CC BY
19
УДК: 614.31-546.231.612.392.74
Ключевые слова: селен, лактоферрин, микроэлементы, иммунитет
Key words: selenium, lactoferrin, microelements, immunity
Козлов С. В., Фомин А. С., Степанов В. С., Волков А. А., Староверов С. А.
КОНСТРУИРОВАНИЕ КОЛЛОИДНОГО КОМПЛЕКСА СЕЛЕНА С ЛАКТОФЕРРИНОМ И ИЗУЧЕНИЕ ЕГО БИОДИНАМИЧЕСКИХ СВОйСТВ
DESIGNING A COLLOIDAL COMPLEX OF LACTOFERRIN WITH SELENIUM AND STUDYING ITS BIODYNAMIC PROPERTIES
'ГНУ Саратовский научно-исследовательский ветеринарный институт РАСХН Адрес: 410028, г. Саратов, ул. 53-й Стрелковой дивизии, 6
'Saratov Scientific Research Veterinary Institute of Russian Academy of Agricultural Sciences Address: 410028, Russia, Saratov, 53d Strelkovaya Diviziya str., 6 2Институт биохимии и физиологии растений и микроорганизмов РАН Адрес: 410049, г. Саратов, пр. Энтузиастов, 13 2Institute of Biochemistry and Physiology of Plants and Microorganisms of Russian Academy of Sciences Address: 410049, Russia, Saratov, Entuziastovpr., '3 3ФГОУ ВПО «Саратовский государственный аграрный университет им. Н. И. Вавилова» Адрес: 410012, г. Саратов, Театральная пл., 1 3The Saratov State Agrarian University named after N. I. Vavilov Address: 4'00'2, Russia, Saratov, Teatralnaya square, 1
Козлов Сергей Васильевич, к. в. н., доцент3 / Kozlov Sergey V., Ph.D. in Veterinary Science, Associate Professor3 Фомин Александр Сергеевич, аспирант3 / Fomin Alexander S., Postgraduate3 Степанов Владимир Сергеевич, аспирант3 / Stepanov Vladimir S., Postgraduate3 Волков Алексей Анатольевич, д. в. н., проф.3 / Volkov Alexey A., Doctor of Veterinary Medicine, Professor3 Староверов Сергей Александрович, д. б. н., проф.1 / Staroverov Sergey A., Doctor of Biology Science, Professor'
Аннотация. Проведено изучение биологических свойств лактоферрина и его комплекса с селеном. Установлено, что лактоферрин обладает способностью активировать фагоцитоз и оказывать стимулирующее влияние на гуморальные факторы иммунитета. Комплекс лактоферрина с селеном вызывал стимуляцию пролиферативной активности клеток на 91 %, селенит натрия - на 9 %, а фитогемагглютинин - на 26 % по сравнению с контролем.
Summary. In our researches we have studied the biological properties of lactoferrin and its complex with selenium. It has been proved that lactoferrin possesses the ability to activate the englobement and to stimulate humoral immunity factors. Lactoferrin and selenium complex invoked stimulation of proliferative activity of cells up to 91 %, sodium selenit - to 9 % andphytohemagglutinin - to 26 % in comparison with the control.
Введение
В последнее время большое внимание уделяется использованию в ветеринарной медицине биологически активных веществ природного происхождения, обладающих антимикробным и иммунопротективным действием. Данные соединения позволяют снизить количество применяемых хемотера-певтических средств и, тем самым, повысить качество получаемой сельскохозяйственной продукции [9].
Особый интерес в данном случае представляют микроэлементы и биоактивные белки молока.
Представления о роли микроэлементов при различных физиологических и патологических состояниях организма животных
значительно расширились. Присутствуя в организме в микроколичествах, микрону-триенты участвуют в образовании ферментов, влияют на их активность, принимают участие в синтезе и процессах метаболизма гормонов, витаминов, оказывают влияние на нервную, сердечно-сосудистую, эндокринную системы, деятельность желез внутренней секреции, желудочно-кишечный тракт. При помощи минеральных веществ связывается и доставляется тканям кислород, выводится углекислый газ, поддерживается слабощелочная реакция крови и кислотно-щелочное равновесие, от концентрации макро- и микроэлементов зависит водный, белковый, углеводный и липидный обмены, микроэлементы способствуют обезврежива-
нию токсинов. Недостаток микроэлементов имеет значение в патогенезе ряда заболеваний инфекционной и неинфекционной этиологии [1].
