CC BY
13
Пробл. особо опасных инф. 2016; 3:85-89. DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-85-89
УДК 616.98:579.842.23
З.л.Девдариани, н.А.сырова, Е.А.михеева, и.В.Терехова, н.м.Ермаков, Г.В.Григорьева,
о.А.лобовикова, и.В.Шульгина
КОНСТРУИРОВАНИЕ И МЕДИЦИНСКИЕ ИСПЫТАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОй ИММУНОФЕРМЕНТНОй ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ВЫЯВЛЕНИЯ КАПСУЛОСОДЕРЖАЩИХ ШТАММОВ ЧУМНОГО МИКРОБА «ИФАПЕСТФ1-М»
ФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация
цель исследований. Разработка и медицинские испытания «Тест-системы иммуноферментной для детекции чумного микроба моноклональной (ИФАПестФ1-М)». материалы и методы. В работе использованы материалы для постановки сэндвич-варианта ИФА. В качестве диагностического имму-нореагента применяли МКА 1В3 к FI Y pestis. Для определения чувствительности и специфичности сконструированной иммуноферментной тест-системы исследованы образцы 24 природных и генетически модифицированных pFra+ и pFra- штаммов Y pestis и 56 штаммов гетерологичных бактерий семейства Enterobacteriaceae. результаты и выводы. На основе моноклональных антител к капсульному антигену Yersinia pestis разработана «Тест-система иммуноферментная для детекции чумного микроба моноклональная (ИФАПестФ1-М)», которая характеризуется высокой специфичностью и позволяет выявлять капсулосодержащие штаммы возбудителя чумы в образцах биологического материала и проводить идентификацию чистых культур с чувствительностью 5 105-1106 м.к./мл. Она не уступает по основным параметрам препарату сравнения «иммуноглобулинам диагностическим чумным флуоресцирующим адсорбированным лошадиным», лиофилизату для диагностических целей, производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб», обладая при этом такими преимуществами, как объективный учет результатов анализа и возможность их документирования. Диагностическая моноклональная тест-система (ИФАПестФ1-М) зарегистрирована в Росздравнадзоре № РЗН 2013/711 от 31.05.2013 г. в соответствии с приказом № 2161-Пр. 113 от 31.05.2013 г. и допущена к обращению на территории Российской Федерации.
Ключевые слова: Yersinia pestis, капсульный антиген Ф1, моноклональные антитела, диагностическая тест-система, иммуноферментный анализ, иммунодиагностика.
Корреспондирующий автор: Девдариани Зураб Леванович, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Z.L.Devdariani, N.A.Syrova, E.A.Mikheeva, I.V.Terekhova, N.M.Ermakov, G.V.Grigor'eva, O.A.Lobovikova, I.V.Shul'gina
Construction and Medical Trials of Monoclonal Immuno-Enzyme Test-System for the Detection of Encapsulated Plague Agent Strains, "EIAPESTF1-M"
Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe", Saratov, Russian Federation
Objective of the study was to develop and then conduct medical trials of the "Monoclonal immune-enzyme test-system for the detection of plague agent ("EIAPESTF1-M"). Materials and methods. Utilized were materials for carrying out sandwich EIA. MCA 1B3 to Y. pestis F1 served as diagnostic immune-reagent. To determine sensitivity and specificity of the designed immune-enzyme test-system, investigated were samples of 24 natural and genetically modified pFra+ and pFra- Y. pestis strains and 56 strains of heterologous bacteria Enterobacteriaceae family. Results and conclusions. Based on monoclonal antibodies to Yersinia pestis capsular antigen, constructed was "Monoclonal immune-enzyme test-system for the detection of plague agent ("EIAPESTF1-M"), which is characterized by high specificity and allows for the detection of encapsulated plague agent strains in biological samples and for identification of pure cultures with sensitivity of 5 105 - 1 106 mc/ml. It is highly competitive with comparator drug - "Diagnostic fluorescent absorbed equine plague immunoglobulins", lyophilizate for diagnostic purposes, by RusRAPI "Microbe". It possesses such advantages as objective result recording and capability of result documentation. "EIAPESTF1-M" is registered in the RF Federal Service for Surveillance in the Sphere of Healthcare and Social Development, reference No 2013/711, dated 31.05.2013 and approved for use in the territory of the Russian Federation.
