условия».
№ 1 февраль 2014 Всё 0 МЯСЕ
19
