CC BY
21
ORIGINAL REsEARcH
© БЛОХИНА Е.А., РАВИН Н.В., 2018 УДК 578.832.1:578.1].083.2
Блохина Е.А., Равин Н.В.
конструирование мозаичных hbc-частиц, несущих консервативные участки м2-белка и гемагглютинина вируса гриппа а
Институт биоинженерии ФГУ «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, 119071, г. Москва
Вирусоподобные НВс-частицы, образуемые в результате самосборки ядерного антигена вируса гепатита В, могут быть использованы в качестве высокоиммуногенного носителя для презентации чужеродных эпитопов при создании рекомбинантных вакцин. Мы используем этот носитель для разработки противогриппозных вакцин, основанных на консервативных антигенах вируса гриппа, - внеклеточном домене трансмембранного белка М2 (М2е) и фрагменте второй субъединицы гемагглютинина (HA2). Представление на поверхности НВс-частиц должно повысить иммуногенность этих пептидов. С использованием методов генетической инженерии мы получили гибридный белок, в котором последовательность НА2 присоединена на N-конец НВс-антигена, а М2е-пептид включён в район иммунодоми-нантной петли, экспонируемой на поверхности НВс- частиц. Гибридный белок, выделенный из штамма-продуцента Escherichia coli в денатурирующих условиях, образовывал вирусоподобные НВс-частицы после рефолдинга in vitro. Рефолдинг этого белка в присутствии предварительно денатурированного НВс-антигена, не содержащего чужеродных вставок, позволил получить мозаичные вирусоподобные частицы. Разработанный нами метод позволит создавать мозаичные нВс-частицы, несущие различные целевые эпитопы вируса гриппа за счёт комбинации соответствующих модифицированных НВс-белков, что открывает возможность создания противогриппознах вакцин с более широким спектром защиты.
Ключевые слова: вирусоподобная частица; HBc-антиген; грипп; рекомбинантная вакцина; М2-белок; гемаг-глютинин.
Для цитирования: Блохина Е.А. Равин Н.В. Конструирование мозаичных HBc-частиц, несущих консервативные участки М2-белка и гемагглютинина вируса гриппа А. Вопросы вирусологии. 2018; 63(3): 130-135. DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-3-130-135
Blokhina E.A., Ravin N.V.
CONSTRUCTION OF MOSAIC HBc PARTICLES PRESENTING CONSERVATIVE FRAGMENTS OF M2 PROTEIN AND HEMAGGLUTININ OF INFLUENZA A VIRUS
Federal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology», Moscow, 119071, Russian Federation
Virus-like HBc particles formed as a result of the self-assembly of the nuclear antigen of the hepatitis B virus can be used as a highly immunogenic carrier for the presentation of foreign epitopes when creating recombinant vaccines. We use this vehicle to create influenza vaccines based on the conservative antigens of the influenza virus, the extracellular domain of the transmembrane protein M2 (M2e) and the fragment of the second subunit of hemagglutinin (HA2). Presentation on the surface of HBc particles should improve the immunogenicity of these peptides. Using genetic engineering techniques, we obtained a fusion protein in which the HA2 sequence is attached to the N-terminus of the HBc antigen, and the M2e peptide is included in the immunodominant loop region exposed on the surface of HBc particle. The hybrid protein expressed in Escherichia coli and purified under denaturing conditions formed virus-like HBc particles after refolding in vitro. Refolding of this protein in the presence of a previously denatured HBc antigen carrying no inserts resulted in formation of mosaic virus-like particles. The developed method will allow construction of mosaic HBc particles carrying different target epitopes of the influenza virus by combining the corresponding modified HBc proteins, which opens the possibility of creating vaccines with a wider spectrum of protection.
Keywords: virus-like particle; HBc antigen; influenza; recombinant vaccine; M2 protein; hemagglutinin. For citation: Blokhina E.A., Ravin N.V. Construction of mosaic HBc particles presenting conservative fragments of M2 protein and hemagglutinin of influenza A virus. Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2018; 63(3): 130-135. (In Russ.).
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-3-130-135
For correspondence: Elena A. Blokhina, PhD, research scientist of the Federal Research Centre «Fundamentals of Biotechnology», Moscow, 119071, Russian Federation. E-mail: Blohina-lena87@mail.ru Information about authors:
Blokhina E.A., https://orcid.org/0000-0002-6038-3715 Ravin N.V., http://orcid.org/ 0000-0002-1456-1832
Acknowledgment. The study was supported by the Russian Foundation for Basic Research (Project No. 16-34-00976). Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 20 November 2017 Accepted 12 December 2017
Для корреспонденции: Блохина Елена Александровна, канд. биол. наук, научный сотрудник, Институт биоинженерии ФГУ «Федеральный исследовательский центр «Фундаментальные основы биотехнологии» РАН, 119071, г. Москва. E-mail: Blohina-lena87@mail.ru
оригинальные исследования
Введение
Рекомбинантные вирусоподобные частицы (ВПЧ), образующиеся в результате самосборки капсидных белков вирусов, могут быть использованы в качестве носителей чужеродных антигенов для разработки вакцин и диагностических средств. К числу наиболее широко используемых относятся ВПЧ, образуемые ядерным антигеном вируса гепатита В (НВс-частицы), поскольку они обладают высокой иммуно-генностью, стабильностью, могут быть получены в различных системах гетерологичной экспрессии и модифицированы методами генетической и белковой инженерии [1, 2].