Key words: Yersinia pestis, capsular antigen F1, monoclonal antibodies, diagnostic test-system, enzyme immune-assay, immuno-diagnostics.
Conflict of interest: The authors declare no conflict of interest.
Corresponding author: Zurab L. Devdariani, e-mail: rusrapi@microbe.ru.
Citation: Devdariani Z.L., Syrova N.A., Mikheeva E.A., Terekhova I.V., Ermakov N.M., Grigor'eva G.V., Lobovikova O.A., Shul'gina I.V. Construction and Medical Trials of Monoclonal Immuno-Enzyme Test-System for the Detection of Encapsulated Plague Agent Strains, "EIAPESTF1-M". Problemy Osobo Opasnykh Infektsii [Problems of Particularly Dangerous Infections]. 2016; 3:85-89. (In Russ.). DOI: 10.21055/0370-1069-2016-3-85-89
На территории стран Содружества Независимых Государств действует 42 природных очага чумы, расположенных в равнинных и горных ландшафтах
Кавказа и Закавказья, Северо-Западного и Северного Прикаспия, Средней Азии, Сибири и характеризующихся различной биоценотической, эпизоотической
и эпидемической активностью [2, 4]. В настоящее время сохраняется напряженная эпидемиологическая обстановка и неблагоприятный прогноз эпизоотической ситуации в очагах Северо-Западного Прикаспия и Сибири [6]. Чума в природных очагах регистрируется в виде спорадических случаев или разлитых эпизоотий в популяциях диких грызунов, как правило, основных носителей. в эпизоотический процесс могут вовлекаться также второстепенные и случайные носители из числа диких животных и синантропных грызунов [5], при этом возможно заражение чумой человека [3].
В связи с вышеизложенным по-прежнему актуальной остается разработка новых препаратов для детекции Yersiniapestis. Особый интерес представляет конструирование иммуноферментных тест-систем на основе моноклональных антител (МКА), которые, благодаря своей способности к взаимодействию с уникальным диагностически значимым эпитопом поверхностно расположенного бактериального антигена, обеспечивают строгую специфичность моно-клональных диагностикумов [7, 8].
Отсутствие в Российской Федерации современных эффективных иммунодиагностических препаратов для обнаружения возбудителя чумы при проведении эпизоотологического обследования природных очагов этой инфекции предопределило цель данного исследования по разработке и внедрению в практику здравоохранения диагностической иммунофермент-ной тест-системы, основу которой составили моно-клональные антитела к капсульному антигену (Ф1) Y pestis.
Материалы и методы
В сконструированной тест-системе реализован сэндвич-вариант ИФА. Для сенсибилизации полистироловых планшетов отечественного производства (медполимер, россия), использованных в качестве твердой фазы, применяли МКА 1В3 к Ф1 Y рestis, выделенные методом высаливания [8] из асцитиче-ских жидкостей зараженных гибридомой Y. рest 1В3 мышей инбредной линии BALB/c в концентрации 10 мкг/мл. Свободные сайты на пластике блокировали 0,5 % раствором молока обезжиренного сухо-го( ГОСТ 10970-87). Капсульный антиген чумного микроба, содержащийся в исследуемом материале, после связывания с моноклональными иммуноглобулинами проявляли при помощи МКА 1В3, конъю-гированных с пероксидазой хрена перйодатным методом [8], в рабочем разведении. Положительным контрольным образцом (ПКО-ЧМ) служила инакти-вированная сухая взвесь Y pestis EV в концентрации 1109 м.к./мл.
