CC BY
34
УДК 616.993
Н.Е.Терешкина1, И.В.Терехова1, Н.А.Сырова1, З.Л.Девдариани1, О.Ю.Ляшова1, Г.В.Григорьева1, О.А.Лобовикова1, И.В.Шульгина1, И.Л.Иваненко2, Н.Б.Захарова2, Г.А.Безрукова3, В.Ф.Спирин3
КОНСТРУИРОВАНИЕ И МЕДИЦИНСКИЕ ИСПЫТАНИЯ МОНОКЛОНАЛЬНОЙ ДОТ-ИММУНОФЕРМЕНТНОЙ ТЕСТ-СИСТЕМЫ ДЛЯ ДЕТЕКЦИИ ТУЛЯРЕМИЙНОГО МИКРОБА
«ДИАТУЛ-М»
гФКУЗ «Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб», Саратов, Российская Федерация; 2Центральная научно-исследовательская лаборатория ГБОУ ВПО «Саратовский государственный медицинский университет им. В.И.Разумовского», Саратов, Российская Федерация; 3ФБУН «Саратовский научно-исследовательский институт сельской гигиены», Саратов, Российская Федерация
На основе моноклональных антител к липополисахариду Francisella tularensis разработана дот-иммуноферментная тест-система для детекции туляремийного микроба «ДИАТул-М». При анализе чистых инактивированных культур 17 штаммов туляремийного микроба разных подвидов и 78 штаммов гетерологич-ных бактерий, а также контаминированных ими проб плазмы крови, сыворотки крови людей, суспензий органов лабораторных мышей, почвы и воды тест-система «ДИАТул-М» характеризовалась высокой специфичностью в отношении возбудителя туляремии. С микробными клетками гетерологичных бактерий даже в высокой концентрации (1-109 м.к./мл) регистрировалась отрицательная реакция. Чувствительность диагностикума составила 1-5-106 м.к./мл. Тест-система обеспечивала получение стабильных результатов после хранения в течение 6 месяцев (срок наблюдения). Медицинские испытания набора реагентов «Тест-система дот-иммуноферментная для детекции туляремийного микроба моноклональная» продемонстрировали перспективность его внедрения в практику российского здравоохранения с возможностью использования как в стационарных, так и в полевых условиях.
Ключевые слова: Francisella tularensis, моноклональные антитела, дот-иммуноанализ, иммунодиагностика.
N.E.Tereshkina1, LV.Terekhova1, N.A.SyrovaJ, Z.L.Devdariani1, O.Yu.Lyashova1, G.V.Grigor’eva1, O.A.Lobovikova1, LV.Shul’gina1, I.L.Ivanenko2, N.B.Zakharova2, G.A.Bezrukova3, V.F.Spirin3
Constructing and Medical Trials of a Monoclonal Dot-Immuno-Enzyme Test-System “DIATul-M” for Tularemia Microbe Detection
Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”, Saratov, Russian Federation; 2Central Research Laboratory at the Saratov Razumovsky State Medical University, Saratov, Russian Federation; 3Saratov Research Institute of Rural Hygiene, Saratov, Russian Federation
Using monoclonal antibodies to Francisella tularensis lipopolysaccharide, designed is a dot-blot immune-enzyme test-system “DIATul-M” for tularemia microbe detection. Its specificity has been tested on 17 strains of tularemia microbe, 78 strains of heterologous bacteria, infected blood plasma samples, human blood sera, suspensions obtained from laboratory mice organs, and soil and water samples. This test system has turned out to be highly specific. “Negative” reaction has been registered even with highly concentrated heterologous bacteria microbial cells - 1109 mc/ml. Sensitivity of the diagnosticum is 1—5106 mc/ml. Additionally, this test-system has been proving for acquisition of sustainable results after 6 months of storing (the observation period). Medical trials of the panel of reagents “Monoclonal dot-immuno-enzyme test-system for tularemia microbe detection” have shown it to be a prospective preparation for implementation into the national healthcare practices both under stationary and field conditions.