НВс-частицы существуют в двух формах, состоящих из 180 или 240 копий субъединиц, которые в форме димеров собираются в симметричные икосаэдрические структуры, диаметр которых составляет 30 или 34 нм [3]. Вставки чужеродных пептидов могут быть осуществлены на генетическом уровне на N- или С-концы НВс-антигена либо между аминокислотами Asp78 и Pro79 в район выступающей на поверхности НВс-частицы «иммунодоминантной» петли [4, 5]. Включения в этот участок наиболее перспективны для создания вакцин, поскольку иммунный ответ при вакцинации такими рекомбинантными НВс-частицами будет направлен в основном против включённого эпитопа [2]. В район иммунодоминантной петли без нарушения сборки ВПЧ могут быть включены достаточно большие пептиды. Так, включение в этот район последовательности зелёного флуоресцентного белка (238 аминокислотных остатков -а.о.) не нарушало не только формирование ВПЧ, но и его способность флуоресцировать [6]. Однако структура включённого пептида должна соответствовать конформации акцепторного сайта, поэтому во многих случаях включение чужеродных пептидов приводило к образованию нерастворимого продукта и/или нарушало сборку химерных НВс-частиц [7].
Одним из путей решения этой проблемы может быть разграничение последовательности НВс-антигена и вставки специальными линкерами. Для этого часто используют гидрофильные богатые глицином последовательности, обеспечивающие гибкость всей структуры рекомбинантного белка [8]. Другим способом получить НВс-частицы, несущие такие «сложные» антигены, является получение мозаичных ВПЧ в результате совместной экспрессии немодифи-цированного НВс-антигена и НВс-антигена с чужеродной вставкой [9, 10]. Такие частицы будут нести меньшее количество эпитопов на своей поверхности, но обладать большей стабильностью за счёт немодифицированных молекул НВс. Поскольку НВс-частицы могут собираться из мономеров как in vivo, так и in vitro, для регулирования доли молекул НВс-антигена со вставкой в мозаичных частицах можно использовать метод совместного рефолдинга НВс-белков со вставкой и без неё. Кроме того, рефолдинг и сборка in vitro НВс-частиц после предварительной очистки белка в денатурирующих условиях позволяют получить ВПЧ с более высокой степенью чистоты, поскольку сформированные in vivo частицы могут при сборке включать компоненты клетки-продуцента [11].
НВс-частицы могут быть использованы в качестве носителя консервативных антигенов вируса гриппа А для разработки рекомбинантных противогриппозных вакцин [12]. В отличие от традиционных сезонных противогриппозных вакцин, которых обеспечивают иммунный ответ против вариабельных поверхностных антигенов вируса, гемагглютинина и нейраминидазы, использование консервативных антигенов даёт перспективу получения «универсальной» противогриппозной вакцины, защищающей от широкого спектра штаммов вируса гриппа А [13]. Наиболее перспективным кандидатом является внеклеточный домен трансмембранного белка М2 (М2е-пептид). Этот небольшой пептид (24 а.о., включая
N-концевой метионин) отличается высокой консервативностью у штаммов вируса гриппа А человека различных субтипов [12, 14]. Однако М2е-пептид обладает низкой имму-ногенностью [15] и для индукции эффективного иммунного ответа должен быть присоединён к высокоиммуногенному адъюванту или носителю [13]. Ранее нами была показана возможность встраивания до 4 копий М2е-пептида в район иммунодоминантной петли HBc [16]. Такие ВПЧ обладали высокой иммуногенностью и обеспечивали защиту иммунизированных животных от заражения различными штаммами вируса гриппа А [17].
Однако основным антигеном вируса гриппа и наиболее важным компонентом вакцины, вызывающим (в отличие от М2е) образование вируснейтрализующих антител, является гемагглютинин. Вторая субъединица гемагглютинина (HA2) образует «стебель» молекулы гемагглютинина и менее подвержена мутационным изменениям, что позволило получить на основе соответствующего пептида препарат, обеспечивающий защиту от различных штаммов вируса гриппа [18]. Сочетание М2е- и НА2-пептидов в вакцинном препарате может обеспечить более разнообразный спектр антител у иммунизированных животных и повысить эффективность «универсальной» вакцины [19, 20].