Особый интерес представляет эсенциаль-ный микроэлемент селен. В организме нет такого органа или системы, где не использовался бы данный элемент. Этот микронутри-ент участвует в обмене белков и нуклеиновых кислот, входит в состав ферментов и гормонов, участвует в реакциях иммунитета, воспаления и регенерации. Селеносодержащие белки формируют костную и хрящевую ткани, поддерживают работу скелетных и гладких мышц, контролируют гормональный баланс [2].
Лактоферрин - белок сыворотки молока млекопитающих, железосвязывающий, многодоменный, полифункциональный глико-протеид. Наибольший спектр биологической активности обнаружен у пептидных фрагментов лактоферрина, получаемых при его протеолизе [9].
По литературным данным, продукты про-теолиза лактоферрина обладают целым рядом биоактивных свойств, обнаруженных in vitro. Так, они являются фактором опсониза-ции и усиления завершенности фагоцитоза, обладают антимикробной, антивирусной, противогрибковой и противогельминтной активностью, тормозят адгезию бактерий на клетках макроорганизма [8, 7, 10].
Все перечисленные выше свойства делают селен и лактоферрин интересным объектом для изучения и использования в фармакологии. Вместе с этим многие вопросы, касающиеся влияния коллоидного селена на иммунную систему, до сих пор остаются недостаточно изученными.
В связи с этим мы поставили целью в начале нашей работы изучить некоторые биодинамические параметры препарата коллоидного селена, конъюгированного с лактаферином in vitro.
Материалы и методы
Исследование влияния протеолитических фрагментов лактоферрина (ПФЛ) на эффективность иммунизации. В эксперименте использовали 3 группы мышей по 3 животных в каждой. Мышам первой группы (кон-
троль) на протяжении всей иммунизации вводили внутрибрюшинно биомассу полевого изолята Salmonella thyphimurium (любезно предоставленной кафедрой микробиологии СГАУ им. Н. И. Вавилова), убитой нагреванием. Мышам второй группы вводилась вну-трибрюшинно смесь биомассы сальмонеллы и протеолитических фрагментов лактоферрина (ПФЛ), доза последнего составляла 4 мкг на 20 г живой массы. Мыши третьей группы получали внутрибрюшинно ПФЛ в указанной выше дозе и через сутки - биомассу сальмонеллы. Доза влажной биомассы сальмонелл во всех группах составляла 0,2 мг на 20 г живой массы. Иммунизацию проводили с интервалом 2 недели - всего 4 введения. Перед забоем проводили бусти-рование биомассой сальмонелл.
Титр агглютинирующих антител в сыворотках экспериментальных животных определяли, используя метод радиальной имму-нодиффузии в 1,5 % агаровом геле [4].
Влияние ПФЛ на выживаемость стафилококка в присутствии перитонеальных клеток. Перитонеальные клетки мыши (ПКМ) получали по стандартной методике [3], затем определяли их концентрацию на гематологическом анализаторе. В эксперименте использовали клетки Staphylococcus aureus 209-P из культуры в логарифмической фазе роста (OD600 = 0,5) на мясопептонном бульоне. Смешением раствора ПФЛ или физиологического раствора вместо него, свежей среды, суспензий ПКМ и стафилококка получали культуры с концентрациями компонентов, приведенными в таблице 1.
Полученные культуры инкубировали 40 мин. при 37 °С, определяли число КОЕ стафилококка высевом разведений исходных образцов на солевой мясопептонный агар и подсчетом числа выросших колоний. Рассчитывали активность фагоцитоза по формуле:
АФ = 100 х (а - б) / а,
где «а» и «б» - концентрация стафилококка в контроле и опыте, соответственно.
Выделение ПКМ проводилось по стандартной методике [3]. Измерение дыхательной активности изучали по способности клеток восстанавливать нитротетразолевый синий до формазана по общепринятому методу [5].
Таблица 1.