Key words: Francisella tularensis, monoclonal antibodies, dot immune-enzyme assay, immunodiagnostics.
Несмотря на значительные успехи, достигнутые в области лабораторной диагностики туляремии, создание новых препаратов для детекции Francisella Ш-larensis, в том числе на основе иммуноферментного анализа (ИФА), не утрачивает актуальности [4].
В нашей стране зарегистрирован набор реагентов «Тест-система диагностическая для выявления возбудителя туляремии в иммуноферментном анализе (ИФА) (ИфА-Тул-СтавНИПЧИ» (производства ФКУЗ «Ставропольский научно-исследовательский противочумный институт»), в котором реализуется классический вариант ИФА с использованием специфических поликлональных антител. Тем не менее, разработка альтернативных вариантов ИФА тест-систем представляет значительный практический ин-
терес. Так, дот-вариант иммуноферментного анализа (ДИА), отличающийся от твердофазного ИФА на по-листироловых планшетах большей экспрессностью, экономичностью в отношении расхода реагентов, простотой постановки и учета результатов, является весьма эффективным и удобным диагностическим методом.
Важный аспект конструирования современных диагностических препаратов - замена поликлональных иммунореагентов моноклональными, которые можно получить в виде стандартного чистого химического реагента и в практически нелимитированном количестве [3, 8]. Тест-системы на основе моноклональных антител (МКА) приобретают особую ценность в связи со способностью последних вступать
во взаимодействие с уникальным диагностически значимым эпитопом поверхностно расположенного бактериального антигена, что обеспечивает строгую специфичность моноклональных препаратов [3].
Целью настоящего исследования явилась разработка «Тест-системы моноклональной дот-иммуноферментной для детекции туляремийного микроба (ДИЛТул-M)», предназначенной для выявления F. tularensis в биологическом материале и объектах окружающей среды в сэндвич-варианте ,fl^A.
Материалы и методы
В качестве твердой фазы в разработанной тест-системе были использованы фильтры мембранные нитроцеллюлозные ^MH^ с диаметром пор 0,2 мкм («Владисарт», Россия). ФMHЦ сенсибилизировали MKA 1D6 к липополисахариду (ЛПC) F. tularensis 15 HИИЭГ, выделенными методом высаливания [5] из асцитических жидкостей зараженных гибридомой F.tul.1D6 мышей инбредной линии BALB/c, в концентрации 10 мкг/мл. Для блокировки свободных сайтов ФMHЦ применяли 0,5 % раствор сухого обезжиренного молока. В готовый набор реагентов вкладывали предварительно сенсибилизированный и блокированный ФMHЦ.
Образцы материала, содержащего микробные клетки F. tularensis и других бактерий, наносили на ФMHЦ в объеме 2 мкл и инкубировали во влажной камере при температуре 37 °C в течение 30 мин. В качестве положительного контрольного образца (ПКО-TM) использовали взвесь F. tularensis 15 HИИЭГ в концентрации 1-109 м.к./мл, а в качестве отрицательного контроля - 2 мкл фосфатно-солевого буферного раствора (ФCБР).
Cпецифический комплекс антиген-антитело выявляли при помощи MKA 1D6, конъюгированных с пероксидазой хрена перйодатным методом [2], в рабочем разведении. Хромогенным субстратом служил 3,3'-диаминобензидин («Sigma», Германия).
При постановке ДИЛ были использованы инактивированные микробные взвеси 17 штаммов F. tularensis и 78 штаммов гетерологичных бактерий (Brucella, Yersinia, Salmonella, Shigella, Vibrio chol-erae, Escherichia coli). Для приготовления смешанных культур бактерий использовали взвеси Yersinia enterocolitica 480, Yersinia pestis EV HИИЭГ, Yersinia pseudotuberculosis II, Brucella abortus 19 ВA, Vibrio cholerae О139 Р16064 в концентрации 1-109 м.к./мл и F. tularensis M-S0 (природный вирулентный штамм, подвид holarctica) в концентрациях 1 • 10б, 5-10б и
1-107 м.к./мл.