Целью нашей работы было конструирование НВс-частиц, несущих одновременно консервативные пептиды М2е и НА2 вируса гриппа.
Материал и методы
Пептиды вируса гриппа и богатые глицином линкеры
В ходе работы были использованы последовательности М2е-пептида вируса гриппа штамма A/Chicken/ Kurgan/05/2005 (SLLTEVETPTRNEWESRSSDSSD, M2ek), а также консенсусная последовательность консервативного участка второй субъединицы гемагглютинина НА2 потенциально пандемического штамма A/H2N2 от 35 до 107 а. о. (AADKESTQKAFDGITNKVNSVIEKMNTQFEAVGKEFSN-LERRLENLNKKMEDGFLDVWTYNAELLVLMENERT [20]). Оптимизированную для экспрессии в Escherichia coli по составу кодонов нуклеотидную последовательность, кодирующую этот белок, синтезировали in vitro. В качестве богатых глицином линкеров использовали последовательности Gly19 (GTSGSSGSGSGGSGSGGGG) и Gly10 (GGGGSGGGGS). Нуклеотидная последовательность, кодирующая Gly10, была получена в виде синтетического гена.
Конструирование экспрессионных векторов
Для экспрессии белка HBc без вставок чужеродных пептидов использовали плазмиду pQE60-HBc, содержащую укороченную последовательность гена HBc, кодирующую HBc-антиген с 4 по 149 а.о., за которыми следует С-концевой цистеин [21].
Для встраивания последовательности HA2 на N-конец HBc-антигена использовали экспрессионный вектор pQE60-HBc/ M2ek [16], кодирующий белок HBc/M2ek, содержащий одну копию М2е-пептида в районе иммунодоминантной петли НВс. Последовательность М2е-пептида в этом белке фланкирована последовательностями линкера Gly19. С помощью ПЦР на 5'-конец гена HBc/M2ek ввели дополнительные рестрикционные сайты NruI и EheI, по которым в дальнейшем проводили последовательное введение синтетических последовательностей двух копий богатого глицином линкера Gly10 и НА2.
Таким образом была получена плазмида pQE60-HA2-HBc/ M2ek, содержащая ген гибридного белка HA2-HBc/M2ek, включающего последовательность HBc-антигена, слитого с пептидом НА2 на N-конце молекулы, и включающего М2е-пептид в иммунодоминантной петле. Ген HA2-HBc/M2ek вырезали из этой плазмиды и клонировали по сайтам NcoI и HindIII в вектор p-ETM-10 (EBML), в результате чего был получен экспрессионный вектор pETM-10 HA2-HBc/M2ek.
problems of virology. 2018; 63(3)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-3-130-135 ORIGINAL REsEARcH
Создание штаммов-продуцентоврекомбинантных белков, выделение целевых белков
Экспрессионные векторы pQE60-HBc и pETM-10 HA2-HBc/M2ek вводили с помощью трансформации в штаммы Escherichia coli JM109 и BL21(DE3) соответственно. Для экспрессии целевых белков штаммы-продуценты выращивали в среде LB при 37°С на шейкере до середины логарифмической фазы роста (OD600 ~ 0,5-0,7), затем вносили изопропил-ß-D-1-тиогалактопиранозид (ИПТГ) до 1 мМ и продолжали выращивать в тех же условиях в течение 12-16 ч. После индукции клетки собрали центрифугированием, ресуспендиро-вали в буфере для лизиса (15 мМ фосфатно-солевой буфер (ФСБ) рН 7,2; лизоцим 1 мкг/мл) и инкубировали в течение 40 мин при 4°С. Разрушение клеток проводили посредством 6-кратной обработки ультразвуком по 30 с с интервалом 1 мин (Diagenode Bioruptor UCD 200). Клеточный лизат центрифугировали при 13000 об/мин в течение 10 мин на центрифуге Mikro 20 («Hettich», Германия). Для очистки белка HA2-HBc/M2ek отбирали осадок, для очистки HBc-частиц использовали супернатант.
Очистку белка HA2-HBc/M2ek проводили с помощью аффинной хроматографии на Ni-сорбенте в денатурирующих условиях. Для полной денатурации белка осадок после центрифугирования клеточного лизата суспендировали в денатурирующем буфере (15 мМ ФСБ pH 7,4; 6 М мочевина; 0,5 М NaCl) и инкубировали в течение 12-16 ч при 10°С. Нерастворимую фракцию удаляли путем центрифугирования (13 000 об/мин - 10 мин). К супернатанту добавляли имидазол до 10 мМ и выполняли сорбцию на HisLink Protein Purification Resin («Promega», США). Отмывку несвязавшихся белков проводили денатурирующим буфером с содержанием 20 мМ имидаза-ла. Элюцию проводили в денатурирующих условиях (15 мМ ФСБ pH 7.4; 6 М мочевина; 0,5 М NaCl; 0,3 М имидазол).