В отрицательный контроль вносили фосфатно-солевой буферный раствор.
Высушивание пероксидазного конъюгата и ПКО-ЧМ осуществляли с использованием центрифуги-концентратора CentriVap 7310030 (Labconco, США)
при температуре 4 °С, скорости вращения ротора 1425 об/мин и давлении 110-4 торр. В качестве стабилизатора к препаратам добавляли 3 % сахарозы. После высушивания активность препаратов определяли в непрямом ИФА.
Хромогенным субстратом в ИФА служил 2,2'-azino-bis-(3-ethylbenzthiazoline-6-sulfonic acid), diam-monium salt (ABTS) (Sigma, США).
На этапах разработки тест-системы ИФАПестФ1-М исследовали образцы инактивиро-ванных микробных взвесей 24 природных и генетически модифицированных pFra+ и pFra- штаммов Y pestis, а также 56 штаммов гетерологичных бактерий семейства Enterobacteriaceae в различных концентрациях, смешанные культуры бактерий, а также искусственно контаминированный указанными микроорганизмами биологический материал (сыворотки крови человека, суспензии внутренних органов лабораторных аутбредных мышей). работу с патогенными бактериями и обеззараживание биологического материала проводили в соответствии с СП 1.3.3118-13 «Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп патогенности (опасности)» [1].
При проведении медицинских испытаний тест-системы использовали инактивированные чистые культуры 24 штаммов Y. pestis в концентрации 1107, 1106и 1105 м.к./мл (всего 72 образца), чистые культуры гетерологичных микроорганизмов в концентрации 1109 м.к./мл, включая Yersinia pseudotuberculosis, Y. enterocolitica, Francisella tularensis, Escherichia. coli, Salmonella typhimurium, S. typhi, Shigella flexneri,S. sonnei (20 образцов), пробы сыворотки крови человека, контаминированной Y. pes-tis (21 образец), пробы сыворотки крови человека, контаминированной гетерологичными микроорганизмами (10 образцов), суспензии внутренних органов мышей, контаминированные Y. pestis (21 образец), суспензии внутренних органов мышей, контаминированные гетерологичными бактериями (9 образцов).
Все виды материала тестировали с применением экспериментальных серий тест-системы, приготовленных ex tempore, а также хранившихся в течение шести месяцев.
Учет результатов анализа осуществляли визуально и спектрофотометрически с использованием мультиканального фотометра «Multiskan ЕХ» (Китай) при длине волны 405 нм. Результат анализа считали положительным, если показатель оптической плотности опытного образца (ОП)обр в 2 или более раз превышал показатель оптической плотности контрольного образца (К)обр.
В качестве препарата сравнения при проведении медицинских испытаний использовали «Иммуноглобулины диагностические чумные флуоресцирующие адсорбированные лошадиные, лио-филизат для диагностических целей, производства ФКУЗ РосНИПЧИ «Микроб» Роспотребнадзора (серия 110). Подготовку и исследование материала про-
водили в соответствии с инструкцией по применению иммуноглобулинов. Окрашенные мазки просматривали под люминесцентным микроскопом Primo Star iLED (Carl Zeiss, Германия) с использованием иммерсионного масла. Учет результатов осуществляли визуально по четырехкрестовой системе.
Результаты и обсуждение
Иммунореагентную основу тест-системы «ИФАПестФ1-М» составили МКА к диагностически значимому антигену Y рestis - Ф1 [5, 10], что обеспечило специфичность и стандартность разработанно-
Таблица 1
Результаты исследования проб биологического материала, контаминированного различными штаммами К рех^, с использованием тест-системы иммуноферментной для детекции чумного микроба моноклональной (ИФАПестФ1-М)
Концентра- Серия 02 Серия 03
Вид биологического Штамм, использованный ция микроорганизмов в образце (м.к./мл) ОПср (К )Х2/ ОП (К+) ОП образцов Оценка ОПср (К )Х2 / ОП (К+) ОП образцов Оценка
ОП1/ОП2/ОПобр результата ОП1/ОП2/ОПобр результата
Сыворотка Y. pestis A-1108 (pFra+) 1107 0,081/1,503 0,675/0,669/0,672 Полож. 0,081/1,448 0,661/0,662/0,662 Полож.