Биологическими пробами служили образцы плазмы крови человека, сыворотки крови человека и органов (печени и селезенки) мыши линии BALB/с, объектами окружающей среды - пробы почвы и воды из открытых водоемов. Приготовленные разведения образцов контаминировали F. tularensis M-S0 в концентрациях 1 • 10б, 5-10б и 1-107 м.к./мл и гетерологич-
ными бактериями в концентрации 1-109 м.к./мл. В качестве отрицательного контроля был использован соответствующий неконтаминированный материал.
Mоноклонaльный туляремийный конъюгат и ПKО-TM высушивали под вакуумом с использованием центрифуги-концентратора CentriVap 7310030 (Labconco, COA) при температуре 4 °C, скорости вращения ротора 1425 об/мин и давлении 1 • 10-4 торр. В качестве стабилизатора к препаратам добавляли 3 % сахарозы. Aктивность конъюгата до и после высушивания, а также в процессе хранения контролировали постановкой прямого ИФA, а ПKО-TM -сэндвич-ДИД.
Все виды материала тестировали с применением экспериментальных серий тест-системы приготовленных ex tempore, а также хранившихся в течение 3 и б мес.
Учет результатов проводили визуально после высыхания ФMHЦ по наличию или отсутствию на ней окрашенного пятна специфической реакции. Интенсивность окрашивания оценивали в «крестах» по специально разработанной цветовой шкале. За положительный результат принимали окрашивание на
2-4 «креста».
При проведении медицинских испытаний были использованы 2 серии (07 и 08) набора реагентов «Тест-система дот-иммуноферментная для детекции туляремийного микроба моноклональная (ДИATyл-M)», а также набор сравнения «ИФA-Tyл-CтaвHИПЧИ». Всего было исследовано 160 образцов чистых культур микроорганизмов, а также биоматериала, проб почвы и воды, контаминированных различными штаммами F. tularensis и гетерологичных бактерий.
Результаты и обсуждение
Базовыми иммунореагентами тест-системы «^HAT^^-M» являются MKA к основному диагностически значимому антигену F. tularensis - ЛПC [1], что обеспечивает специфичность и стандартность разработанного препарата.
Первоначально тест-систему «ДИATyл-M» применяли для тестирования чистых культур микроорганизмов. Из 17 использованных в работе штаммов F. tularensis 13 культур (7б,5 %) выявлялись в минимальной концентрации - 5^10б м.к./мл, а 3 штамма (17,6 %) - Ы0б м.к./мл (рисунок). В более низких концентрациях туляремийный микроб не обнаруживался, поэтому в последующих экспериментах F. tularensis использовали в 3 концентрациях - 1 • 10б, 5-10б и 1-107 м.к./мл. Из тестированных штаммов бактерий, относящихся к виду F. tularensis, не зарегистрировано взаимодействия только со штаммом F. tularensis novicida Utah 112. Этот феномен обусловлен, по-видимому, отсутствием в молекуле ЛПC этого микроорганизма эпитопа, комплементарного MKA 1D6, поскольку данное MKA было получено к ЛПC F. tularensis подвида holarctica, который отлича-
Рис. 1. Исследование в сэндвич-варианте ДИА на основе ЫКА к ЛЖ туляремийного микроба инактивированных чистых культур Francisella tularensis 15 НИИЭГ (1), M-80 (2), M-113 (3), M-498 (4), M-157 (5), А-179 (6), А-61 (7), В-300 (8), Е-261 (9), И-281 (10), И-328 (11), О-328 (12), KF (13), 38 (14), 74 (15), Kosho (16), Utah 112 (17) в концентрации 1107 (столбец a), 5-106 (столбец b), 1 • 106 (столбец c) и 5105 (столбец d) м.к./мл; положительный контроль - ПКО^ (18), отрицательный контроль - ФCБР (19)
ется от подвида novicida структурой О-антигена [7]. С микробными клетками гетерологичных бактерий регистрировалась отрицательная реакция.