Концентрацию белков в растворе определяли методом Бредфорда.
Очистка HBc-частиц
Очистку не содержащих вставку HBc-частиц выполняли с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности цезий хлористый - сахароза. В поликарбонатные пробирки наслаивали последовательно начиная со дна пробирки растворы: 1,5 г/л хлористого цезия - 2 мл и 1,2 г/л хлористого цезия - 3 мл; 30% (w/v) сахарозы - 3 мл, 20% (w/v) сахарозы - 3 мл. Затем наслаивали до верха пробирки 1-1,5 мл содержащего НВс-частицы лизата из штамма JM109/pQE60-HBc. Пробирки центрифугировали 22 ч при 15°С в роторе SW40 Ti на ультрацентрифуге Optima L-90K («Beckman Coulter», США) при 36 000 об/мин. После центрифугирования отбирали опалесци-рующую фракцию, содержащую HBc-частицы.
Рефолдинг белков HA2-HBc/M2ek и HBc in vitro
Для получения ВПЧ использовали препараты очищенного белка HA2-HBc/M2ek и HBc-частиц или их смеси в различных соотношениях. Концентрация белка при рефолдинге составляла 0,1 мг/мл. Для полной денатурации белков и восстановления дисульфидных связей проводили диализ против буфера, содержащего 50 мМ Tris HCl (pH 7,4), 6 М мочевину и 20 мМ ß-меркаптоэтанола (ß-МЕ), в течение 12-16 ч при 10°С. Следующий этап диализа выполняли в таком же буфере, но с концентрацией мочевины 4 М и без ß-меркаптоэтанола. На третьем этапе (этап непосредственного рефолдинга) диализ проводили против буфера, содержащего глутатионовую редокс-систему: 50 мМ Tris HCl (pH 7,4), 2 М мочевину, 0,2 мМ oxidized glutathione (#2232C108, «Amresco», США) и 2 мМ reduced glutathione (#0251C491, «Amresco», США). Далее выполняли 2 стадии рефолдирующего диализа со ступенчатым понижением концентрации мочевины до 1 М и 0,5 М. На завершающем этапе проводили диализ против буфера, содержащего только 50 мМ Tris HCl (pH 7,4).
Атомно-силовая микроскопия
Структуру ВПЧ анализировали методом атомно-силовой
уоо! N™1 Ehel Hi"0"1
HBc-N |G19lДНЯG19l HBc-C
6his
Рис. 1. Структура гена гибридного белка HA2-HBc/M2ek.
НВс-N и НВс-C - участки НВс-антигена до и после точки включения М2е в иммунодоминантную петлю; 6 his - последовательность, кодирующая N-концевой 6-гистидиновый таг.
микроскопии с использованием микроскопа ИНТЕГРА Прима (NT-MDT, Россия) в полуконтактном режиме.
Результаты
Дизайн и получение препаратов рекомбинантных белков Консервативные антигены вируса гриппа, такие как М2е-пептид и стеблевой участок гемагглютинина, могут быть основой рекомбинантных противогриппозных вакцин широкого спектра действия. Поскольку включение в состав вакцины нескольких антигенов должно повысить её эффективность, мы получили гибридный белок HA2-HBc/M2ek, в котором к N-концу молекулы НВс-антигена была присоединена последовательность консервативного фрагмента второй субъединицы гемагглютинина HA2 [20], а в район иммунодоминантной петли включен М2е-пептид (рис. 1). Для обеспечения подвижности отдельных частей молекулы HA2-HBc/M2ek между фрагментом НА2 и НВс-антигеном были введены богатые глицином линкеры общей длиной 20 а.о., а М2е-пептид был фланкирован линкерами длиной 19 а.о. Чтобы избежать неконтролируемого
2 3 4
10070 _ 553525 _
15-
б
1 2
70 55
35 25
15
Рис. 2. Получение и очистка рекомбинантного белка НА2-НВс/М2ек.
а - результаты анализа белковых препаратов с помощью SDS-PAGE: 1 -маркёр молекулярной массы (в кДа); 2 - белковый препарат из штамма-продуцента после индукции экспрессии НА2-НВс/М2ек, фракция растворимых белков клеточного лизата; 3 - то же, но фракция нерастворимых белков клеточного лизата; 4 - очищенный в денатурирующих условиях препарат рекомбинантного белка НА2-НВс/М2ек; б - вестерн-блот-анализ белковых препаратов: 1 - белковый препарат из штамма-продуцента после индукции экспрессии НА2-НВс/М2ек, фракция растворимых белков клеточного лизата; 2 - то же, но фракция нерастворимых белков клеточного лизата. Положения маркёров молекулярной массы (в кДа) указаны слева.