крови человека « 1106 « 0,535/0,526/0,531 Полож. « 0,541/0,537/0,539 Полож.
« 1105 « 0,042/0,039/0,041 Отр. « 0,042/0,039/0,041 Отр.
Y pestis 231 (pFra+) 1107 « 0,655/0,721/0,688 Полож. « 0,652/0,730/0,691 Полож.
« 1106 « 0,502/0,592/0,547 Полож. « 0,504/0,587/0,546 Полож.
« 1105 « 0,053/0,041/0,047 Отр. « 0,053/0,042/0,048 Отр.
Y. pestis 2377 (pFra+) 1107 « 0,709/0,606/0,658 Полож. « 0,708/0,586/0,647 Полож.
« 1106 « 0,614/0,483/0,549 Полож. « 0,619/0,487/0,553 Полож.
« 1105 « 0,042/0,039/0,041 Отр. « 0,043/0,039/0,041 Отр.
Y. pestis KM-225 (pFra+) 1107 « 0,822/0,733/0,778 Полож. « 0,817/0,737/0,777 Полож.
« 1106 « 0,595/0,537/0,566 Полож. « 0,586/0,543/0,565 Полож.
« 1105 « 0,039/0,044/0,042 Отр. « 0,039/0,044/0,042 Отр.
Y pestis И-3131 (pFra+) 1107 « 0,673/0,649/0,661 Полож. « 0,673/0,651/0,662 Полож.
« 1106 « 0,463/0,585/0,524 Полож. « 0,463/0,546/0,505 Полож.
« 1105 « 0,041/0,050/0,046 Отр. « 0,042/0,050/0,046 Отр.
Y pestis И-3358 (pFra+) 1107 0,074/1,952 0,556/0,522/0,539 Полож. 0,075/1,991 0,582/0,550/0,566 Полож.
« 1106 « 0,398/0,522/0,460 Полож. « 0,407/0,557/0,482 Полож.
« 1105 « 0,042/0,038/0,040 Отр. « 0,042/0,038/0,040 Отр.
Y. pestis M-570 (pFra+) 1107 « 0,454/0,491/0,473 Полож. « 0,482/0,517/0,500 Полож.
« 1106 « 0,396/0,347/0,372 Полож. « 0,416/0,364/0,390 Полож.
« 1105 « 0,040/0,038/0,039 Отр. « 0,040/0,039/0,040 Отр.
Суспензия Y pestis EV НИИЭГ (pFra+) 1107 « 0,808/0,869/0,839 Полож. « 0,840/0,900/0,870 Полож.
внутренних органов мышей « 1106 « 0,362/0,407/0,386 Полож. « 0,378/0,422/0,400 Полож.
« 1105 « 0,081/0,094/0,088 Полож. « 0,085/0,103/0,094 Полож.
Y. pestis M-1814 (pFra+) 1107 « 0,867/0,824/0,846 Полож. « 0,903/0,861/0,882 Полож.
« 1106 « 0,371/0,393/0,382 Полож. « 0,392/0,405/0,399 Полож.
« 1105 « 0,080/0,074/0,077 Полож. « 0,082/0,077/0,080 Полож.
Y pestis A-1122 (pFra+) 1107 « 0,784/0,961/0,873 Полож. « 0,810/1,002/0,906 Полож.
« 1106 « 0,359/0,456/0,408 Полож. « 0,373/0,473/0,423 Полож.
« 1105 « 0,075/0,087/0,081 Полож. « 0,077/0,089/0,083 Полож.