При исследовании смешанных культур, а также искусственно контаминированного биологического материала, проб почвы и воды с помощью тест-системы «ДИАТул-М» показатель чувствительности совпадал с таковым при тестировании чистых культур. В пределах установленной чувствительности разработанный диагностикум обладал строгой специфичностью, поскольку положительная реакция отмечалась только с пробами, содержащими туляре-мийный микроб.
Для увеличения стабильности и срока хранения биологических субстанций широко используют различные способы приготовления их твердых форм [6], поэтому, после проведения предварительных исследований с жидкими моноклональным туляремийным конъюгатом и ПКО-ТМ, осуществляли их высушивание под вакуумом. Оказалось, что реакционноспо-собность ПКО-ТМ после высушивания сохранялась. В то же время активность конъюгата снижалась в среднем на 27 %, что нередко отмечается при высушивании белковых препаратов [6]. В течение срока наблюдения (6 мес.) активность высушенных форм реагентов не изменялась, что позволило прийти к заключению о приемлемости включения их в состав тест-системы «ДИАТул-М».
На следующем этапе исследования изучали стабильность скомпонованной тест-системы при хранении. Результаты тестирования проб, аналогичных вышеописанным, с использованием экспериментальных серий тест-систем, хранившихся в течение 3 и 6 мес., полностью коррелировали с таковыми, полученными при применении ФМНЦ и реагентов, приготовленных непосредственно перед постановкой ДИА, что указывало на стабильность препарата в течение срока наблюдения.
В ходе медицинских испытаний было установлено, что «Тест-система дот-иммуноферментная для детекции туляремийного микроба моноклональная
(ДИАТул-М)» позволяет выявлять туляремийный микроб в биологическом материале от людей и животных, в объектах окружающей среды и чистых культурах в минимальной концентрации 1—5• 106 м.к./ мл при отрицательной реакции с гетерологичными бактериями. При этом туляремийный микроб был выявлен в концентрации 5-106 м.к./мл в 100 % случаев, а в концентрации Ы06 м.к./мл - в 6,25 %. При испытании тест-системы «ДИАТул-М» серий 07 и 08 отмечалось допустимое расхождение среди положительных результатов в 7,5-12,5 % случаев в пределах 1 «креста». Расхождения по отрицательным результатам не было.
Не уступая по основным параметрам набору сравнения, тест-система «ДИАТул-М» существенно превосходила его по экономичности расхода реагентов и экспрессности (продолжительность проведения ДИА при анализе 80 образцов была более чем в 2 раза меньше, чем ИФА). Эти преимущества обусловлены выбором для конструирования диагностического препарата точечного варианта ИФА, для которого характерна высокая скорость иммунохими-ческих реакций с использованием микрообъемов ингредиентов для их реализации.
Полученные данные свидетельствуют о перспективности внедрения разработанного набора реагентов «Тест-система дот-иммуноферментная для детекции туляремийного микроба моноклональная (ДИАТул-М)» в практику российского здравоохранения как в стационарных, так и в полевых условиях за счет возможности визуальной оценки результатов анализа без приборного обеспечения.
Работа выполнена по государственному контракту N° 42-Д/1 от 29.06.2012 г. в рамках реализации федеральной целевой программы «Национальная система химической и биологической безопасности Российской Федерации (2009-2013 гг.)».
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Книрель Ю.А., Кочетков Н.К. Строение липопо-лисахаридов грамотрицательных бактерий. III. Структура О-специфических полисахаридов (Обзор). Биохимия. 1994; 59(12):1784-851.
2. Курманова Л.В., Ермолин Г.А., Эткин А.Ф., Цветков В.С. Получение специфических иммуноферментных конъюгатов против иммуноглобулинов классов А, G, М человека. Лаб. дело. 1984; 7:402-6.
3. Кэтти Д., редактор. Антитела. Методы. В 2-х кн. Т. 1. М.: Мир; 1991. 287 с.