а
2
О 1,0 2,0 3,0 4,0 |jm
0 12 3 4 5 6 pm о 1,0 2,0 3,0 4,0 pm
Рис. 3. Анализ структуры ВПЧ с помощью атомно-силовой микроскопии. а-д - ВПЧ, полученные после рефолдинга смеси белков НВс и HA2-HBc/M2ek в соотношениях 1:0 (а), 2:1 (б), 1:1 (в), 1:2 (г), 0:1 (д); е - очищенные с помощью ультрацентрифугирования ВПЧ, образованные НВс-антигеном без вставок in vivo при экспрессии в E. coli; ж - отрицательный контроль (подложка, на которую нанесён буфер без НВс-белков). Размер объектов в отрицательном контроле не превышает 3 нм. Интенсивность пятен отражает высоту частиц над поверхностью, шкала приведена справа от рисунков (диапазоны шкалы разные на панелях а-ж).
образования дисульфидных связей и как следствие агрегации рекомбинантного белка, в последовательности М2ек-пептида 2 цистеина в позициях 17 и 19 (считая от первого метионина в нативном М2) были заменены аминокислотными остатками се-рина. Такие замены не должны приводить к существенным изменениям иммунологических свойств М2е-пептида [22]. Кроме того, для предотвращения включения в полученные in vivo в E. coli НВс-частицы клеточной РНК, мы использовали укороченную последовательность HBc-антигена. Последовательность С-концевого фрагмента (после Val149), отвечающего за связывание с нуклеиновыми кислотами при сборке вириона, была удалена и заменена на цистеин, включение которого повышает стабильность НВс-частиц [23].
Полученный ген клонировали в векторе pETM-10 под контролем промотора, узнаваемого Т7 РНК-полимеразой, при этом экспрессируемый рекомбинантный белок содержал поли-гистидиновый таг на N-конце. Этот белок был экспрессирован в штамме BL21(DE3) на высоком уровне, до 25-30% общего белка (рис. 2, а), и выявлялся антителами к М2е в вестерн-блоттинге (рис. 2, б). Однако анализ клеточных фракций показал, что практически весь белок HA2-HBc/M2ek находится в нерастворимой фракции. Изменение условий экспрессии (температура, концентрация ИПТГ, время после индукции) не позволило получить растворимый белок. Поэтому очистку рекомбинантного белка проводили в денатурирующих условиях с помощью аффинной хроматографии на Ni-NTA-сорбенте (см. рис. 2, а).
Для получения HBc-антигена без вставок использовали век-
тор pQE60-HBc, обеспечивающий экспрессию укороченного HBc (с 4 по 149 а. о. и С-концевой цистеин), который образует ВПЧ in vivo в клетках штамма-продуцента [21]. Вирусоподобные НВс-частицы были очищены с помощью ультрацентрифугирования в градиенте плотности цезий хлористый - сахароза. В дальнейшем их использовали как источник «немодифици-рованного» НВс.
Получение мозаичных вирусоподобных НВ-частиц в результате рефолдинга in vitro
Поскольку экспрессированный в E. coli белок HA2-HBc/ M2ek оказался нерастворимым и его удалось выделить лишь в денатурирующих условиях, для получения ВПЧ проводили его рефолдинг через ступенчатый диализ совместно с белком HBc без чужеродных вставок. Изменение соотношения НВс и HA2-HBc/M2ek должно было обеспечить получение вирусоподобных НВс-частиц с различным числом представленных на них гриппозных эпитопов. С одной стороны, увеличение доли HBc без вставок должно облегчить формирование ВПЧ. С другой стороны, увеличение доли HA2-HBc/M2ek повышает вероятность встраивания этих молекул в формируемые ВПЧ и увеличивает число гриппозных эпитопов, представленных на их поверхности.
В связи с этим выполняли рефолдинг смеси очищенных и предварительно денатурированных препаратов HBc и HA2-HBc/M2ek в молярных соотношениях 1:0, 2:1, 1:1, 1:2 и 0:1. Рефолдинг белков проводили при общей концентрации целевого белка 0,1 мг/мл. После нескольких этапов диализа ре-фолдированные белки были переведены в 50 мМ Tris буфер
original research
с pH 7,4, при этом все белковые препараты оставались растворимыми.
Наличие в полученных препаратах ВПЧ и их свойства исследовали с помощью атомно-силовой микроскопии. В качестве контроля использовали препарат немодифицированных НВс-частиц, полученных in vivo и очищенных путём ультрацентрифугирования. Результаты атомно-силовой микроскопии показывают, что для всех препаратов наблюдаются округлые частицы размером от 25 до 50 нм. Наличие ВПЧ детектировали как в препаратах, содержащих HA2-HBc/M2ek совместно с немодифицированным HBc-антигеном (мозаичные частицы), так и в препаратах, содержащих только белки HA2-HBc/M2ek (рис. 3). Наблюдаемые размеры собранных in vitro НВс-частиц во всех случаях были несколько больше, чем у полученных in vivo в E. coli.