Y pestis И-3131 (pFra+) 1107 « 0,907/0,859/0,883 Полож. « 0,943/0,894/0,919 Полож.
« 1106 « 0,428/0,384/0,406 Полож. « 0,444/0,396/0,420 Полож.
« 1105 « 0,075/0,072/0,074 Отр. « 0,078/0,076/0,077 Полож.
Y pestis И-3358 (pFra+) 1107 « 0,828/0,827/0,828 Полож. « 0,859/0,874/0,867 Полож.
« 1106 « 0,391/0,370/0,381 Полож. « 0,405/0,395/0,400 Полож.
« 1105 « 0,074/0,069/0,072 Отр. « 0,077/0,074/0,076 Полож.
Y. pestis M-570 (pFra+) 1107 « 0,675/0,789/0,732 Полож. « 0,690/0,816/0,753 Полож.
« 1106 « 0,382/0,398/0,390 Полож. « 0,402/0,417/0,410 Полож.
« 1105 « 0,075/0,079/0,077 Полож. « 0,078/0,081/0,080 Полож.
Y. pestis C-358 (pFra+) 1107 « 0,820/0,811/0,816 Полож. « 0,855/0,834/0,845 Полож.
« 1106 « 0,344/0,358/0,351 Полож. « 0,361/0,375/0,368 Полож.
« 1105 « 0,073/0,073/0,073 Отр. « 0,076/0,076/0,076 Полож.
Примечания: ОП1 - оптическая плотность в 1-й лунке; ОП2 - оптическая плотность во 2-й лунке; ОПобр - среднее арефметическое значение двух лунок с одинаковым образцом.; ОПср(К-) - среднее арефметическое значение в лунках с отрицательным контрольным образцом; ОП (К+) - значение оптической плотности в лунках с положительным контролем.
го препарата.
На первом этапе исследований тест-систему «ИФАПестФ1-М» применяли для тестирования чистых культур микроорганизмов. Из 24 штаммов У рestis 23 культуры (95,8 %) выявлены в минимальной концентрации 1106 м.к./мл; лишь 1 штамм (У. pestis 2377 (pFra+) (4,2 %) обнаружен в более низкой концентрации - 1105 м.к./мл. В связи с этим в последующих экспериментах У рestis использовали в трех концентрациях - 1105, 1106 и 1107 м.к./мл. ни с одним из тестированных штаммов гетерологич-ных бактерий взаимодействия не зарегистрировано, что подтверждает высокую специфичностью МКА 1В3, полученных к капсульному антигену чумного микроба.
при исследовании смешанных культур и искусственно контаминированного биологического материала с помощью тест-системы «ИФАПестФ1-М» показатель чувствительности совпадал с таковым при тестировании чистых культур. Положительная реакция отмечалась только с пробами, содержащими pFra+ штаммы У рestis.
С целью увеличения стабильности и срока хранения моноклонального чумного конъюгата и ПКО-ЧМ после проведения предварительных исследований с жидкими формами названных реагентов осуществляли их высушивание под вакуумом, используя методику, предложенную нами ранее [7]. оказалось, что реакционноспособность пко-чм после высушивания сохранялась. В то же время активность конъюгата снижалась в среднем на 20 %, что нередко отмечается при высушивании белковых препаратов [9]. Изменения активности высушенных форм реагентов в течение срока наблюдения (6 месяцев) не происходило, что позволило сделать вывод о приемлемости включения их в состав тест-системы «ИФАПестФ1-М».
следующим этапом стало изучение стабильности скомпонованной тест-системы при хранении. Результаты тестирования образцов, аналогичных вышеописанным, с использованием экспериментальных серий тест-систем, хранившихся в течение 3 и 6 месяцев, полностью коррелировали с таковыми, полученными при применении реагентов, приготовленных непосредственно перед постановкой ИФА. Это свидетельствовало о стабильности разработанного диагностикума в течение срока наблюдения.