Схема постановки эксперимента по изучению взаимодействия микробных клеток и перитонеальных клеток мыши с протеолитическими фрагментами лактоферрина
Состав культуры Номер культуры Концентрации компонентов
S. aureus, млн. КОЕ/мл ПКМ, млн. клеток/мл ПФЛ, мкг/мл
ПКМ + S. aureus + ПФЛ I 200 3 333
II 20 3 333
ПКМ + S. aureus I 200 3 -
II 20 3 -
S. aureus + ПФЛ I 200 - 333
II 20 - 333
Контроль I 200 - -
II 20 - -
Коллоидный селен синтезировался нами по следующей технологии [6]: во флакон объемом 20 см3 внесли 0,5 мл. 1М солянокислого гидразина, добавили 2 мл воды. В полученном растворе ресуспензировали 20 мг белка (в данном случае нами использовался лактоферрин, предварительно освобожденный от железа), после чего добавляли 0,125 мл. 1М селенита натрия и доводили объем раствора до 5 мл. Через несколько минут, когда раствор окрасился в оранжевый цвет, довели pH смеси до 7,2 1М гидрокси-дом натрия. Провели диализ раствора против воды в течение 96 часов с подменой воды каждые 24 часа.
Освобождение лактоферрина от железа проводили путем диализа против ацетатного буфера pH - 4,0 в течение 24 часов с 3-кратной подменой буфера.
Размер частиц коллоидного селена определяли при помощи электронного микроско-пирования, которую осуществляли на электронном микроскопе LIBRA 120 (Carl Zeiss, Германия).
Использованная в работе культура клеток линии HeLa получена из криобанка коллекции клеточных культур лаборатории вирусологии (г. Саратов) научно-исследовательской ветеринарной станции Российской академии наук (РАСХН). Культивирование клеточных культур проводили в пластиковых флаконах в полной RPMI среде (10 % эмбриональной сыворотки, гентамицин, амфотерицин) при 37 °С с 5 % СО.
Проведение МТТтеста: МТТ-тест проводили по следующей методике: чистую культуру клеток и клетки с добавлением препаратов инкубировали по 500 мкл в пробирках при 37 °С в течение 48 часов. Каждую пробирку с клеточными суспензиями по окончании инкубирования центрифугировали 10 мин. при 1000 g. Перерастворяли полученный осадок в 500 мкл раствора МТТ и инкубировали в течение часа. После инкубации клетки перерастворяли в 500 мкл ДМСО, отбирали по 200 мкл суспензии из каждой пробирки и помещали в лунки 96-луночного плоскодонного планшета. Показания оптической плотности считывали на микропланшетном ридере Multiskan ASCENT (США) при длине волны 570 нм.
Для определения цитостатической активности коллоидного селена проводили титрование методом двойных разведений следующих образцов объемом по 500 мкл: раствора коллоидного селена с лактофер-рином и раствор селенита натрия в полной RPMI среде (Roswell Park Memorial Institutemedium - среда для культур клеток и тканей) с изменением концентрации проспидина от 400 до 10 мкг/мл. В каждую пробирку добавляли по 250 мкл клеточной суспензии и инкубировали в течение трех суток при 37 °С. Далее проводили МТТ-тест по описанной ниже методике. В качестве контроля инкубировали клетки в полной RPMI среде.
Пролиферативную активность клеток определяли по общепринятой методике [3].
Результаты и обсуждение
В начале наших исследований мы решили провести изучение влияния лактофер-рина и его протеолитических фрагментов на неспецифические факторы иммунитета животных.
Влияние протеолитических производных лактоферрина на неспецифические факторы иммунитета определяли в тесте с нитроте-тразолевым синим при использовании пери-тонеальных клеток белых нелинейных крыс. Результаты представлены на рисунке 1.
Протеолитические фрагменты лактоферрина заметно стимулируют клеточную систему иммунитета, что выражается в усилении митохондриального дыхания перитонеаль-ных макрофагов. Кроме того, зависимость усиления клеточного дыхания от концентрации ПФЛ показывает, что эффект ПФЛ стремится к предельному уровню.
Повышение уровня восстановления ни-тротетразолия перитонеальными клетками в присутствии ПФЛ позволяет судить о росте активности фагоцитоза. Фактом, подтверждающим данную гипотезу, являются приведенные ниже результаты по усилению бактерицидной активности перитонеальных клеток мыши в присутствии ПФЛ (табл. 2). Меньшая выживаемость клеток стафилококка в культуре перитонеальных клеток в присутствии фрагментов лактоферрина, очевидно, является результатом усиления фагоцитоза.