В дальнейшем на лабораторных животных будет исследована иммуногенность полученных таким образом ВПЧ - носителей М2е- и НА2-пептидов, а также протективное действие при заражении различными штаммами вируса гриппа А.
Обсуждение
Целью данной работы было получение вирусоподобных НВс-частиц, несущих одновременно консервативные пептиды М2е и НА2 вируса гриппа. Хотя НВс-антиген широко используется как носитель чужеродных эпитопов [2], во многих случаях, в частности при включении гидрофобных или слишком длинных пептидов, белок оказывался нерастворимым и/ или неспособным образовывать ВПЧ [2]. Включения в район иммунодоминантной петли НВс-антигена особенно чувствительны к вставке, поскольку в этом случае важна конформация включённого пептида, а именно возможность пространственного сближения N- и С-концов вставки. Частично эта проблема может быть решена за счёт фланкирования вставки гибкими богатыми глицином линкерами, что позволяет включить в этот участок даже несколько копий М2е-пептида [16]. Поскольку используемый нами в качестве антигена фрагмент НА2 содержит гидрофобный участок с 83 по 97 аминокислотами (FLDVWTY-NAELLVLM), последовательность НА2 включили на N-конец НВс-антигена, отделив его от последовательности НВс гибким линкером, а М2е-пептид включили в иммунодоминантную петлю. Соответствующий гибридный белок HA2-HBc/M2ek, хорошо экспрессировался в E. coli, но оказался нерастворимым, что не позволило получить ВПЧ. Поскольку аналогичный белок без НА2 растворим и образует ВПЧ при экспрессии в E. coli [16], вероятно, именно гидрофобный участок в НА2 нарушает растворимость гибридного белка.
Поэтому для получения ВПЧ из HA2-HBc/M2ek был использован метод рефолдинга in vitro совместно со способным образовывать ВПЧ немодифицированным НВс-антигеном. Чем больше доля немодифицированного НВС, тем легче должны образовываться мозаичные частицы. Несмотря на нерастворимость HA2-HBc/M2ek при экспрессии в E. coli, после рефолдинга он оказался растворимым и способным образовывать ВПЧ даже в отсутствие немодифицированного НВс-антигена. По-видимому, ступенчатый рефолдинг первоначально полностью денатурированного белка обеспечил его правильный фолдинг и сборку частиц.
Метод рефолдинга in vitro более сложен по сравнению с выделением ВПЧ, полученных в результате самосборки in vivo в E. coli, но он имеет и ряд преимуществ. Во-первых, полученные в E. coli частицы включают бактериальные компоненты, в частности клеточную РНК [11]. Во-вторых, сборка in vitro позволит создавать мозаичные частицы, несущие различные целевые эпитопы за счёт использования сочетания соответствующих модифицированных НВс-белков. Это может оказаться особенно полезным при создании противогриппозных вакцин на основе М2е, поскольку последовательность этого пептида практически неизменна у абсолютного большинства вирусов гриппа А человека, но отличается у вирусов гриппа
птиц и пандемического штамма A(H1N1)2009, причём эти отличия важны для специфичности вакцин [24, 25]. Включение различных комбинаций иммунодоминантных эпитопов вируса гриппа, присоединённых к НВс-антигену, в состав мозаичной ВПЧ откроет возможность создания вакцин с более широким спектром защиты.
Финансирование. Исследование выполнено при поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проект 16-34-00976).
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература/references
1. Ulrich R., Nassal M., Meisel H., Krüger D. H. Core particles of hepatitis B virus as carrier for foreign epitopes. Adv. Virus Res. 1998; 50: 141-82.
2. Pumpens P., Grens E. HBV core particles as a carrier for B cell/T cell epitopes. Intervirology. 2001; 44(2-3): 98-114.
3. Crowther R.A., Kiselev N.A., Bottcher B., Berriman J.A., Borisova G.P., Ose V., et al. Three-dimensional structure of hepatitis B virus core particles determined by electron cryomicroscopy. Cell. 1994; 77(6): 943-50.
4. Bottcher B., Wynne S.A., Crowther R.A. Determination of the fold of the core protein of hepatitis B virus by electron cryomicroscopy. Nature. 1997; 386(6620): 88-91.
5. Wynne S.A., Crowther R.A., Leslie A.G. The crystal structure of the human hepatitisB virus capsid.Mol. Cell. 1999; 3(6): 771-80.