при проведении медицинских испытаний использовали 2 серии (02 и 03) набора реагентов «Тест-система иммуноферментная для детекции чумного микроба моноклональная (ИФАПестФ1-М)». Всего исследовано 153 образца чистых культур микроорганизмов и контаминированного биоматериала.
Установлено, что тест-система «ИФАПестФ1-М» позволяет выявлять капсулосодержащие штаммы чумного микроба в чистых культурах и биологическом материале от людей и животных в минимальной концентрации 5 105-1106 м.к./мл при отрицательной реакции с гетерологичными бактериями. чумной ми-
кроб выявлен в концентрации 1106 м.к./мл в 100 % случаев, а в концентрации 1105 м.к./мл - в 8,3.
При испытании тест-системы «ИФАПестФ1-М» серий 02 и 03 отмечалось допустимое расхождение среди положительных результатов в 2,0 % случаев, преимущественно при исследовании биологического материала (таблица). расхождения по отрицательным результатам не было. Тест-система «ИФАПестФ1-М», не уступая по основным параметрам препарату сравнения, обладала такими несомненными преимуществами как отсутствие субъективности учета реакции и возможность документирования результатов анализа.
Разработанный набор реагентов «Тест-система иммуноферментная для детекции чумного микроба моноклональная (ИФАПестФ1-М)» зарегистрирован в Росздравнадзоре № РЗН 2013/711 от 31.05.2013 и допущен к обращению на территории Российской Федерации.
конфликт интересов. Авторы подтверждают отсутствие конфликта финансовых/нефинансовых интересов, связанных с написанием статьи.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Безопасность работы с микроорганизмами I—II групп па-тогенности (опасности). СП 1.3.3118-13. М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора; 2014. 195 с.
2. Бурделов Л.А., редактор. Атлас распространения особо опасных инфекций в Республике Казахстан. Алматы; 2012. 232 с.
3. Кутырев В.В., Попова А.Ю., Ежлова Е.Б., Демина Ю.В., Пакскина Н.Д., Щучинов Л.В., Михайлов Е.П., Мищенко А.И., Рождественский Е.Н., Базарова Г.Х., Денисов А.В., Шарова И.Н., Попов Н.В., Кузнецов А.А. Заболевание человека чумой в ГорноАлтайском высокогорном природном очаге в 2014 г. Сообщение 1. Эпидемиологические и эпизоотологические особенности проявлений чумы в в горно-Алтайском высокогорном природном очаге чумы. Пробл. особо опасных инф. 2014; 4:9-16.
4. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Природные очаги чумы Кавказа, Шикаспия, Средней Азии и Сибири. М.: ОАО «Издательство «Медицина»; 2004. 192 с.
5. Онищенко Г.Г., Кутырев В.В., редакторы. Лабораторная диагностика опасных инфекционных болезней. М.: ЗАО «Шико»; 2013. 560 с.
6. Попов Н.В., Безсмертный В.Е., Матросов А.Н., Князева Т.В., Кузнецов А.А., Федоров Ю.М., Попов В.П., Вержуцкий Д.Б., Корзун В.М., Чипанин Е.В., Дубянский В.М., Малецкая О.В., Григорьев М.П., Балахонов С.В., Куличенко А.Н., Кутырев В.В. Эпизоотическая активность природных очагов чумы РФ в 2014 г. и прогноз на 2015 г. Пробл. особо опасных инф. 2015; 1:10-7.
7. Терешкина Н.Е., Терехова И.В., Сырова Н.А., Девдариани З.Л., Ляшова О.Ю., Григорьева Г.В., Лобовикова О.А., Шульгина И.В., Иваненко И.Л., Захарова Н.Б., Безрукова Г.А., Спирин В.Ф. Конструирование и медицинские испытания моноклональной дот-иммуноферментной тест-системы для детекции туляремий-ного микроба «ДИАТул-М». Пробл. особо опасных инф. 2013; 2:42-5.