Сравнение контроля, где отсутствовали какие-либо бактерицидные или бакте-
риостатические агенты, и культур «ПФЛ + S. aureus» показывает, что в данной концентрации и при данных условиях инкубации ПФЛ не оказывает выраженного бактерио-статического эффекта в отношении стафилококка. Однако при совместном присутствии ПФЛ и перитонеальных клеток мыши выживаемость стафилококка заметно падает, о чем свидетельствует сравнение культур «ПКМ + S. aureus + ПФЛ», «ПКМ + S. aureus» между собой и с контрольной культурой, падение выживаемости стафилококка в первом из образцов обусловлено, очевидно, усилением фагоцитоза. Уменьшение числа выживающих стафилококков (рост активности фагоцитоза) более заметно при низких и средних исходных плотностях посева.
Таким образом, ПФЛ повышает активность фагоцитоза, что позволяет предполагать его стимулирующее влияние на формирование гуморального иммунитета.
В силу этого были произведены эксперименты по иммунизации мышей антигенами сальмонелл совместно с ПФЛ. На рисунке 2 представлены результаты определения титра агглютинирующих антител (АТ) в сыворотках иммунизированных мышей. Наиболее высокий титр АТ обнаружен в сыворотке мышей, иммунизированных смесью сальмонелл и ПФЛ. У мышей, иммунизированных только биомассой, и мышей, иммунизированных биомассой через день после инъекции ПФЛ, титры АТ одинаковы и существенно ниже, чем у животных, получавших ПФЛ и антиген одновременно. В сыворотке неим-
70 | 60 I
v
i * s ф-JD % 3 зо 1 0 2 м 1
"^^Ri^ 0.9957
S R* = 0f9761 Ri = 0.9748^^^» = (¿9776
1,0 2.0 4.0 8,0 16,0 32,0 64.0 128,0 256,0 поимиль ¡доведения сыворотки
—•—»вдтн«, иммртнзир<к»м*»е зн1иген0м cawKwcnrw
Рис. 2. Титры агглютинирующих АТ против сальмонеллы в сыворотках мышей, иммунизированных биомассой сальмонеллы совместно или параллельно с ПФЛ.
0.26
0,19
0 12 3 4 5
[лэктоферрин], мкг на мл культуры
Рис. 1. Влияние пептидов - производных лактоферрина на восстановление НСТ в культуре перитонеальных клеток крысы.
Таблица 2.
Взаимодействие микробных клеток и перитонеальных клеток мыши с протеолитическими фрагментами лактоферрина
Концентрации компонентов Концентрация клеток стафилококка, млн. КОЕ/мл
ПКМ, млн. клеток/мл ПФЛ, мкг/мл исходная по истечении инкубации активность фагоцитоза
ПКМ + & аигвш' + ПФЛ I 3 333 200 415 5
II 3 333 20 28 41
ПКМ + & аигвш' I 3 - 200 429 2,72
II 3 - 20 47 2,1
& аигвш + ПФЛ I - 333 200 434 -
II - 333 20 48 -
Контроль I - - 200 441 -
II - - 20 48 -
мунизированных животных также обнаруживаются АТ, агглютинирующие антигены сальмонелл. Иммунизация биомассой сальмонелл совместно с ПФЛ происходит эффективнее, при этом предварительная, за день до иммунизации инъекция ПФЛ, не сказывается на уровне АТ в сыворотке по сравнению с контролем.
В качестве объяснения приведенных выше результатов иммунизации можно предложить следующее. Фрагменты протеолиза лактоферрина при внутрибрюшинной иммунизации могут стимулировать фагоцитоз корпускулярного антигена, способствуя тем самым более полной и эффективной его презентации иммунной системе макроорганизма.
Получив вышеизложенные данные, мы провели синтез коллоидного селена с лакто-феррином и дальнейшее изучение его биологических свойств.
Проведя синтез полученного нами комплекса, мы провели его электронную микроскопию.
На рисунке 3 видно, что данный синтез позволяет создать коллоидный раствор, содержащий частицы селена от 142 до 60 нм.
После проведения синтеза коллоидного селена мы проверили изучение иммуноток-сичности полученного нами препарата на клеточной линии HeLa.
Нами были получены следующие результаты. На рисунке 4 видна зависимость угнетения дыхательной активности клеток от
концентрации селена в культуральной жидкости. Можно отметить, что концентрация селена 10 мкг/мл не только не вызывает угнетения роста клеток, но и отмечается стимуляция клеточного дыхания на 28 %.