6. Kratz P.A., Bottcher B., Nassal M. Native display of complete foreign protein domains on the surface of hepatitis B virus capsids. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1999; 96(5): 1915-20.
7. Vogel M., Diez M., Eisfeld J., Nassal M. In vitro assembly of mosaic hepatitis B virus capsid-like particles (CLPs): rescue into CLPs of assembly-deficient core protein fusions and FRET-suited CLPs. FEBS Lett. 2005; 579(23): 5211-6.
8. Robinson C.R., Sauer R.T. Optimizing the stability of single-chain proteins by linker length and composition mutagenesis. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 1998; 95(11): 5929-34.
9. Kazaks A., Borisova G., Cvetkova S., Kovalevska L., Ose V., Sominska-ya I., et al. Mosaic hepatitis B virus core particles presenting the complete preS sequence of the viral envelope on their surface. J. Gen. Virol. 2004; 85(Pt. 9): 2665-70.
10. Koletzki D., Zankl A., Gelderblom H.R., Meisel H., Dislers A., Borisova G., et al. Mosaic hepatitis B virus core particles allow insertion of extended foreign protein segments. J. Gen. Virol. 1997; 78 (Pt. 8): 2049-53.
11. Hatton T., Zhou S., Standing D.N. RNA- and DNA-binding activities in hepatitis B virus capsid protein: a model for their roles in viral replication. J. Virol. 1992; 66(9): 5232-41.
12. Neirynck S., Deroo T., Saelens X., Vanlandschoot P., Jou W.M., Fiers W. A universal influenza A vaccine based on the extracellular domain of the M2 protein. Nat. Med. 1999; 5(10): 1157-63.
13. Fiers W., De Filette M., El Bakkouri K., Schepens B., Roose K., Schot-saert M., et al. M2e-based universal influenza A vaccine. Vaccine. 2009; 27(45): 6280-3.
14. Ito T., Gorman O.T., Kawaoka Y., Bean W.J., Webster R.G. Evolutionary analysis of the influenza A virus M gene with comparison of the M1 and M2 proteins. J. Virol. 1991; 65(10): 5491-8.
15. Feng J., Zhang M., Mozdzanowska K., Zharikova D., Hoff H., Wunner W., et al. Influenza A virus infection engenders a poor antibody response against the ectodomain ofmatrix protein 2. Virol. J. 2006; 3: 102.
16. Ravin N.V., Blokhina E.A., Kuprianov V.V., Stepanova L.A., Shaldjan A.A., Kovaleva A.A., et al. Development of a candidate influenza vaccine based on virus-like particles displaying influenza M2e peptide into the immunodominant loop region of hepatitis B core antigen: Insertion of multiple copies of M2e increases immunogenicity and protective efficiency. Vaccine. 2015; 33(29): 3392-7.
17. Tsybalova L.M., Stepanova L.A., Kuprianov V.V., Blokhina E.A., Potap-chuk M.V., Korotkov A.V., et al. Development of a candidate influenza vaccine based on virus-like particles displaying influenza M2e peptide into the immunodominant region of hepatitis B core antigen: Broad protective efficacy of particles carrying four copies of M2e. Vaccine. 2015; 33(29): 3398-406.
18. Wang T.T., Tan G.S., Hai R., Pica N., Ngai L., Ekiert D.C., et al. Vaccination with a synthetic peptide from the influenza virus hemagglutinin provides protection against distinct viral subtypes. Proc. Natl. Acad. Sci. USA. 2010; 107(44): 18979-84.
19. Zhang H., Wang L., Compans R.W., Wang B.Z. Universal influenza vaccines, a dream to be realized soon. Viruses. 2014; 6(5): 1974-91.
20. Stepanova L.A., Sergeeva M.V., Shuklina M.A., Shaldzhyan A.A., Po-tapchuk M.V., Korotkov A.V., et al. A fusion protein based on the second
subunit of hemagglutinin of influenza A/H2N2 viruses provides cross immunity. Acta Naturae. 2016; 8(2): 116-26.
21. Blokhina E.A., Kuprianov V.V., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., Ravin N.V., Skryabin K.G. A molecular assembly system for presentation of antigens on the surface of HBcvirus-like particles. Virology. 2013; 435(2): 293-300.
22. De Filette M., Min Jou W., Birkett A., Lyons K., Schultz B., Tonkyro A., et al. Uni-versal influenza A vaccine: optimization of M2-based constructs. Virology. 2005; 337(1): 149-61.
23. Riedl P., Stober D., Oehninger C., Melber K., Reimann J., Schirmbeck R. Priming Th1 immunity to viral core particles is facilitated by tracea-
Вопросы вирусологии. 2018; 63(3)
DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-4088-2018-63-3-135-138
оригинальные исследования
mounts of RNA bound to its arginine-rich domain. J. Immunol. 2002; 168(10): 4951-9.