8. Фримель Г., редактор. Иммунологические методы. М.: Медицина; 1987. 472 с.
9. Abdul-Fattah A.M., Kalonia D.S., Pikal M.J. The Challenge of drying method selection for protein pharmaceuticals: product quality implication. J. Pharm. Sci. 2007; 96(8):1886-916. DOI: 10.1002/ jps.20842.
10. Butler T. Plague into the 21st century. Clin. Infect. Dis. 2009; 49(5):736-42. DOI: 10.1086/604718.
References
1. [Safety of work with microorganisms of the I-II groups of pathogenicity (hazard)]. SR 1.3.3118-13. M.: Federal Center of Hygiene and Epidemiology ofthe Rospotrebnadzor; 2014. 195 p.
2. Burdelov L.A., editor. [Atlas of Dissemination of Particularly Dangerous Infections in the Republic of Kazakhstan]. Amaty; 2012. 232 p.
3. Kutyrev V.V., Popova A.Yu., Ezhlova E.B., Demina Yu.V., Pakskina N.D., Shchuchinov L.V., Mikhailov E.P., Mishchenko A.I., Rozhdestvensky
E.N., Bazarova G.Kh., Denisov A.V., Sharova I.N., Popov N.V., Kuznetsov A.A. [Infection of an individual with plague in the Gorno-Altaisk highmountain natural focus in 2014. Communication 1. Epidemiological and epizootiological peculiarities of plague manifestations in the Gorno-Altaisk high-mountain (Sailyugemsky) natural plague focus]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2014; 4:9-16.
4. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Natural Plague Foci in the territory of the Caucasus, Caspian-Sea Region, Central Asia and Siberia]. M.: Meditsina; 2004. 192 p.
5. Onishchenko G.G., Kutyrev V.V., editors. [Laboratory Diagnostics of Dangerous Infectious Diseases]. M.: "Shiko"; 2013. 560 p.
6. Popov N.V., Bezsmertny V.E., Matrosov A.N., Knyazeva T.V., Kuznetsov A.A., Fedorov Yu.M., Popov V.P., Verzhutsky D.B., Korzun V.M., Chipanin E.V., Dubyansky V.M., Maletskaya O.V., Grigor'ev M.P., Balakhonov S.V., Kulichenko A.N., Kutyrev V.V. [Epizootic activity of natural plague foci in the territory of the Russian Federation in 2014 and prognosis for 2015]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2015; 1:10-7.
7. Tereshkina N.E., Terekhova I.V., Syrova N.A., Devdariani Z.L., Lyashova O.Yu., Grigor'eva G.V., Lobovikova O.A., Shul'gina I.V., Ivanenko I.L., Zakharova N.B., Bezrukova G.A., Spirin V.F. [Constructing and medical trials of a monoclonal dot-immuno-enzyme test-system "DIATul-M" for tularemia microbe detection]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2013; 2:42-5.
8. Frimel G., editor. [Immunological Methods]. M.: Meditsina; 1987.
472 p.
9. Abdul-Fattah A.M., Kalonia D.S., Pikal M.J. The Challenge of drying method selection for protein pharmaceuticals: product quality implication. J. Pharm. Sci. 2007; 96(8):1886-916. DOI: 10.1002/jps.20842.
10. Butler T. Plague into the 21st century. Clin. Infect. Dis. 2009; 49(5):736-42. DOI: 10.1086/604718.
Authors:
Devdariani Z.L., Syrova N.A., Mikheeva E.A., Terekhova I.V., Ermakov N.M., Grigor'eva G.V., Lobovikova O.A., Shul'gina I.V. Russian Research Anti-Plague Institute "Microbe". 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru
об авторах:
ДевдарианиЗ.Л., СыроваН.А., МихееваЕ.А., ТереховаИ.В., Ермаков Н.М., Григорьева Г.В., Лобовикова О.А., Шульгина И.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Поступила 13.01.16.