4. Сырова Н.А., Терешкина Н.Е., Девдариани З.Л. Современное состояние иммунодиагностики туляремии. Пробл. особо опасных инф. 2008; 3(97):12-5.
5. Фримель Г., редактор. Иммунологические методы. М.: Медицина; 1987. 472 с.
6. Abdul-Fattah A.M., Kalonia D.S., PikalM.J. The Challenge of drying method selection for protein pharmaceuticals: product quality implication. J. Pharm. Sci. 2007; 96(8):1886-916.
7. Gunn J.S.,ErnstR.K. The structure and function ofFrancisella lipopolysaccharide. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1105:202-18.
8. Peruski A.H., Peruski L.F Jr. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003; 10(4):506-13.
References
1. Knirel’ Yu.A., Kochetkov N.K. [Gram-negative bacteria lipopolysaccharide morphology. III. O-specific polysaccharide structure (Review)]. Biokhimia. 1994; 59(12):1784-851.
2. Kurmanova L.V., Ermolin G.A., Etkin A.F., Tsvetkov VS. [Preparation of the specific immune-enzyme conjugates against human immunoglobulins -class A, G, M]. Lab. Delo. 1984; 7:402-6.
3. Ketti D., editor. [Antibodies. Methods]. Two volume book. Vol. I. M.: Mir; 1991. 287 p.
4. Syrova N.A., Tereshkina N.E., Devdariani Z.L. [Current state of tularemia immunodiagnostics]. Probl. Osobo Opasn. Infek. 2008; (97):12-5.
5. Frimel'G., editor. [Immunological Methods]. M.: Meditsina; 1987.
472 p.
6. Abdul-Fattah A.M., Kalonia D.S., Pikal MJ. The Challenge of drying method selection for protein pharmaceuticals: product quality implication. J. Pharm. Sci. 2007; 96(8):1886-916.
7. Gunn J.S., Ernst R.K. The structure and function of Francisella lipo-polysaccharide. Ann. N.Y. Acad. Sci. 2007; 1105:202-18.
8. Peruski A.H., Peruski L.F. Jr. Immunological methods for detection and identification of infectious disease and biological warfare agents. Clin. Diagn. Lab. Immunol. 2003; 10(4):506-13.
Authors:
Tereshkina N.E., Terekhova I.V., Syrova N.A., Devdariani Z.L., Lyashova O.Yu., Grigor'eva G.V., Lobovikova O.A., Shul’ginaI.V. Russian Research Anti-Plague Institute “Microbe”. 46, Universitetskaya St., Saratov, 410005, Russian Federation. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Ivanenko I.L., Zakharova N.B. Central Research Laboratory at the Saratov Razumovsky State Medical University. 37, Bol’shaya Sadovaya St., Saratov, 410054, Russian Federation. E-mail: lipidgormon@mail.ru
Bezrukova G.A., Spirin V.F. Saratov Research Institute of Rural Hygiene. 1A, Zarechnaya St., Saratov, 410022, Russian Federation. E-mail: niisgsar@rol.ru
Об авторах:
Терешкина Н.Е., Терехова И.В., Сырова Н.А., Девдариани З.Л., Ляшова О.Ю., Григорьева Г.В., Лобовикова О.А., Шульгина И.В. Российский научно-исследовательский противочумный институт «Микроб». Российская Федерация, 410005, Саратов, ул. Университетская, 46. E-mail: rusrapi@microbe.ru
Иваненко И.Л., Захарова Н.Б. Центральная научно-исследовательская лаборатория Саратовского государственного медицинского университета им. В.И.Разумовского. Российская Федерация, 410054, Саратов, ул. Большая Садовая, 37. E-mail: lipidgormon@mail.ru
Безрукова Г.А., Спирин В.Ф. Саратовский научно-исследовательский институт сельской гигиены. Российская Федерация, 410022, Саратов, ул. Заречная, 1А. E-mail: niisgsar@rol.ru
Поступила 06.11.12.