24. Kotlyarov R.Y., Kuprianov V.V., Migunov A.I., Stepanova L.A., Tsybalova L.M., Kiselev O.I., et al. Development of Recombinant Vaccine Against A(H1N1) 2009 Influenza Based on Virus-like Nanoparticles Carrying the Extracellular Domain of M2 Protein. Acta Naturae. 2010; 2(2): 71-7.
25. De Filette M., Fiers W., Martens W., Birkett A., Ramne A., Lowenadler B., et al. Improved design and intranasal delivery of an M2e-based human influenza A vaccine. Vaccine. 2006; 24(44-46): 6597-601.
Поступила 20.11.17 Принята в печать 12.12.17
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018 УДк 578.891.083.2
Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Леонов И.К.
кинетика инактивации вируса гепатита утят типа i
(AVIHEPATOVIRU, PIcORNAVIRIDAE)
Всероссийский научно-исследовательский ветеринарный институт птицеводства - филиал ФГБНУ Федерального научного центра «Всероссийский научно-исследовательский и технологический институт птицеводства» РАН, 198412, г. Санкт-Петербург - Ломоносов
Представлены экспериментальные данные кинетики инактивации вакцинного штамма вируса гепатита утят типа I повышенной температурой и аминоэтилэтиленимином (АЭЭи). Показано, что вакцинный штамм 3М-УнииП вируса гепатита утят типа I оказался сравнительно термостабильным при 56oC и чувствительным к действию АЭЭи, время полной инактивации вируса составляет 24 ч в конечной концентрации 0,1% при 37 0С. Полученные результаты позволяют утверждать, что АЭЭи можно использовать в качестве инакти-ватора при изготовлении инактивированной вакцины против вирусного гепатита утят типа I.
К л ю ч е в ы е с л о в а: кинетика инактивации; вирус гепатита утят; температура; формальдегид. Для цитирования: Трефилов Б.Б., Никитина Н.В., Леонов И.К. Кинетика инактивации вируса гепатита утят типа I (Avihepatovirus, Picornaviridae). Вопросы вирусологии. 2018; 63(3): 135-138. DOI: http://dx.doi.org/ 10.18821/0507-40882018-63-3-135-138
Trefilov B.B., Nikitina N.V., Leonov I.K. THE KINETICS OF THE INACTIVATION OF THE HEPATITIS VIRUS TYPE I (AVIHEPATOVIRUS,
PICORNAVIRIDAE)
All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry Science, Branch of the Federal State Budget Scientific Institution Federal Scientific Center "All-Russian Research and Technological Poultry Institute", St. Petersburg - Lomonosov, 198412, Russian Federation
Experimental data on the kinetics of the inactivation of the vaccine strain of the duckling hepatitis virus of the type I with increased temperature and aminoethyl ethylenimine are presented. It was shown that the vaccine strain 3M-UNIIP of the hepatitis virus of ducklings of type I was comparatively thermostable at 56°C and sensitive to the action of aminoethyl ethylenimine; the time of complete inactivation of the virus at a final concentration of 0.1% at 37°C was 24 h. The obtained results suggest that aminoethyl ethylenimine can be used as an inactivator in manufacturing inactivated vaccine against viral hepatitis of ducklings of type I.
K e y w o r d s: kinetics of inactivation; hepatitis virus of ducklings; temperature; formaldehyde.
For citation: Trefilov B.B., Nikitina N.V., Leonov I.K. The kinetics of the inactivation of the hepatitis virus type I (Avihepatovirus, Picornaviridae). Voprosy Virusologii (Problems of Virology, Russian journal). 2018; 63(3):135-138 . (In Russ.). DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0507-4088-2018-63-3-135-138
For correspondence: Boris B. Trefilov, Doctor of Veterinary Sciences, Professor, Chief Researcher of the Department of
Virology and Tumor Bird Diseases named after R.N. Korovin, All-Russian Research Veterinary Institute of Poultry Science,
Branch of the Federal State Budget Scientific Institution Federal Scientific Center "All-Russian Research and Technological
Poultry Institute", St. Petersburg - Lomonosov, 198412, Russian Federation. E-mail: boris.trefilow@yandex.ru
Information about authors:
Trefilov B.B., http://orcid.org/0000-0002-4721-6955
Nikitina N.V., http://orcid.org/0000-0002-7500-3172
Acknowledgment. The study had no sponsorship.
Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Received 24 October 2017
Accepted 12 December 2017
Для корреспонденции: Борис Борисович Трефилов, д-р вет. наук, профессор, главный научный сотрудник отдела вирусологии и опухолевых болезней птиц им. Р.Н. Коровина ВНИВИП, 198412, г. Санкт-Петербург - Ломоносов. E-mail: boris.trefilow@yandex.ru