Проведя титрование селена от концентрации 10 мкг/мл до 1 мкг/мл, мы все остальные исследования проводили на концентрации 2,5 мкг/мл, так как это была минимальная концентрация, которая вызывала стимулирование дыхания клеток линии НеЬа (отмечается стимуляция клеточного дыхания на 30 %).
Отметив стимуляцию клеточного дыхания у клеток линии HeLa, мы в дальнейшем прове-
« ■ ф ;,-■..' а
ч- - айШ л--©
* ♦ ,
Рис. 3. Электронная микроскопия препарата селена.
Рис. 4. Дыхательная активность суспензии клеток HeLa, инкубированных с коллоидным селеном.
Рис. 5. Трансформирующая активность клеток селезенки крыс в присутствие конъюгатов коллоидного селена.
ли исследования по изучению влияния коллоидного селена на стимуляцию пролифератив-ной активности лимфоидных клеток (рис. 5).
Проведя данные исследования, мы отметили, что коллоидный селен вызывал стимуляцию пролиферативной активности клеток на 91 %, селенит натрия - на 9 %, а фито-гемагглютинин - на 26 % по сравнению с контролем. Анализируя полученные выше данные, хочется отметить, что коллоидный селен, обладая повышенной пролифератив-ной активностью, может рассматриваться в перспективе как эффективное иммуномоду-лирующее средство.
Выводы
1. Протеолитические фрагменты лакто-феррина стимулируют клеточную систему иммунитета, что выражается в усилении ми-тохондриального дыхания перитонеальных макрофагов.
2. Фрагменты протеолиза лактоферрина при внутрибрюшинной иммунизации могут стимулировать фагоцитоз корпускулярного антигена, способствуя тем самым более полной и эффективной его презентации иммунной системе макроорганизма.
3. Оптимальная концентрация коллоидного селена, вызывающая стимуляцию окислительно-восстановительных процессов в клетках, составляет 10 мкг/мл.
4. Повышение пролиферативной активности клеток селезенки крысы на 91 % указывает на возможность использование данной
системы как носителя для конструирования вакцинных препаратов.
Список литературы
1. Авцин, А. П. Микроэлементозы человека / А. П. Авцин, А. А. Жаворонков, М. А. Риш, Л. С. Строчкова. - М., 1991. - С. 196-202.
2. Мурох, В. И. Роль селена в организме животного и человека / В. И. Мурох, Н. Д. Коломиец, В. С. Петрова, М. А. Гриц, А. Г. Мойсеенок // Весщ нацыянальнай акадэми навук Беларусь Серыя бiялапчных навук. -2002. - № 3. - С. 99-105.
3. Пастер, Е. У Иммунология: практикум / Е. У Пастер, В. В. Овод, В. К. Позур, Н. Е. Вихоть. -Киев : Вищашк, 1989. - 304 с.
4. Фримель, Г. Иммунологические методы / Г. Фримель. - М. : Медицина, 1987. - 472 с.
5. Bernas, T. The role of plasma membrane in bioreduction of two tetrazolium salts, MTT, and CTC / T. Bernas, J. W. Dobrucki // Arch. Biochem. Biophys. -2000. - V. 380. - P. 108-116.
6. Bo, Huang. Free radical scavenging efficiency of nano-Se in vitro / Bo Huang, Jinsong Zhang, JingwuHou, Chang Chen // Free Radical Biology & Medicine. - 2003. -Vol. 35. - No. 7. - P. 805-813.
7. Dionysius, D. A. Forms of lactoferrin: their antibacterial effect on enterotoxigenic Escherichia coli / D. A. Dionysius, P. A. Grieve, J. M. Milne // J. Dairy Sci. -1993. - V. 76. - P. 2597-2606.
8. Dionysius, D. A. Antibacterial peptides of bovine lactoferrin: purification and characterization / D. A. Dionysius, J. M. Milne // J. Dairy. Sci. - 1997. -
V 80. - P. 667-674.
9. Miyauchi, H. Immunomodulatory effect of bovine lactoferrin pepsin hydrolysate on murine splenocytes and Peyer's patch cells / H. Miyauchi, A. Kaino, I. Shinoda, Y. Fukuwatari, H. Hayasawa // J. Dairy Sci. - 1997. -
V 80. - P. 2330-2339.
10. Naidu, A. S. Lactoferrin: Natural, Multifunctional, Antimicrobial / A. S. Naidu. - Boca Raton, FL : CRC Press, 2000. - 86 p.
